Abstract
Органические примеси, адсорбированные на поверхности диоксида титана (TiO 2) можно разложить на фотокатализа при ультрафиолетовом (УФ) свете. Здесь мы опишем протокол, использующую новый TiO 2 фотокатализ локально изменять сродство клеток поверхности подложки. Для этого эксперимента, тонкий TiO 2 фильм был покрытым напылением на стекло покровное, и поверхность TiO 2 были внесены изменения с кремнийорганическим монослоя, полученного из octadecyltrichlorosilane (OTS), который ингибирует клеточную адгезию. Образец погружали в среду для культивирования клеток, и целенаправленный ультрафиолетового света облучали с восьмиугольной области. Когда нейрональные клетки линии РС12 клетки высевают на образце, клетки придерживались только на области УФ-облучении. Кроме того, мы показали, что эта поверхность модификации могут быть выполнены на месте, то есть, даже когда клетки растут на подложке. Правильное модификация поверхности необходимо внеклеточного матрикса рrotein коллаген присутствовать в среде в момент УФ-облучения. Техника, представленная здесь может потенциально быть использованы в нескольких паттерна типов клеток для построения совместного культивирования системы или произвольно манипулировать клетки под культуры.
Introduction
Полупроводниковые литографии процессы и ее производные, такие как - фотолитографии 1,2, электронно-лучевой литографии 3-6 и 7-10 микроконтакта печати - стали теперь установлено инструментом в клеточной биологии расти живые клетки в определенном положении и геометрии. Способ формирования рисунка зависит от использования микроизготовленном подложек, состоящий из микро-острове клеток разрешающей покрытия в непермиссивной фоне. Такой субстрат служит в качестве шаблона для модели клетки. Эти технологии при условии, нам новые способы для конструирования клеток и их функции в одно- и мульти-клеточном уровне, чтобы извлечь внутренние свойства клеток, а также увеличить пропускную способность на основе клеток скрининга лекарственных средств 11.
Степень-о-свободы в клеточной паттерна бы значительно увеличить, если геометрия модели шаблона могут быть изменены на месте, то есть, в то время как клетки культивируют на Surface. Обычные методы формирования рисунка не могут быть непосредственно применены здесь, так как они обрабатывают образцы в атмосфере или в вакууме. Поэтому различные новые методы модификации поверхности были предложены, которые основаны, например, на фотореакционноспособных соединений 12,13 или лазерной абляции 5,14, только чтобы назвать несколько. Предложенные методы были хорошо рассмотрены Robertus др. 15, а в последнее время Чой и др. 16 и 17 Nakanishi.
Здесь, в этой статье мы опишем новый протокол на месте модификации поверхности, которая принимает преимущество фотокаталитического разложения органических молекул на диоксид титана (TiO 2) поверхности 18,19. В этом методе, пленка TiO 2 вставляется между стеклянной подложкой и органическую пленку, который взаимодействует клетки, и органическая пленка разлагается на месте путем облучения локально ультрафиолетового (УФ)свет в интересующей области (λ <388 нм). Покажем, что новый протокол может быть использован для создания micropatterns белков внеклеточного матрикса и живых клеток обоих ex-situ и на месте. TiO 2 является биологически совместимым, химически стабильный, и оптически прозрачной, особенности, что делает его удобным ввести в экспериментам с культурой клеток. Этот протокол обеспечивает материалы на основе науки альтернативу для изменения клеточной культуры каркасов в среде культивирования клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка TiO 2 -покрытие покровного стекла
- Количество покровные использованием алмазного рисок. Это помогает не только отслеживать каждый покровные но также для того, чтобы правильно сторона образца вверх. Очистите покровные, сначала под проточной DDh 2 O, а затем путем погружения их в пираний решения (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Через 10 мин смойте покровные тщательно, 8 раз в DDh 2 O. Высушите покровные под N 2 потока.
- Установите TiO 2 цель в радио-частоты (РЧ) распыления системы. Прикрепите покровные на держатель образца распыления оборудования с использованием полиимидной лентой. Поместите держатель образца в камере напыления. Эвакуировать камеру, пока давление не достигнет 2,0 × 10 -4 Па.
- Представьте Ar газа в камеру и установить давление осаждения до 4,0 мТорр. Сохраняя затвор закрыт, постепенно увеличиватьВЧ-мощность 70 Вт на
- Открыть затвор, и распыление в течение 15 мин, чтобы получить пленку толщиной 120-150 нм (рис 1: Шаг A). Скорость роста пленки должна быть получена для каждой машины.
2. Поверхность покрытия с сотового нем пленку
- Гидрофилизации поверхности TiO 2 путем обработки образца с O 2 плазме после инструкциям производителя плазменного реактора. Мы рассматриваем образец в течение 5 мин при 200 Вт с O 2 потока 100 SCCM. Погрузитесь образца в DDh 2 O и убедитесь, что поверхность superhydrophilic. Высушите поверхность полностью под N 2 потока.
- Подготовьте 1 мМ octadecyltrichlorosilane решение (OTS), добавив 39,6 мкл OTS 100 мл толуола. Погружают образец в растворе в течение 1 ч при комнатной температуре. Провести этот шаг внутри N 2 с наполнением перчатками (рис 1: Шаг B).
- Для удаления молекул physisorbed, sonicatэлектронной образец в толуоле, ацетоне, этаноле и DDH 2 O в течение 5 мин каждый, в указанном порядке. Промыть образец четыре раза в свежем DDh 2 O и высушить поверхность под N 2 потока. Поверхность должна быть гидрофобной с контактным углом 100-110 °.
3. Экс-Ситу поверхности Создание массивов
- Работа в капюшоне ламинарного потока, сделать несколько царапин с алмазной Чертилка на поверхности. Знаки помочь в отслеживании обработанных областей, а также привлечения внимания микроскопы в. Стерилизацию ОТС покрытием TiO 2 путем погружения образца в 70% этаноле в течение 5 мин. Затем промыть образец в два раза в стерилизованной DDh 2 O.
- Поместите образец в 35-мм блюдо и добавить 2 мл среды роста РС12 (см Шаг 4.2). Инкубировать в течение более 3 часов в СО 2 инкубатор (37 ° C). Эта процедура предназначена, чтобы поглотить сывороточные альбумины на поверхность. Адсорбированных альбумины ингибируют последующее адсорбции другой защмодули и клетки (Рисунок 1: Шаг C).
- Ожидая, настроить перевернутой флуоресцентного микроскопа.
- Включите дуговой лампы, вставьте куб УФ-фильтр и установите объектив с 20х.
- Измерьте интенсивность света I (Вт см -2), используя измеритель УФ-интенсивность, и рассчитать время облучения т (в секундах) для дозы D (J в см -2), как: T = d / I.
Например, для облучения в дозе 200 Дж см -2 с помощью источника света 600 МВт см -2, 333 сек облучения требуется. - Используйте микрометра и закройте полевую диафрагму, чтобы установить размер области, которая будет облучаться, например, 200 мкм.
- После 3 ч инкубации дополнить среду с 200 мкл 3,0 мг мл -1 типа IV коллагена (Col-IV; конечной концентрации 300 мкг мл -1).
- Трансфер 35-мм блюдо к столику микроскопа. Найти скретч мАрканзас, сфокусировать микроскоп на поверхности образца, и облучение УФ-светом в дозе 200 Дж см -2 (рис 1: Стадия D). Площадь УФ-облучения может быть изменена либо путем регулировки отверстия полевой диафрагмы или заменой полевой диафрагмы с металлической маской арбитражного геометрии.
- Замените среду с свежей средой роста (без Col-IV), и поместить образец назад в инкубаторе.
4. Культура клеток
- Регулярное культуры клеток РС12 осуществляется на коллаген-покрытием пластиковую чашку.
- Для пальто 60-мм ткани блюдо культуры с Col-IV, прежде смачивать поверхность с DDh 2 O и аспирации все DDh 2 O.
- Подготовьте 300 мкг мл -1 Col-IV путем разбавления оригинальное решение (3 мг мл -1) 10x с DDH 2 O.
- Добавить 200 мкл 300 мкг мл -1 Col-IV на 60-мм блюдо. Пусть решение распространить через поверхность.
- Сухой тон блюдо в капюшоне ламинарного потока в течение примерно 1 часа.
- Промыть поверхность дважды 4 мл фосфатно-солевом буфере Дульбекко (D-PBS). Когда не сразу, используя блюдо, покрытое, промыть блюдо один раз 4 мл DDH 2 O. После аспирации DDh 2 O, хранить блюдо в инкубаторе. Старайтесь не держать его хранить в течение более чем двух недель.
- PC12 клетки выращивают в питательной среде, состоящей из: среда (низкий уровень глюкозы) Игла в модификации Игла + 10% фетальной бычьей сыворотки + 5% лошадиной сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина решение. Инкубируйте клетки в инкубаторе СО2 (37 ° С, 5% СО 2), и заменить половину среды через день. Прохождение клетки, прежде чем они достигают слияния.
- Аспирируйте ростовую среду, и добавляют 2 мл PBS + (D-PBS + 10 мг мл -1 бычий сывороточный альбумин (БСА) + 10 мМ ЭДТА), предварительно нагретую до 37 ° С. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С. Аккуратно нажмите блюдо, чтобы отсоединить все сезаполняет.
- Собирают клетки в 15 мл коническую пробирку. Промыть тарелку с 3 мл свежего D-PBS, предварительно нагретой до 37 ° С.
- Центрифуга трубки на 150 х г в течение 4 мин.
- Аспирируйте супернатант и добавить 1 мл ростовой среды.
- Для повседневной культуры, разделить клеткам 1: 3 до 1: 5.
- Для пластины ячеек на УФ-модифицированный ОТС / TiO 2 образца, рассчитывать плотность клеток и добавить 3,0 × 10 5 клеток в 35-мм блюдо (рис 1: стади E). Инкубируйте блюдо в увлажненном инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2) в течение 1-2 дней. Оба наивным и фактор роста нервов (NGF) -differentiated PC12 клетки могут быть использованы для формирования паттерна экспериментов. Для NGF дифференциации, 100 нг мл -1 7S-NGF добавляют к росту среднего за несколько дней до посева клеток на образец. NGF-дифференцировки, кажется, увеличивает adhesibility из клеток РС12 и делает управление проще, особенно в на месте узора еxperiments.
5. В месте поверхности Создание массивов
- Через 1-2 дней культуры на месте экс-модифицированной поверхности, подтверждают, что клетки есть и растет только от региона УФ-облученных. Настройка микроскопа, как описано в шаге 3.4.
- Передача образца на новый 35-мм чашки для культивирования тканей, содержащий среду для роста, 100 нг мл -1 ФРН (в случае использования NGF-дифференцированных клетках) и 100 мкг мл -1 Col-IV.
- Поместите блюдо на столике микроскопа. Найти соответствующий позиции, и облучение УФ-светом в дозе 200 Дж см -2 (рис 1: Шаг F, G). Вновь созданный разрешительный область обозначается звездочкой на рисунке 1: Шаг Г.
- Попробуйте завершить обработку одного образца в течение 30 мин. После облучения, перенести образец обратно в среде без Col-IV.
- Будьте крайне осторожны при проведении блюдо кубltured клетки и передачи образца от блюдо блюдо, чтобы предотвратить снятие из узорчатых клеток.
Рисунок 1. Схематическое изображение общего процесса. Подробности в тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2А показывает поперечное сечение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изображение TiO 2 пленки распылением осаждают. Из наблюдений, толщина пленки была оценена приблизительно в 150 нм. Заметное здесь плоскостность осажденного TiO 2 фильма. Дальнейший анализ с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) показали, что среднеквадратическое (RMS) шероховатость поверхности составляла 0,2 нм (рис 2B).
Когда поверхность TiO 2 изменяется с ОТС, а затем погружают в содержащей сыворотку среде роста, сывороточные альбумины адсорбироваться на поверхности OTS и ингибируют адсорбцию последующее белка и клеточную адгезию 18,20. Впоследствии, когда сосредоточены УФ свет излучается на поверхность, активные формы кислорода (АФК) генерируются на поверхности TiO 2 21, который разложить OTS самоорганизующуюся монослой (SAM) на TiO 2 и снять SAM и адсорбированный Albumins с поверхности. Это делает облученной области гидрофильные и разрешительная для адсорбции белка. Прямое взаимодействие с АФК альбуминов может происходить одновременно, но разложение OTS должно быть основной реакцией, так как ОТС Сэм взаимодействия альбумина и TiO 2. В текущем протоколе, внеклеточный белок матрикса Кол-IV дополняется в среде при облучении, и полковник-IV адсорбирует преимущественно в области УФ-облученных где альбумины удаляются (рис 3А). Другие белки, такие как фибронектин можно рисунком в том же протоколе (фиг.3В), что указывает на универсальность этого подхода.
Сывороточные альбумины, которые также присутствуют в среде в момент УФ-облучения, также должны адсорбироваться на облучаемой области, но результаты показывают, что сумма не выше, чем на интактной OTS SAM. Чтобы подтвердить это, мы исследовали разницу в сродстве BSAУФ-облучении и неповрежденных OTS SAM с помощью флуоресцентной микроскопии из красителя помечены BSA. Для этого эксперимента, сосредоточены ультрафиолетового света облучали в OTS / TiO 2 образца, который не был погружен в среде, содержащей сыворотку, и затем образец погружают в раствор fluorescein- меченого БСА. 3С показывает адсорбционную структуру БСА. Светлое флуоресценции в интактной ОТС SAM области, чем области УФ-облучении указывает, что количество адсорбированного BSA выше в интактной области. Механизм избирательной адсорбции может быть понято по разнице в гидрофобности двух областей. Количество BSA адсорбции, как известно, выше на гидрофобных поверхностях 22 и интактный ОТС САМ область более гидрофобными, чем область УФ-облучении 18.
Структура Col-IV, таким образом, создается служит каркаса для клеточной адгезии. 4А показывает NGF-дифференцированные РС12 клетки, культивируемые на п экс-Ситу рисунком регион в течение 1 дня. Далее, УФ-свет облучали в сторону micropattern, и клетки культивировали в течение еще 5 дней. Как показано на фиг.4В-D, клетки далее мигрировали к модифицированному области, указывая, что клетки Сродство поверхности успешно модифицированы среде культивирования клеток.
Рисунок 2. Характеристика пленки TiO 2. (А) поперечного сечения СЭМ-изображение образца. (B), АСМ изображение поверхности TiO 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
OAD / 53045 / 53045fig3highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 3. Сайт-Селективная адсорбция белков на область УФ-облучении. (А) меченого флуоресцеином коллагена (200 мкм восьмиугольной образец) и (Б) родамин-меченого фибронектин (100 мкм квадратный узор). Предпочтительной адсорбции этих белков зависит от отсутствия альбуминов, которые блокируют адсорбции белка (C). Отметим, что в (С), OTS САМ не был погружен в среде, содержащей сыворотку перед применением меченного флуоресцеином BSA. Масштабные бары, 100 мкм (А) и 50 мкм (B, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Экс-Ситу и на месте рисунка из клеток РС12. (А) Адгезия клеток РС12 на качестве области экс-месте с рисунком. Пунктирная восьмиугольник указывает сайт в месте УФ-облучения. (B - D) Миграция клеток РС12 с на месте рисунком области, на 2 дня (В), 3 дня (с) и 5 дней (D) после облучения. Масштаб бар, 200 мкм. Модифицированный с разрешения Ямамото и др. 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашем протоколе, TiO 2, фильм был сформирован РФ-магнетронного распыления. Мы выступаем этот метод осаждения, так как это позволяет нам воспроизводимо приготовить фотокаталитический TiO 2 фильма с суб-нм шероховатости. Хотя НАПЫЛЕНИЕМ процессы осаждения знакомы материалов ученых и инженеров-электронщиков, он не может быть вполне доступны биологов. В этом случае, спин-покрытием TiO 2 фильм будет альтернативный выбор 23. В этом методе, TiO 2 наночастиц растворяют в растворителе, распространено на поверхности подложки под действием центробежной силы. Специальное оборудование требуется спин нанесения покрытий, что значительно дешевле, чем распыления системы. Мы использовали для себя спин-покрытием TiO 2 наночастиц пленку и подтвердили, что пленка также может быть использован для выполнения аналогичных экспериментов (данные не показаны). Поверхность пленки TiO 2 спин-покрытием сравнительно грубой со среднеквадратичным шероховатости несколько десятковх нм, и это требует некоторой практики, чтобы равномерно покрыть субстрат воспроизводимо особенно, когда несколько спин покрытия необходимы для получения толстых пленок. Тем не менее, метод может быть первым кандидатом для биологов.
До сих пор мы использовали этот метод в формировании паттерна не только РС12 клетки, но также поджелудочной железы человека линии клеток рака AsPC-1 и первичные нейроны, полученные из эмбриональных крыс гиппокампе 19. Adhesibility из AsPC-1 клеток намного сильнее, чем у клеток PC12 или нейронов гиппокампа и добавок молекул леса, такие как коллаген, не требуются в их рисунка. Мы еще отметить, что неспецифической адгезии клеток к необлученном регионе наблюдается иногда, что, вероятно, из-за дефектов в OTS SAM.
Паттерна первичные нейроны были гораздо более сложным, так как их adhesibility слаб. В самом деле, важный шаг для текущего процесса лежит в правильной адсорбциииз леса молекулы. Простой добавки коллагена или ламинина было недостаточно, чтобы увеличить сродство модифицированного области для нейронов. Обычные культуры нейронов гиппокампа зависит от положительно заряженных пептида поли-лизин для покрытия поверхности покровного стекла 24. В этом контексте, вызывая избирательное соединение поли-лизина в области УФ-облученной желательно, но было невозможно, так как поли-лизин, адсорбированных на интактной ОТС SAM региона. Мы попытались другие поверхностные покрытия, такие как полиэтиленгликоль-силана МПС и перфтор-силан ЗРК, чтобы найти, что ни один из них не было противообрастающих, чтобы поли-лизина. Чтобы решить эту проблему, мы совсем недавно показали, что молекула сшивание можно использовать, чтобы вызвать активное адсорбции молекул лесов на область УФ-облучении 19. Такой выбор молекул лесов и оптимизации его концентрации должны быть выполнены для каждого эксперимента.
УФ доза облученияТакже должны быть оптимизированы, так как она сильно влияет на величину адсорбции белка. В нашем случае, измерение интенсивности флуоресценции была использована для получения оптимального УФ дозу 200 Дж см -2 18. Значение может изменяться в зависимости от экспериментальных параметров, таких как толщина и кристалличности пленки TiO 2.
Среди различных методов на месте модификации поверхности, разработанных до сих пор, главным преимуществом данного способа является то, что она не требует органического синтеза специализированных молекул для обработки поверхности. Метод, представленный здесь, в принципе, совместимы с органическими пленок, полученных из обширной библиотеки коммерчески доступных полимеров, пептидов и предшественников SAM. Также благоприятным в том смысле, что процесс поверхностной модификации могут быть выполнены с использованием обычного лабораторного оборудования, такого как широкого поля флуоресцентный микроскоп оснащен дуговой ртутной лампы, как показано здесь. С помощьюУФ лазера в качестве источника света, субклеточных разрешение до ~ 3 мкм может быть достигнута (данные не показаны).
Некоторые ограничения текущего метода включают необратимость модификации поверхности, необходимо для дополнения молекул строительные леса в среде, и поколение ROS. Процесс, описанный здесь, относится к неразрешающие в разрешительной преобразования поверхности, но превращение является односторонним и не может быть отменено. Для экспериментов, которые требуют преобразования разворота клеточной близости, другие методы 15 должны быть рассмотрены. Кроме того, наш метод требует молекул строительных лесов, такие как коллаген, чтобы быть ванны устанавливают на клеточной культуральной среды. Поскольку население заранее рисунком клеток неизбежно будут подвергаться молекул, это может ограничить применение некоторое этом процессе. Photocatalyzed поколение ROS, такие как гидроксильные радикалы, в области УФ-облученных могут быть токсичными для соседних ячеек, но, по крайней мере, этот эффект ненаблюдается в наших экспериментах. Даже если это становится заметным для других приложений, эта проблема должна быть решена путем дополнения поглотители кислорода в ростовой среде. Так, поглощающих кислород, молекулы не будет расположен между TiO 2 и непермиссивной молекул на его поверхности, они должны устранить чрезмерное ROS, не затрагивая процесс формирования рисунка кинетики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
