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Immunology and Infection

단순 포진 바이러스 1 형과 쥐 표피의 생체 감염

Published: August 24, 2015 doi: 10.3791/53046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Center for Biochemistry, University of Cologne, 2Department of Dermatology, University of Cologne

Abstract

그 인간 숙주를 입력, 단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 점막 표면, 피부 또는 각막의 장벽을 극복해야한다. HSV-1 대상은 초기 진입시 각화 및 신경 세포의 잠재 감염 뒤에 상피에 차 감염을 설정합니다. 재 활성화 한 후, 바이러스는 피부 소포 또는 점막 궤양으로 표시 피부 점막 부위에서 분명하게 할 수 있습니다. HSV-1은 피부 나 점막을 침범하고 도달 방법의 수용체는 제대로 이해된다. 세포 수준에서 표피 조직에 HSV-1의 침입 경로를 조사하기 위해, 우리는 피부의 기본 및 재발 성 감염 부위를 나타내는 쥐의 표피의 생체 감염 모델을 설립했다. 분석은 쥐의 피부의 준비를 포함한다. 표피는 디스 파제 II 처리하여 진피로부터 분리된다. 바이러스 - 함유 배지에서 상피 시트를 플로팅 한 후, 조직은 고정이고 감염에 의해 여러 번 postinfection에서 시각화 될 수있는HSV-1 즉각적인 초기 ICP0 단백질에 대한 항체로 감염된 세포를 염색. ICP0는 발현 세포 것은 1.5 열연 postinfection 이미 기저 각질 세포 층에서 관찰 될 수있다. 더 이상 감염 시간으로, 감염된 세포는 감염이 기초 각질 세포로 제한하지만, 바이러스가 조직에서 다른 층으로 확산되어 있지 않은 것을 나타내는, suprabasal 층에서 발견된다. 다양한 마우스 모델의 표피 시트를 사용하면, 감염 프로토콜은 조직으로 HSV-1 침입에 기여 세포 성분의 참여를 결정하는 허용한다. 또한, 분석은 초기 진입 단계에 지장 조직 억제제, 세포 간 확산 및 바이러스 생산을 테스트하기에 적합하다. 여기, 우리는 세부 사항에 생체 감염 프로토콜을 설명하고 nectin-1 또는 HVEM 결핍 마우스를 사용하여 우리의 결과를 제시한다.

Introduction

단순 포진 바이러스 (HSV)는 생명을 위협하는 감염에 약한 단순한 피부 점막 병변에서 인간의 질병의 범위가 발생할 수 있습니다. HSV 1 형 (HSV-1)이 지배적 가능성 생식기 감염 1 원인 HSV 2 형 (HSV-2), 반면, 구강 안면 뇌염 감염과 관련된다. HSV는, 문화에서 셀을 입력 감염을 시작하고 바이러스 자손을 생산하는 방법의 이해에 상당한 진전이있는 동안, 우리는 세포 수준 2에서 조직에 바이러스 침입 경로 (들)에 대해 거의 알고있다. HSV 피부 또는 점막 감염 마우스의 연구를 들어, 토끼, 기니아 피그 동물 모델로서 사용되어왔다. 피부 감염은 피내 주사 또는 바이러스의 존재에 의해 피부를 긁 확립시키고, 질병 발달은 바이러스 생산과 관련이 있었다. 이러한 방법은 질병 발병의 다양한 측면을 이해하는 데 도움이, 그리고 항 바이러스 약물을 평가하는 데 사용됩니다. tissu에서 HSV 감염을 연구하는E 수준은, 인간의 피부의 Organotypic 모델이 적용되어왔다. 감염률은 이들 뗏목 배양 제한되는 바와 같이, 감염, 바이러스 확산을 조사하는 연구와 항 바이러스 성분의 효과의 제한된 수는 3-6 발표되었다.

그대로 상피에서 HSV-1 감염 기간 동안 역할을 휴대 결정기를 특성화하기 위해, 우리는 뮤린 표피 (7)의 생체 감염 연구를위한 프로토콜을 확립. 신생아 피부 또는 성체 마우스의 꼬리로부터 제조 하였다. HSV-1 바이러스 함유 배지에서 침수 된 완벽한 피부 샘플을, 감염 없었기 때문에, 우리는 디스 파제 II 처리에 의해 진피에서 표피를 분리. 바이러스 - 함유 배지에서 표피 시트 부동 후 감염된 세포를 다양한 시간의 postinfection (PI) (7)에서 기저 표피 층으로 시각화 될 수있다. 바이러스 복제에 앞서 각 셀 감염의 개시를 시각화ND 바이러스 생산, 우리는 HSV-1 감염 기간 동안 발현되는 첫 단백질이다 감염된 세포 단백질 0 (ICP0)에 대한 항체로 염색. ICP0의 세포 현지화는 초기 감염시 가지 단계를 통과한다. ICP0는 바이러스 유전자 발현의 초기 단계에서의 핵 병소에 존재하지만, 세포질로의 ICP0 relocalization 감염 (8)의 후속 단계를 나타낸다.

우리는 감염 동안 다양한 세포 인자의 역할 가능성을 테스트하기 위해 다른 마우스 모델에서 상피 시트의 생체 감염 분석을 사용 하였다. 굴지 역학의 핵심 레귤레이터로 RAC1의 영향을 해결하기 위해, 우리는 RAC1 유전자 (9)의 각질 세포 고유의 삭제와 쥐의 표피를 감염. 이 모델은 표피의 각질 층에서 HSV-1 감염의 효율성에 결함이 RAC1의 결과를 연구하기 위해 우리를 허용했다. 다시 제어 한배 새끼의 감염 표피에 비교RAC1의 부재 (7)의 표피 기저층 감염의 개시에 아무런 영향을 미치지 않았다 나타내는 큰 차이를 vealed 없다. 상기 마우스 모델의 사용은 우리가 세포 수용체는 표피 진입을 중재 할 수있는 해결. HSV-1 nectin -1- HVEM 또는 - 결핍 마우스에서 표피 중 시트 감염은 조직으로 진입 초기 바이러스 강하게 nectin-1 (10)의 존재에 의존한다는 것을 밝혔다. 또한, 우리의 결과는 HVEM 또한 nectin-1 (10)보다 덜 효율적 있지만, 쥐의 표피에있는 수용체 역할을 할 수 있음을 보여줍니다.

표피 층에 감염된 세포의 공간 분포를 해결하기 위해, 우리는 조직 절편, 표피 및 전체 마운트 (도 1)의 발현을 ICP0 시각화. 전체 피부의 저온부에서 더 ICP0 발현 세포는 (그림 1) 검출되지 않습니다. 대조적으로, 상피 시트의 저온부가 세포질을 보여이미 3 시간 PI (그림 1)에서 기저층에서 ICP0 식입니다. 나중에 시간에, 바이러스가 가시화 될 수있다 층을 suprabasal 확산. 기저층에 감염된 세포의 공간 분포를 용이하게 표피 전체 마운트 (도 1)에 따라 될 수있다. HSV-1 100 PFU / 셀에 감염되면, interfollicular 표피의 기저 각질 세포의 약 50 %는 대부분의 감염된 세포 핵 ICP0을 표현하는이 시점에서 1.5 시간 파이에서 ICP0 식을 보여줍니다. 초기 유전자 발현의 후기 단계를 나타내는 세포질 ICP0의 relocalization 3 열연 PI (도 1)의 거의 모든 세포에 존재한다. 생체 HSV-1 감염에 감염된 세포를 시각화의이 모드는 억제제 또는 조직에서 바이러스 성 항목 및 확산에 / 삭제 돌연변이 세포 성분의 효과를 연구 할 수있는 강력한 분석을 제공합니다.

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Protocol

윤리 문.

희생 동물의 표피 시트의 제조는 Landesamt 대 투르, UMWELT 및 Verbraucherschutz, 노스 린 - 웨스트 팔리 아 (독일)의 가이드의 권고 사항을 엄격히 준수하여 수행됩니다. 이 연구는 LANUV 노르 트라 인 베스트 팔렌 (수 8.84-02.05.20.13.018)에 의해 승인되었다.

악기와 문화 미디어 1. 준비

  1. 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) / 고 포도당 글루타민 디 펩티드, 10 % FCS, 100 IU / ㎖ 페니실린을 함유하고 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의이 (이하, 「DMEM」이라 함)에서 상피 시트를 배양.
  2. 상피 시트의 제조를위한, 심하게 가열 PBS (최대 37 ° C)에서 디스 파제 II에게 분말 (5 ㎎ / ㎖)에 녹인다. 0.22 μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링 및 치료에 직접 사용합니다.
  3. 표피 전체의 준비 (13) 마운트를 들어, 광을 차단 준비0.5 % 분유, 냉수 물고기 피부와 TBS에서 0.5 % 트리톤 X-100에서 0.25 % 젤라틴과 어. 물질 회전 믹서에 실온에서 적어도 2 시간 동안 혼합물을 배양하여 용해하도록 허용합니다. 또한 세척 버퍼로 PBS에 트윈 20 0.2 %를 준비합니다. 고정 용, 3.4 %와 PBS에서 4 % 포름 알데히드를 준비합니다.
  4. 저온부의 면역 염색을 위해, 5 % 정상 염소 혈청과 0.2 % 트윈 20에서 PBS 버퍼로 차단 제조. 고정 용, PBS에 0.​​5 %의 포름 알데히드를 준비합니다.

쥐 피부에서 표피 시트 2. 준비

  1. 감염 연구를위한 신생아 다시 피부 표피의 준비
    1. 해부 접시에 해고 마우스 (1~3일 출생 후) 놓고 사지를 잘라 몸통에 가까운 꼬리는 전체 몸통으로부터 피부를 효율적으로 제거 할 수. 사지 제거하는 동안, 직경이 가능한 한 작은 상처를 유지하려고.
    2. 곡선 미세 집게와 몸통을 수정부드럽게 몸통으로부터 피부를 분리하기 위해 뒷면을 따라 꼬리 지느러미에 두개골에서 피부 아래에 무딘 끝이 위를 이동 ND. 백을 따라 피부를 슬릿.
    3. FACS 분석, 각질 세포 또는 RNA의 준비의 격리, 들어 몸통을 밀어 조직과 뭉툭한 팁 가위를 해결하기 위해 집게를 사용하여 몸통에서 완벽한 피부를 벗겨. 저온부 또는 전체 마운트의 준비를 위해 다시 피부의 조각을.
    4. 약 10 × 10mm의 1-2 조각으로 메스와 함께 다시 피부를 잘라. ~ 1 ml의 멸균 PBS로 6 웰 플레이트 잘 하나에 조각을 넣어. 피부면이 바닥을 향하도록해야합니다.
    5. 1.5 ml의 디스 파제 II (5 ㎎ / ㎖ PBS)에 의해 PBS를 교체하고 4 ° C에서 / 30 (전체 마운트에 대한) 37 ° C에서 분 또는 O 중 하나는 N 품어. PBS로 3 회 반복한다. 부드럽게 표피를 들어 올릴 기본 진피와 다른 집게를 해결하기 위해 하나의 집게를 사용하여 그대로 시트로 표피를 제거합니다. 이 단계 EAS를 만들기 위해 쌍안경을 사용하여Y. 아래쪽으로는 기초면 DMEM에 표피 시트를 전송합니다. 감염 실험에 즉시 시트를 사용합니다.
      주 : 주로 FACS 분석, 각질 세포 또는 RNA의 제조를 위해 절연 신생아 피부 표피의 제제를 사용한다. 때문에 그 취약성의, 저온부 또는 전체 마운트에 대한 감염 시트의 준비는 덜 적합하다.
  2. 감염 연구를위한 성인 꼬리 피부에서 표피의 준비
    1. 자궁 전위에 의해 1~3개월 세의 나이에 쥐를 안락사. 뒷면에 긴 포함 된 모낭이 손상 표피 시트의 분리를 방해하기 때문에 대신 다시 피부의 꼬리를 가져 가라. 희생 생쥐의 꼬리를 잘라 메스와 길이를 슬릿.
    2. 뼈에서 피부를 벗겨 약 5 × 5mm의 조각으로 메스로 들어온다. 잘 하나에서 4 개까지 넣고 2.1.5에서 설명한대로 디스 파제 II에서 배양 진행
      참고 : 사용 성인 타이L 피부 저온부 또는 전체 마운트를 제조 하였다. 또한 즉시 사용에, 꼬리는 저장 또는 중요한 감염 효율을 잃지 않고 4 ℃에서 약 24 시간 동안 전송 될 수있다. 꼬리가 48 시간으로 유지하는 경우, 표피 시트는 거의 HSV-1에 감염되지 않을 수 있습니다.
  3. FACS 분석을위한 표피의 해리
    주 : FACS 분석에 의해 표면 단백질의 발현의 검출은 세포 표면 및 관심 단백질을 손상하지 않는 적절한 세포 분리 기술을 필요로한다.
    1. RT에서 15 분 동안 1.5 ㎖ / 웰 재조합 트립신 계 세포 해리 용액에 37 ℃에서 15 분 동안 기부 쪽과 6 웰 플레이트에서 태어난 표피 시트를 배양한다.
    2. 3 ml의 DMEM을 추가하여 부화를 중지합니다. 각질 용해 얻을 수 있도록 부드럽게 6 잘 판에 표피를 이동 곡선 미세 집게를 사용하여 각질을 떼어 놓다. 세포 현탁액을 수집하고이 과정을 3 회 반복항상 신선한 DMEM을 사용.
      참고 :이 해리 절차는 각질 세포의 표면에 nectin-1을 감지하는 것이 적절하다.
    3. 대안 적으로, RT에서 15 분, 37 ° C에서 15 분 동안 효소를 무 세포 해리 용액에 표피 시트 (CDS)를 배양한다. 부드럽게 위아래로 CD를 피펫 팅하여 각질을 플러시 실온에서 또 다른 15 분을 품어.
    4. 세포 현탁액을 수집하고 신선한 DMEM을 사용하여 세척 단계를 3 회 반복한다.
      참고 :이 해리는 HVEM의 표면 발현을 감지하기에 적합합니다. CDS 용액의 단점은 더 적은 세포가 재조합 트립신 계 세포 해리 용액보다 해리된다는 점이다. 또한 재조합 트립신 계 세포 해리 용액 감염된 상피 시트의 해리 후에 발현 등 ICP0 식 핵 또는 세포질 발현을 FACS로 분석 될 수있다 표면.
  4. 표피의 해리는 각질이나 전직을 분리요로 RNA
    1. 1.5 ㎖ / 웰 재조합 트립신 계 세포 해리 용액을 포함하는 접시의 바닥쪽으로 기부 쪽과 6 웰 플레이트에서 태어난 표피 시트를 넣는다. 실온에서 30 분 동안 품어. 3 ml의 DMEM을 추가하고 부드럽게 접시에 표피를 이동 곡선 미세 집게를 사용하여 각질을 떼어 놓다.
    2. 세포 현탁액을 수집하고 신선한 DMEM을 사용하여이 단계를 3 회 반복한다. RNA 또는 문화 차 쥐의 각질 세포에 압축을 풉니이 세포 현탁액을 사용합니다.

HSV-1과 표피 시트 3. 감염

  1. 500 ㎕의 DMEM 이상에서 HSV-1 중량 균주 17 (11)의 용액을 제조하고 표피 시트 플로팅되는 바이러스 용액으로 교환 매체. 이 시점은 0~12 시간으로 정의한다. 37 ℃에서 24 웰 플레이트의 한 웰에 표피 시트의 감염을 수행한다. 바이러스 역가의 계산은 추정 된 개수에 기초표피 시트 당 기저층에서 세포의 (약 5 × 5mm 시트 당 2 × 10 5 세포).
  2. HSV-1에서 약 100 플라크 형성 단위 (PFU) / 세포로 감염 1 시간 PI DMEM에 의해 바이러스 함유 배지를 대체
    주 : 신생아 피부의 표피 시트의 경우, 시트 배양 동안 해리 시작 있음을 알아 두셔야합니다.

감염된 세포 4. 시각화

  1. 표피 전체 마운트 (13)
    1. 3.4 %의 포름 알데히드 중 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안과 표피 시트를 고정합니다. PBS로 두 번 세척하고 0.5 % 분유, 냉수 물고기 피부와 RT (14)에서 1 시간 동안 TBS에서 0.5 % 트리톤 X-100에서 0.25 % 젤라틴으로 차단합니다.
    2. 15 실온에서 버퍼를 차단에서 1:60으로 희석 마우스 항 - ICP0 (단클론 항체 11060)와 시트 O / N을 품어. 중간 필라멘트 네트워크 시각화 토끼 폴리 클로 날 항 - 부화 동시에마우스 케라틴 14 (NG 100 / ㎖).
    3. 실온에서 4 시간 동안 PBS-0.2 % 트윈 20으로 4 ~ 5 회 반복한다. O / N이 함께 AF488 - 공액 안티 - 마우스 IgG (1 μg의 / ㎖), AF555 - 공액 안티 - 토끼 IgG의 (1 μg의 / ㎖) DAPI (4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌) (100 NG 부화 RT에서 블로킹 완충액에서 / ㎖).
    4. 실온에서 4 시간 동안 PBS-0.2 % 트윈 20 씻으십시오. 표본 슬라이드의 상단에 자신의 기저면 산의 표피 시트, 형광등 설치 매체에 포함 된 커버와 커버.
  2. 표피 저온부
    1. 성인 상피 시트를 실온에서 20 분 동안 PBS 중의 4 % 포름 알데히드로 고정하고 PBS로 2 회 세척 하였다. 조직에 포함 된 고정 시트는 액체 질소 중간 동결 동결. cryomicrotome으로 8 ~ 10 μm의 섹션을 잘라.
    2. 실온에서 10 분 동안 PBS 0.5 %의 포름 알데히드 다시 부분 수정 PBS, 실온에서 30 분 동안 PBS에 5 % 정상 염소 혈청과 0.2 % 트윈 20 블록을 2 회 반복 한 다음 M 60 분간 얼룩안티 ICP0 (모노클로 날 항체 11,060) (15)가 차단 완충액으로 3 회 세척 한 후, 블로킹 완충액에서 1:60으로 희석을 여러개.
    3. 이어서 실온에서 45 분 동안 블로킹 완충액에서 AF488 - 공액 안티 - 마우스 IgG (1 μg의 / mL) 및 DAPI (100 NG / ml)로 배양하고 3 회 반복한다. 형광 장착 매체 섹션을 포함하고 커버 슬립 커버.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX Life Technologies 31966047 needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder Roche 4942078001 has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution Sigma C5914 needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution Life Technologies 12563-029 needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin Bio-Rad 142-2832 needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin  Sigma G7765 needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) Covance PRB-155P used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-11029 used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-21429 used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml) Sigma 36670 used to counterstain the nucleus

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References

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Rahn, E., Thier, K., Petermann, P.,… More

Rahn, E., Thier, K., Petermann, P., Knebel-Mörsdorf, D. Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1. J. Vis. Exp. (102), e53046, doi:10.3791/53046 (2015).

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