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Immunology and Infection

दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 के साथ Murine एपिडर्मिस के पूर्व vivo संक्रमण

Published: August 24, 2015 doi: 10.3791/53046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Center for Biochemistry, University of Cologne, 2Department of Dermatology, University of Cologne

Abstract

अपने मानव मेजबान प्रवेश करने के लिए, दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 (एचएसवी -1) श्लैष्मिक सतहों, त्वचा, या कॉर्निया की बाधा को दूर करना होगा। एचएसवी -1 लक्ष्यों प्रारंभिक प्रवेश के दौरान केरेटिनकोशिकाओं और न्यूरॉन्स की अव्यक्त संक्रमण द्वारा पीछा किया जाता है, जो उपकला में एक प्राथमिक संक्रमण स्थापित करता है। पुनर्सक्रियन के बाद, वायरस त्वचा पुटिकाओं या श्लैष्मिक अल्सर के रूप में दिखाई देते हैं कि mucocutaneous स्थलों पर स्पष्ट हो सकता है। एचएसवी -1 त्वचा या म्यूकोसा पर हमला और पहुँचता है कैसे अपने रिसेप्टर्स खराब समझा जाता है। सेलुलर स्तर पर एपिडर्मल ऊतक में एचएसवी -1 के आक्रमण के मार्ग की जांच करने के लिए, हम त्वचा में प्राथमिक और आवर्तक संक्रमण की साइट का प्रतिनिधित्व करता है जो murine एपिडर्मिस के एक पूर्व vivo संक्रमण मॉडल की स्थापना की। परख murine त्वचा की तैयारी भी शामिल है। एपिडर्मिस Dispase द्वितीय उपचार द्वारा डर्मिस से अलग किया जाता है। वायरस युक्त मध्यम पर एपिडर्मल शीट चल के बाद, ऊतक ठीक हो गई है और संक्रमण के विभिन्न समय postinfection पर देखे जा सकते हैंएचएसवी -1 तत्काल जल्दी प्रोटीन ICP0 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ संक्रमित कोशिकाओं धुंधला हो जाना। ICP0 व्यक्त कोशिकाओं 1.5 घंटे postinfection पर पहले से ही बेसल keratinocyte परत में मनाया जा सकता है। अब संक्रमण समय के साथ, संक्रमित कोशिकाओं के संक्रमण बेसल केरेटिनकोशिकाओं तक ही सीमित है, लेकिन वायरस के ऊतकों में अन्य परतों को फैलाता नहीं है, यह दर्शाता है suprabasal परतों में पता चला रहे हैं। विभिन्न माउस मॉडल की एपिडर्मल शीट का उपयोग करना, संक्रमण प्रोटोकॉल के ऊतकों में एचएसवी -1 आक्रमण करने के लिए योगदान है कि सेलुलर घटकों की भागीदारी का निर्धारण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, परख प्रारंभिक प्रवेश कदम के साथ हस्तक्षेप है कि ऊतक में अवरोधकों, सेल करने वाली सेल प्रसार और वायरस के उत्पादन के परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है। यहाँ, हम विस्तार में पूर्व vivo संक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन है और nectin-1- या HVEM की कमी चूहों का उपयोग हमारे परिणाम प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

हरपीज सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) जीवन के लिए खतरा संक्रमण के लिए हल्के सीधी mucocutaneous घावों से मानव में रोगों की एक सीमा का कारण बन सकता है। एचएसवी टाइप 1 (एचएसवी -1) मुख्यतः अधिक होने की संभावना यौन संक्रमण का कारण बनता है 1 एचएसवी टाइप 2 (एचएसवी -2), जबकि orofacial संक्रमण और इन्सेफेलाइटिस के साथ जुड़ा हुआ है। एचएसवी, संस्कृति में कोशिकाओं में प्रवेश करती संक्रमण शुरू की और वायरल संतान पैदा करता है कि कैसे समझ में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, वहीं हम सेलुलर स्तर 2 में ऊतकों में वायरल आक्रमण मार्ग (एस) के बारे में बहुत कम जानते हैं। एचएसवी त्वचा या श्लैष्मिक संक्रमण, चूहों की पढ़ाई के लिए, खरगोश और गिनी सूअरों पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। त्वचा संक्रमण अंतर्त्वचीय इंजेक्शन द्वारा या वायरस की उपस्थिति में त्वचा scratching द्वारा स्थापित किया गया था, और रोग विकास वायरस उत्पादन के साथ सहसंबद्ध था। इन विधियों रोग रोगजनन के विभिन्न पहलुओं को समझने में मदद की है, और एंटीवायरल दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Tissu पर एचएसवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिएई स्तर, organotypic मानव त्वचा मॉडल लागू किया गया है। संक्रमण की दर इन बेड़ा संस्कृतियों में प्रतिबंधित है के रूप में, संक्रमण, वायरल प्रसार की जांच के अध्ययन और एंटीवायरल घटकों के प्रभाव का केवल एक सीमित संख्या 3-6 प्रकाशित किया गया है।

बरकरार उपकला में एचएसवी -1 संक्रमण के दौरान एक भूमिका निभाते हैं कि सेलुलर निर्धारकों को चिह्नित करने के लिए, हम murine एपिडर्मिस 7 के पूर्व vivo संक्रमण के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की। त्वचा नवजात शिशुओं से या वयस्क चूहों की पूंछ से तैयार किया गया था। एचएसवी -1 वायरस युक्त मध्यम में डूबे हुए थे, जो पूरी त्वचा के नमूने, संक्रमित नहीं कर सका, हम Dispase द्वितीय उपचार द्वारा डर्मिस से एपिडर्मिस अलग कर दिया। वायरस युक्त मध्यम पर एपिडर्मल चादरों की अस्थायी बाद, संक्रमित कोशिकाओं विभिन्न समय postinfection (पीआई) 7 पर एपिडर्मल बेसल परत में देखे जा सकते हैं। वायरल प्रतिकृति एक करने से पहले व्यक्ति की कोशिकाओं में संक्रमण की दीक्षा कल्पना करने के लिएएन डी वायरस उत्पादन, हम एचएसवी -1 संक्रमण के दौरान व्यक्त की पहली प्रोटीन में से एक है जो संक्रमित कोशिका प्रोटीन 0 (ICP0), के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग। ICP0 के सेलुलर स्थानीयकरण जल्दी संक्रमण के दौरान अलग चरणों से होकर गुजरता है। ICP0 वायरल जीन अभिव्यक्ति का एक प्रारंभिक चरण के दौरान परमाणु foci में मौजूद है, वहीं कोशिका द्रव्य को ICP0 की पुनर्स्थानीकरण संक्रमण 8 के बाद में एक चरण में इंगित करता है।

हम संक्रमण के दौरान विभिन्न सेलुलर कारकों की संभावित भूमिका का परीक्षण करने के लिए विभिन्न माउस मॉडल से एपिडर्मल चादरों की पूर्व vivo संक्रमण परख के लिए इस्तेमाल किया। Actin गतिशीलता का एक प्रमुख नियामक के रूप में Rac1 के प्रभाव को संबोधित करने के लिए, हम Rac1 9 जीन की एक keratinocyte विशेष विलोपन के साथ चूहों के एपिडर्मिस संक्रमित। यह मॉडल एपिडर्मल keratinocyte परतों में एचएसवी -1 संक्रमण की दक्षता पर कमी Rac1 के परिणामों का अध्ययन करने की अनुमति दी। फिर से नियंत्रण littermates के संक्रमित एपिडर्मिस की तुलनाRac1 के अभाव एपिडर्मिस 7 के बेसल परत में संक्रमण की दीक्षा पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा यह दर्शाता है कि कोई महत्वपूर्ण अंतर vealed। आगे माउस मॉडल का उपयोग हमें सेलुलर रिसेप्टर्स एपिडर्मिस में प्रवेश के लिए मध्यस्थता जो को संबोधित करने की अनुमति दी। एचएसवी -1 के साथ nectin-1- या HVEM की कमी चूहों से या तो एपिडर्मल चादरों को संक्रमित ऊतक में प्रारंभिक वायरल प्रविष्टि जोरदार nectin-1 से 10 की उपस्थिति पर निर्भर करता है कि पता चला। इसके अलावा, हमारे परिणाम HVEM भी nectin-1 10 से कम कुशलता हालांकि, murine एपिडर्मिस में रिसेप्टर के रूप में सेवा कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है।

एपिडर्मल परतों में संक्रमित कोशिकाओं के स्थानिक वितरण को संबोधित करने के लिए, हम ऊतक वर्गों और एपिडर्मल पूरे mounts (चित्रा 1) में ICP0 अभिव्यक्ति कल्पना। पूरी त्वचा की cryosections में, कोई ICP0 व्यक्त कोशिकाओं (चित्रा 1) का पता चला रहे हैं। इसके विपरीत, एपिडर्मल चादरों की cryosections साइटोप्लास्मिक प्रदर्शितपहले से ही 3 घंटे गड़बड़ी (चित्रा 1) में बेसल परत में ICP0 अभिव्यक्ति। बाद में कई बार, वायरल देखे जा सकते हैं परतों suprabasal को फैलने। बेसल परत में संक्रमित कोशिकाओं के स्थानिक वितरण आसानी से एपिडर्मल पूरे mounts (चित्रा 1) में किया जा सकता है। एचएसवी -1 100 pfu / सेल में साथ संक्रमण पर, interfollicular एपिडर्मिस में बेसल केरेटिनकोशिकाओं का लगभग 50% सबसे संक्रमित कोशिकाओं परमाणु ICP0 का इजहार इस समय बिंदु पर 1.5 घंटे गड़बड़ी पर ICP0 अभिव्यक्ति दिखा। जल्दी जीन अभिव्यक्ति के बाद के चरण का संकेत कोशिका द्रव्य को ICP0 की पुनर्स्थानीकरण 3 घंटा गड़बड़ी (चित्रा 1) में लगभग सभी कोशिकाओं में मौजूद है। पूर्व vivo एचएसवी -1 संक्रमण पर संक्रमित कोशिकाओं visualizing के इन साधनों अवरोधकों की या ऊतक में वायरल प्रविष्टि और प्रसार पर / नष्ट कर दिया उत्परिवर्तित सेलुलर घटकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली परख प्रदान करते हैं।

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Protocol

नैतिकता कथन।

बलिदान कर जानवरों से एपिडर्मल चादरों की तैयारी Landesamt फर प्रकृति, Umwelt और Verbraucherschutz, Northrhine वेस्टफेलिया (जर्मनी) की गाइड की सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किया जाता है। अध्ययन LANUV NRW (संख्या 8.84-02.05.20.13.018) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

उपकरण और संस्कृति मीडिया के 1. तैयारी

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / उच्च ग्लूकोज glutamine dipeptide, 10% एफसीएस, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन युक्त, और / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम (बाद में "DMEM" के रूप में करने के लिए कहा गया है) में एपिडर्मल शीट खेती।
  2. एपिडर्मल चादरों की तैयारी के लिए, ध्यान से गरम किया पीबीएस (अप करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस) में Dispase द्वितीय पाउडर (5 मिलीग्राम / एमएल) के भंग। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और उपचार के लिए सीधे इस्तेमाल करते हैं।
  3. एपिडर्मल पूरी की तैयारी 13 mounts के लिए, शौकीन अवरुद्ध तैयार0.5% दूध पाउडर, ठंडे पानी मछली त्वचा और टीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 से 0.25% जिलेटिन के साथ इंजी। पदार्थ एक घूर्णन मिक्सर पर आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए मिश्रण incubating द्वारा भंग करने की अनुमति दें। इसके अलावा धोने बफर के रूप में पीबीएस में बीच 20 0.2% तैयार करते हैं। निर्धारण के लिए, 3.4% और पीबीएस में 4% formaldehyde तैयार करते हैं।
  4. Cryosections के immunostaining के लिए, 5% सामान्य बकरी सीरम और 0.2% पीबीएस में बीच 20 के साथ बफर अवरुद्ध तैयार करते हैं। निर्धारण के लिए, पीबीएस में 0.5% formaldehyde तैयार करते हैं।

Murine त्वचा से एपिडर्मल शीट्स 2. तैयारी

  1. संक्रमण के अध्ययन के लिए नवजात शिशु को वापस त्वचा से एपिडर्मिस की तैयारी
    1. एक विच्छेदन डिश में एक decapitated माउस (1 से 3 दिनों के जन्म के बाद) प्लेस और हाथ-पाँव काट दिया और धड़ के करीब पूंछ पूरा धड़ से त्वचा के कुशल हटाने की अनुमति है। हाथ पैरों को हटाने के दौरान, व्यास में संभव के रूप में छोटे कटौती रखने के लिए प्रयास करें।
    2. घुमावदार ठीक संदंश एक साथ धड़ को ठीक करेंधीरे धड़ से त्वचा को अलग करने के पीछे के साथ दुम कपाल से त्वचा के नीचे कुंद टिप कैंची को स्थानांतरित एन डी। पीछे के साथ त्वचा भट्ठा।
    3. FACS विश्लेषण, केरेटिनकोशिकाओं या शाही सेना की तैयारी के अलगाव के लिए, धड़ बंद पुश करने के लिए ऊतक और कुंद टिप कैंची ठीक करने के लिए संदंश का उपयोग धड़ से पूरा त्वचा छील। Cryosections या पूरे mounts की तैयारी के लिए वापस त्वचा के ही टुकड़े ले।
    4. लगभग 10 x 10 मिमी के 1-2 टुकड़ों में एक छुरी के साथ वापस त्वचा जल्द। ~ 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में टुकड़े डाल दिया। चमड़े का पक्ष नीचे का सामना करना पड़ता है कि सुनिश्चित करें।
    5. 1.5 मिलीलीटर Dispase द्वितीय (5 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस) द्वारा पीबीएस बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर / 30 (पूरे mounts के लिए) 37 डिग्री सेल्सियस पर मिनट या ओ के लिए या तो एन सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। धीरे एपिडर्मिस उठाने के लिए अंतर्निहित डर्मिस और अन्य संदंश ठीक करने के लिए एक संदंश का उपयोग कर एक अक्षुण्ण पत्रक के रूप में एपिडर्मिस को हटा दें। इस कदम ईएएस बनाने के लिए एक दूरबीन का उपयोग करेंवाई। नीचे की ओर अपने बेसल पक्ष के साथ DMEM में एपिडर्मल चादर स्थानांतरण। संक्रमण के प्रयोगों के लिए तुरंत शीट का उपयोग करें।
      नोट: मुख्य रूप से FACS विश्लेषण, केरेटिनकोशिकाओं या शाही सेना की तैयारी के अलगाव के लिए नवजात शिशु की त्वचा से एपिडर्मिस की तैयारी का प्रयोग करें। क्योंकि इसकी कमजोरी की, cryosections या पूरे mounts के लिए संक्रमित चादरों की तैयारी कम उपयुक्त है।
  2. संक्रमण के अध्ययन के लिए वयस्क पूंछ त्वचा से एपिडर्मिस की तैयारी
    1. ग्रीवा अव्यवस्था से 1-3 महीने की उम्र में चूहों euthanize। पीठ पर लंबे एम्बेडेड बालों के रोम बरकरार एपिडर्मल चादरों की जुदाई में बाधा के बाद के बजाय वापस त्वचा की पूंछ लो। बलिदान कर चूहों से पूंछ काट दिया और एक छुरी के साथ लंबाई में यह भट्ठा।
    2. हड्डी से त्वचा छील और के बारे में 5 एक्स 5 मिमी टुकड़ों में एक छुरी के साथ इसे काट लें। एक अच्छी तरह से में 4 टुकड़े करने के लिए रखो और 2.1.5 के तहत वर्णित के रूप में Dispase द्वितीय में ऊष्मायन के साथ आगे बढ़ना
      नोट: उपयोग वयस्क ताईएल त्वचा cryosections या पूरे आरोह को तैयार करने के लिए। वैकल्पिक रूप से तत्काल उपयोग करने के लिए, पूंछ संग्रहीत या महत्वपूर्ण संक्रमण दक्षता को खोने के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 24 घंटे के लिए ले जाया जा सकता है। पूंछ 48 घंटा तक रखा जाता है, तो एपिडर्मल शीट शायद ही एचएसवी -1 से संक्रमित हो सकता है।
  3. FACS विश्लेषण के लिए एपिडर्मिस की हदबंदी
    नोट: FACS विश्लेषण द्वारा सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच कोशिका की सतह और ब्याज की प्रोटीन नुकसान नहीं है कि उचित सेल हदबंदी तकनीक की आवश्यकता है।
    1. आरटी पर 15 मिनट के लिए 1.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से पुनः संयोजक ट्रिप्सिन आधारित सेल हदबंदी समाधान पर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बेसल पक्ष के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में नवजात एपिडर्मल शीट सेते हैं।
    2. 3 मिलीलीटर DMEM जोड़कर ऊष्मायन बंद करो। केरेटिनकोशिकाओं भंग हो तो यह है कि धीरे 6 अच्छी तरह से थाली में एपिडर्मिस स्थानांतरित करने के लिए एक घुमावदार ठीक संदंश का उपयोग करके केरेटिनकोशिकाओं अलग कर देना। सेल निलंबन लीजिए और इस कदम 3 बार दोहराएँहमेशा ताजा DMEM का उपयोग कर।
      नोट: इस हदबंदी प्रक्रिया केरेटिनकोशिकाओं की सतह पर nectin -1 का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।
    3. वैकल्पिक रूप से, आरटी पर 15 मिनट और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एंजाइम से मुक्त सेल हदबंदी समाधान पर एपिडर्मल शीट (सीडीएस) सेते हैं। धीरे ऊपर और नीचे सीडीएस pipetting द्वारा केरेटिनकोशिकाओं बाहर निकलवाने के लिए आरटी पर एक और 15 मिनट सेते हैं।
    4. सेल निलंबन लीजिए और ताजा DMEM का उपयोग कर निस्तब्धता चरण 3 बार दोहराएँ।
      नोट: इस हदबंदी HVEM की सतह अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए उपयुक्त है। सीडीएस समाधान का नुकसान कम कोशिकाओं पुनः संयोजक ट्रिप्सिन आधारित सेल हदबंदी समाधान के साथ की तुलना में अलग हैं कि है। इसके अलावा पुनः संयोजक ट्रिप्सिन आधारित सेल हदबंदी समाधान के साथ संक्रमित एपिडर्मल चादरों की हदबंदी के बाद अभिव्यक्ति, ऐसे ICP0 अभिव्यक्ति के रूप में परमाणु या cytoplasmic अभिव्यक्ति FACS द्वारा विश्लेषण किया जा सकता सतह के लिए।
  4. एपिडर्मिस की हदबंदी केरेटिनकोशिकाओं या पूर्व अलग करने के लिएपथ आरएनए
    1. 1.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से पुनः संयोजक ट्रिप्सिन आधारित सेल हदबंदी समाधान होता है जो पकवान के नीचे की ओर बेसल पक्ष के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में नवजात एपिडर्मल शीट रखो। आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। 3 मिलीलीटर DMEM जोड़ें और धीरे डिश में एपिडर्मिस स्थानांतरित करने के लिए एक घुमावदार ठीक संदंश का उपयोग करके केरेटिनकोशिकाओं अलग कर देना।
    2. सेल निलंबन लीजिए और ताजा DMEM का उपयोग करते हुए इस कदम को 3 बार दोहराएँ। शाही सेना या संस्कृति प्राथमिक murine केरेटिनकोशिकाओं को निकालने के लिए इस सेल निलंबन का प्रयोग करें।

एचएसवी -1 के साथ एपिडर्मल शीट्स 3. संक्रमण

  1. 500 μl DMEM से कम नहीं में एचएसवी -1 WT तनाव 17 11 के एक समाधान तैयार है और एपिडर्मल चादरों जो चल रहे हैं पर समाधान वायरस से मध्यम जगह। इस समय बिंदु समय 0 से 12 के रूप में परिभाषित किया गया है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में एक एपिडर्मल चादर के संक्रमण को पूरा करें। वायरस अनुमापांक की गणना अनुमानित संख्या के आधार पर किया जाता हैएपिडर्मल पत्र के अनुसार बेसल परत में कोशिकाओं के (लगभग 5 एक्स 5 मिमी प्रति पत्रक 2 x 10 5 कोशिकाओं)।
  2. एचएसवी -1 पर लगभग 100 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) / सेल के साथ संक्रमित और 1 घंटे गड़बड़ी पर DMEM द्वारा वायरस युक्त मध्यम जगह
    नोट: नवजात शिशु की त्वचा से एपिडर्मल शीट के मामले में, चादरें ऊष्मायन के दौरान अलग कर देना करने के लिए शुरू कि मन में रखो।

संक्रमित कोशिकाओं के 4. विज़ुअलाइज़ेशन

  1. एपिडर्मल पूरे mounts 13
    1. 3.4% formaldehyde या तो 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन पर 2 घंटे के लिए साथ एपिडर्मल शीट को ठीक करें। पीबीएस के साथ दो बार धो लें और 0.5% दूध पाउडर, ठंडे पानी मछली त्वचा और आर टी 14 पर 1 घंटे के लिए टीबीएस में 0.5% ट्राइटन X-100 से 0.25% जिलेटिन के साथ ब्लॉक।
    2. 15 आरटी पर अवरुद्ध बफर में 1:60 पतला माउस विरोधी ICP0 (मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 11060) के साथ चादरें हे / एन सेते हैं। मध्यवर्ती रेशा नेटवर्क कल्पना करने के लिए खरगोश पॉलीक्लोनल के साथ एक साथ सेते विरोधीमाउस केरातिन 14 (100 एनजी / एमएल)।
    3. आरटी पर 4 घंटे के दौरान पीबीएस 0.2% के बीच 20 के साथ 4-5 बार धोएं। हे / एन के साथ AF488 संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी (1 माइक्रोग्राम / एमएल), AF555 संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी (1 माइक्रोग्राम / एमएल), और DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (100 एनजी सेते आरटी पर अवरुद्ध बफर में / एमएल)।
    4. आरटी पर 4 घंटे के लिए पीबीएस 0.2% के बीच 20 से धो लें। एक नमूना स्लाइड के शीर्ष पर उनके बेसल पक्ष के साथ माउंट एपिडर्मल चादरें, फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम में एम्बेड और coverslips के साथ कवर किया।
  2. एपिडर्मल cryosections
    1. एडल्ट एपिडर्मल शीट आरटी पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% formaldehyde में तय की और पीबीएस के साथ 2 बार धोया गया। ऊतक में एम्बेड तय शीट तरल नाइट्रोजन में मध्यम और फ्रीज ठंड। एक cryomicrotome साथ 8-10 माइक्रोन वर्गों में कटौती।
    2. , आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% formaldehyde के साथ फिर से वर्गों फिक्स पीबीएस, आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% सामान्य बकरी सीरम और 0.2% के बीच 20 के साथ ब्लॉक के साथ दो बार धोने, और फिर मीटर के साथ 60 मिनट के लिए दागविरोधी ICP0 (मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 11060) 15 अवरुद्ध बफर से धोने के लिए 3 बार के द्वारा पीछा किया, अवरुद्ध बफर में 1:60 पतला Ouse।
    3. तब आरटी पर 45 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध में AF488 संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी (1 माइक्रोग्राम / एमएल) और DAPI (100 एनजी / एमएल) के साथ सेते हैं और 3 बार धोएं। फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम वर्गों में एम्बेड और coverslips के साथ कवर किया।

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Representative Results

विधि की चुनौती एचएसवी -1 बेसल परत से प्रवेश कर सकते हैं जो में एपिडर्मल शीट तैयार करने के लिए है। महत्वपूर्ण कदम माउस तनाव पर निर्भर करता है, रूपांतरित किए जाने की जरूरत है, जो Dispase द्वितीय उपचार, द्वारा डर्मिस से एपिडर्मिस की जुदाई है। Dispase द्वितीय की एकाग्रता 2.5 से 5 मिलीग्राम / एमएल, और 20 से 45 मिनट से गर्मी के समय को लेकर कर सकते हैं। मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन केरातिन 14 का धुंधला आसानी से बेसल एपिडर्मल परत संक्रमित या यह संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 2) का केवल एक बहुत ही सीमित संख्या दिखाएगा कि क्या किया जा सकता है की भविष्यवाणी की अनुमति देता है। आदर्श रूप में, एपिडर्मल पूरे माउंट के केरातिन 14 धुंधला बेसल कोशिकाओं (2A चित्रा) के एक अक्षुण्ण परत संकेत चाहिए। सबसे खराब स्थिति में, Dispase द्वितीय उपचार बेसल परत बाधित और (चित्रा 2 बी अलग हैं केरातिन बेसल केरेटिनकोशिकाओं 14 व्यक्त संकेत है कि interfollicular एपिडर्मिस में दाग कोई कोशिकाओं रहे हैं 16 (चित्रा 2 बी) । 14 धुंधला (चित्रा -2) केरातिन द्वारा कल्पना के रूप में केवल 30 मिनट के लिए 2.5 मिलीग्राम / एमएल Dispase द्वितीय की कमी के बाद, एक अक्षुण्ण बेसल परत प्राप्त हुई थी।

त्वचा वयस्क चूहों की पूंछ से लिया जाता है क्योंकि जब एपिडर्मिस के उपांग के रूप में घने बालों के रोम के, डर्मिस से एपिडर्मिस की जुदाई सबसे सुविधाजनक है। ऊष्मायन के बाद चादरों की कमजोरी analyzable क्षेत्रों के आकार को सीमित करता है, हालांकि वैकल्पिक रूप से, बालों के रोम के विकास के साथ नवजात चूहों के पीछे त्वचा, इस्तेमाल किया जा सकता है। अब तक, एचएसवी -1 संक्रमण की दक्षता में कोई अंतर नहीं एपिडर्मिस (चित्रा 3) नवजात या वयस्क चूहों से लिया गया है, इस पर निर्भर देखा गया था। Newbo के पूरे mountsआर.एन. एपिडर्मिस कुशल interfollicular एपिडर्मिस के संक्रमण के रूप में अच्छी तरह से विकसित बालों के रोम अस्तर घनी पैक कोशिकाओं के रूप में (चित्रा 3) कल्पना। वयस्क एपिडर्मिस की interfollicular एपिडर्मिस कुशलता से संक्रमित है, वहीं बाल कीटाणुओं और बालों के रोम के बाहरी जड़ शीथ के केवल भागों (चित्रा 3) संक्रमित हैं। असंक्रमित नियंत्रण (चित्रा 3) के रूप में दिखाया गया बाल शाफ्ट नीचे वसामय ग्रंथियों हमेशा की वजह से माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट धुंधला करने के लिए है, तथापि, जो, दाग रहे हैं।

अवरोध करनेवाला अध्ययन का उपयोग कर हम कोलेस्ट्रॉल एपिडर्मिस में एचएसवी -1 प्रवेश के लिए एक भूमिका निभाता है, चाहे वह जांच की। वयस्क चूहों के एपिडर्मल शीट प्लाज्मा झिल्ली 17-19 से कोलेस्ट्रॉल को क्षीण करता है, जो मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD), के साथ pretreated थे। संक्रमण से पहले, MβCD वायरल envel में कोलेस्ट्रॉल पर किसी भी घट प्रभाव से बचने के लिए कई कदम धोने से हटा दिया गया थाope। पूर्व उपचार पर 20 मिमी के साथ लगभग कोई संक्रमित कोशिकाओं interfollicular एपिडर्मिस या बालों के कीटाणुओं को या तो में देखा है, लेकिन वसामय ग्रंथियों के केवल गैर विशिष्ट धुंधला दिखाई (चित्रा -4 ए) था MβCD। ऊतक अवरोध करनेवाला उपचार से क्षतिग्रस्त नहीं किया गया था कि एक नियंत्रण के रूप में, हम MβCD इलाज एपिडर्मल शीट (चित्रा -4 ए) की भरपाई के लिए 500 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल गयी। इस इलाज के लिए पूरी तरह से अवरोध करनेवाला के साथ pretreatment के ऊतक की व्यवहार्यता के साथ हस्तक्षेप नहीं किया है कि प्रदर्शन संक्रामकता बहाल।

माउस मॉडल का प्रयोग हम एपिडर्मिस 10 में एचएसवी -1 के लिए nectin -1 और सेलुलर रिसेप्टर्स के रूप में herpesvirus प्रविष्टि मध्यस्थ (HVEM) की भागीदारी को संबोधित किया। दोनों प्रोटीन विभिन्न सेल लाइनों 20,21 में एचएसवी के लिए के रूप में कुशल रिसेप्टर्स कार्य करने के लिए जाना जाता है, और वे चूहों 22 में रोग के विकास के लिए पर्याप्त हैं। हम HSV- रूप nectin -1 और HVEM की एपिडर्मिस-विशिष्ट भूमिकाओं चुना गया1 रिसेप्टर्स 10। वायरस युक्त मध्यम पर wildtype, nectin-1- या HVEM की कमी चूहों से एपिडर्मल शीट चल के बाद, पूरे mounts संक्रमित कोशिकाओं की संख्या में कल्पना करने के लिए 3 घंटा गड़बड़ी पर तैयार किए गए थे। interfollicular epidermises की तुलना केवल nectin -1 कमी नाटकीय रूप से ICP0 व्यक्त कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 4 बी) कम है कि इंगित करता है। 18 घंटा गड़बड़ी पर cryosections में दिखाया गया है इसके अलावा, वायरल प्रसार nectin -1 के अभाव में नहीं बल्कि सीमित था (चित्रा 4C)। संक्रमित कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए, यह संक्रमित कोशिकाओं की संख्या समान रूप से interfollicular एपिडर्मिस भर में या संक्रमित कोशिकाओं के समूहों मनाया जाता है, चाहे वितरित किया जाता है कि क्या नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए nectin -1 की कमी एपिडर्मिस में, संक्रमण दक्षता कुछ क्षेत्रों में लगभग 10% संक्रमण और interfollicular एपिडर्मिस 10 के अन्य क्षेत्रों में लगभग 30% के साथ विविध। इस प्रकार, हम टी का फैसलाओ गुणात्मक डेटा के रूप में संक्रमण की कमी है, लेकिन वर्तमान में पूरे आरोह को प्रदर्शित करने के लिए संक्रमित कोशिकाओं का कोई नंबर दे।

चित्र 1
चित्रा 1:। एपिडर्मल वर्गों या पूरे mounts में संक्रमित कोशिकाओं के दृश्य यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

शीर्ष पर पूरा वयस्क त्वचा के नमूनों को दर्शाता हुआ एक योजना है, बेसल keratinocyte परत के दृश्य सतह के साथ डर्मिस से जुदाई, और एपिडर्मल पूरे mounts के बाद एपिडर्मल वर्गों। एक बाल कूप और स्टार के लिए तीर अंक interfollicular एपिडर्मिस इंगित करता है। 3 सप्ताह पुरानी चूहों से तैयार त्वचा के नमूनों और एपिडर्मल शीट 1.5 या 3 घंटा गड़बड़ी नमूने थे staine पर एचएसवी -1 पर लगभग 100 pfu / सेल से संक्रमित और तय किया गयाविरोधी ICP0 (हरा) नकली संक्रमण के बाद या 1.5 या 3 घंटा गड़बड़ी पर साथ घ संक्रमित कोशिकाओं कल्पना, और DAPI (नीला) के साथ नाभिक की counterstaining विभिन्न परतों में सभी कोशिकाओं को दर्शाता करने के लिए। एक नियंत्रण के रूप में, नकली संक्रमित पूरा त्वचा के नमूनों कोई ICP0 धुंधला (बाएं हिस्से) का प्रदर्शन 3 घंटा गड़बड़ी पर संक्रमित नमूनों की तुलना में दिखाए जाते हैं। Cryosections के रूप में तैयार नकली संक्रमित या संक्रमित एपिडर्मल शीट मध्य भाग में दिखाया जाता है। 1.5 या 3 घंटे के लिए संक्रमित एपिडर्मल पूरे mounts दाहिने हिस्से पर दिखाए जाते हैं। बार, 25 माइक्रोन (cryosections), और 40 माइक्रोन (पूरे mounts)।

चित्र 2
चित्रा 2:। Dispase के विभिन्न सांद्रता C57BL 6 / या B6.A2G-MX1 चूहों से द्वितीय एपिडर्मिस के साथ ऊष्मायन के बाद एपिडर्मल पूरे माउंट के केरातिन 14 धुंधला Dispase द्वितीय के साथ डर्मिस से अलग हो गया था। एपिडर्मल पूरे mounts विरोधी kerati के साथ दाग थेn 14 (लाल) और DAPI (नीला) के साथ। एपिडर्मल चादरों 5 मिलीग्राम / एमएल के साथ incubated रहे थे (ए, बी) या 2.5 मिलीग्राम / एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए (सी) Dispase द्वितीय। बार, 25 माइक्रोन। लघुरूप:। बाल कूप (एचएफ), interfollicular एपिडर्मिस (IFE), वसामय ग्रंथि (एसजी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। नवजात शिशु या वयस्क एपिडर्मिस के पूरे mounts में ICP0 अभिव्यक्ति की विज़ुअलाइज़ेशन योजनाएं क्रमश: वयस्क और नवजात epidermises से बेसल परत के दृश्य सतह दिखा रहा है, बालों के रोम के साथ एपिडर्मल पूरे mounts illustrating या बालों के रोम के विकास। एपिडर्मल शीट एचएसवी -1 पर लगभग 100 pfu / सेल से संक्रमित थे, और पूरे mounts के साथ दाग थेविरोधी ICP0 (हरा) और एक नियंत्रण के रूप में 3 घंटा गड़बड़ी पर DAPI (नीला) के साथ, वयस्क पूंछ त्वचा से असंक्रमित एपिडर्मल पूरे mounts केवल माध्यमिक एंटीबॉडी वसामय ग्रंथियों की गैर विशिष्ट धुंधला का प्रदर्शन के साथ दाग रहे थे। बार, 25 माइक्रोन। लघुरूप: बाल कूप (डीएचएफ), बाल कूप (एचएफ), interfollicular एपिडर्मिस (IFE), वसामय ग्रंथि (एसजी) के विकास। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। अवरोध करनेवाला MβCD या nectin-1- या HVEM की कमी epidermises का उपयोग करके सेलुलर कारकों के प्रभाव का आकलन (ए) 3 सप्ताह पुरानी WT चूहों (/ 6 C57BL) के वयस्क पूंछ त्वचा से एपिडर्मल शीट MβCD साथ pretreated थे (20 मिमी) और कम से अनुमानित एचएसवी -1 से संक्रमितmately 100 pfu / सेल। एक नियंत्रण के रूप में, इलाज एपिडर्मल शीट संक्रमित थे, और 35 मिमी MβCD साथ pretreated एपिडर्मल शीट संक्रमण के लिए पहले 500 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के साथ इलाज किया गया। एपिडर्मल पूरे mounts MβCD उपचार से कोलेस्ट्रॉल की कमी के बाद संक्रमित कोशिकाओं की संख्या प्रदर्शित करने के लिए विरोधी ICP0 (हरा) के साथ और 3 घंटा गड़बड़ी पर DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। 3 चित्र में दिखाया गया है, वसामय ग्रंथियों (एसजी) का धुंधला गैर विशिष्ट है। लघुरूप: एचएफ (बाल कूप), Ife (interfollicular एपिडर्मिस), एसजी (वसामय ग्रंथि)। बार, 150 माइक्रोन। (बी) वयस्क पूंछ गुम्मट के epidermises (/ 6 C57BL), nectin-1- 23, या HVEM की कमी चूहों 24 (1 महीने की उम्र में) लगभग 100 pfu / सेल में संक्रमित थे। एपिडर्मल पूरे mounts विरोधी ICP0 (हरा) के साथ और 3 घंटा गड़बड़ी (सी) गुम्मट से एपिडर्मल चादरों की cryosections पर DAPI (नीला) (C57BL / 6) या nectin-1-चूहों की कमी 23 18 घंटा गड़बड़ी पर दाग रहे थे के साथ दाग थे रिस(बी) और (सी) में दिखाया गया ults ए, बी और सी कोंफोकल अनुमानों में संदर्भ 10 से संशोधित और छवियों को दिखाया जाता है विलय कर रहे हैं। बार, 150 माइक्रोन (ए), और 25 माइक्रोन (बी, सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वयस्क C57BL से त्वचा / 6 की एपिडर्मल शीट एचएसवी -1 से संक्रमित होते हैं जब कम वायरस खुराक सहसंबंधी, जबकि लगभग 100 pfu / सेल, हम कम संक्रमित कोशिकाओं और एक धीमी साथ interfollicular एपिडर्मिस में बेसल परत के लगभग सभी कोशिकाओं में संक्रमण का निरीक्षण संक्रमण की प्रगति की। सामान्य में, बालों के रोम संक्रमित कोशिकाओं की एक चर संख्या दिखाने; विकासशील बालों के रोम अस्तर बल्कि छोटे केरेटिनकोशिकाओं के सबसे संक्रमित हैं, जबकि वयस्क बाल कूप के केवल बाल रोगाणु पूरी तरह से संक्रमित है। Dispase द्वितीय उपचार आय से एपिडर्मिस की जुदाई, बालों के रोम के कुछ हिस्सों को खो दिया हो कैसे कोमल पर निर्भर करता है। ज्यादातर मामलों में, वसामय ग्रंथियों और interfollicular एपिडर्मिस के बीच keratinocyte परतों याद कर रहे हैं और बाहरी जड़ शीथ अस्तर परत बाधित हो सकता है। किसी भी मामले में, डर्मिस और संक्रमण दक्षता से एपिडर्मिस को अलग करने की प्रक्रिया (एक दूसरे के लिए माउस तनाव से भिन्न हो सकते हैं

साथ में ले ली, पूर्व vivo संक्रमण परख की चुनौती एपिडर्मल चादरों की तैयारी और रखरखाव है। ऊतक की कमजोरी बहुत सावधानी से निपटने की आवश्यकता है और ऊतक डर्मिस से अलग होने के बाद से संरक्षित है कि कैसे अच्छी तरह से नियंत्रित करता है। एक और मुद्दा संस्कृति में चादरों की सीमित व्यवहार्यता है। सेल व्यवहार्यता समय के साथ कम हो जाती है के बाद से, संक्रमण प्रयोगों चादरों की तैयारी के तुरंत बाद या कम से कम 3 घंटा प्रदर्शन किया जाना चाहिए। Murine त्वचा के अलावा, एपिडर्मल चादरें भी मानव त्वचा या म्यूकोसा नमूने से तैयार किया जा सकता है। प्रकृति और एपिडर्मिस की मोटाई पर निर्भर करता है, Dispase उपचार के लिए अनुकूलित किया जाना है।

संक्रमण के पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए, यह cryosections में संक्रमित कोशिकाओं कल्पना करने के लिए सबसे उपयुक्त है। एक उच्च pfu / सेल और संक्रमण का अब समय के साथ, एपिडर्मल शीट disintegra किसी तरह का शुरू है कि मन में रखने के लिए हैtion। Cytopathic प्रभाव पर आधारित है, कोशिकाओं दौर और सेल सेल संपर्क बाधित हो। 100 pfu / सेल के साथ 24 घंटा गड़बड़ी करके, कुछ संक्रमित बेसल कोशिकाओं को भी Dispase द्वितीय उपचार पर निर्भर हो सकता है, जो खो मिल सकता है। कम pfu / सेल के साथ, संक्रमण बार गंभीर ऊतकों को नुकसान के लिए अग्रणी बिना बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, नुकसान की हद तक रोगजनक विभिन्न वायरस उपभेदों रहे हैं कि कैसे की मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

हम ICP0 अभिव्यक्ति धुंधला द्वारा संक्रमित कोशिकाओं कल्पना करने के लिए पसंद करते हैं। लाभ संक्रमित कोशिकाओं के एक काफी जल्दी पता लगाने के लिए है, और, ICP0 धुंधला पैटर्न पर आधारित है, संक्रमण के दौरान एक प्रारंभिक चरण में कोशिकाओं को एक उन्नत चरण में उन लोगों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, संक्रमित कोशिकाओं में इस तरह के वायरल capsid प्रोटीन VP5 और वायरल लिफाफा प्रोटीन जीडी के रूप में अन्य जल्दी जीनों की अभिव्यक्ति धुंधला द्वारा देखे जा सकते हैं।

हम भी पहले वायरल जीन अभिव्यक्ति के लिए या तो inf के द्वारा भेजे गए वायरस कणों की कल्पना करने की कोशिश कीGFP टैग एचएसवी -1 के साथ या तय नमूनों में capsids धुंधला द्वारा ection। हमारे अनुभव के अनुसार, GFP प्रतिदीप्ति के पैटर्न या ऊतक वर्गों में धुंधला पैटर्न स्पष्ट रूप से भली भाँति वायरस कणों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए बहुत जटिल हैं। 1,500 pfu / सेल का इस्तेमाल किया जाता है - ~ 1000 के उच्च वायरस titers जब वैकल्पिक रूप से, वायरस कणों इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं। कम वायरस खुराक के मामले में, वायरस कणों को शायद ही पता लगाया जा सकता है।

इसके बजाय बरकरार एपिडर्मल शीट में संक्रमित कोशिकाओं visualizing की, एपिडर्मिस आरएनए स्तर का विश्लेषण या FACS विश्लेषण द्वारा ब्याज की जीन की सतह, साइटोप्लास्मिक या परमाणु अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं की संख्या यों को अलग किया जा सकता है।

हम इस पूर्व vivo संक्रमण प्रोटोकॉल बेसल केरेटिनकोशिकाओं संक्रमित करने के लिए जाना जाता है कि उन लोगों के वायरस के लिए कम से कम अनुकूलित किया जा सकता है कि मान।

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Acknowledgments

हम तकनीकी सलाह के लिए B6.A2G-MX1 चूहों और Semra OZCELIK प्रदान करने के लिए पीटर Staeheli धन्यवाद।

इस काम SFB829 और KN536 / 16 के माध्यम से जर्मन रिसर्च फाउंडेशन, और चिकित्सा के कोलोन फॉर्च्यून कार्यक्रम / संकाय, कोलोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX Life Technologies 31966047 needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder Roche 4942078001 has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution Sigma C5914 needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution Life Technologies 12563-029 needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin Bio-Rad 142-2832 needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin  Sigma G7765 needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) Covance PRB-155P used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-11029 used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-21429 used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml) Sigma 36670 used to counterstain the nucleus

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 102 विषाणु विज्ञान दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1, murine एपिडर्मिस वायरल प्रविष्टि वायरल प्रसार
दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 के साथ Murine एपिडर्मिस के <em>पूर्व vivo</em> संक्रमण
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Rahn, E., Thier, K., Petermann, P., Knebel-Mörsdorf, D. Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1. J. Vis. Exp. (102), e53046, doi:10.3791/53046 (2015).

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