Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ex vivo Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1

Published: August 24, 2015 doi: 10.3791/53046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Center for Biochemistry, University of Cologne, 2Department of Dermatology, University of Cologne

Abstract

Å gå inn i human vert, må herpes simplex virus type 1 (HSV-1) overvinne barrieren av slimhinneoverflater, hud eller cornea. HSV-1 mål keratinocytter under innledende inngang og etablerer en primær infeksjon i epitelet, som etterfølges av latent infeksjon av neuroner. Etter reaktive, kan virus bli tydelig på slimhinnene nettsteder som vises som hud blemmer eller slimhinne magesår. Hvordan HSV-1 invaderer hud eller slimhinner og når sine reseptorer er dårlig forstått. For å undersøke invasjonen ruten for HSV-1 inn epidermal vev på cellenivå, etablerte vi en ex vivo infeksjon modell av murine epidermis, som representerer stedet for grunnskolen og tilbakevendende infeksjon i huden. Analysen omfatter fremstilling av murin hud. Epidermis er atskilt fra dermis ved dispase II behandling. Etter flytende epidermal ark på virusholdig medium, er vevet fast og infeksjon kan visualiseres på ulike tider postinfection avfarging av infiserte celler med et antistoff mot HSV-1, umiddelbare, tidlige protein ICP0. ICP0-uttrykkende celler som kan observeres i den basale keratinocytt lag allerede ved 1,5 timer postinfection. Infeksjon med lengre tider, infiserte celler detektert i suprabasal lag, noe som indikerer at infeksjonen ikke er begrenset til de basale keratinocytter, men viruset sprer seg til andre lag i vevet. Ved hjelp av epidermale lag av forskjellige musemodeller, kan infeksjonen protokollen bestemmelse av involvering av cellulære komponenter som bidrar til HSV-1 invasjon i vev. I tillegg er analysen egnet til å teste inhibitorer i vev som forstyrrer de første inngangstrinn, celle-til-celle-spredning og virusproduksjon. Her beskriver vi ex vivo infeksjon protokollen i detalj og presentere våre resultater ved hjelp nectin-1- eller hvem-mangelfull mus.

Introduction

Herpes simplex virus (HSV) kan føre til en rekke sykdommer hos mennesker fra milde ukompliserte mucocutaneous lesjoner til livstruende infeksjoner. HSV type 1 (HSV-1) er dominant forbundet med Orofacial infeksjoner og encefalitt, mens HSV type 2 (HSV-2) mer sannsynlig forårsaker genital-infeksjoner 1. Mens det er betydelige fremskritt i å forstå hvordan HSV går celler i kultur, initierer infeksjon og produserer viral avkom, vet vi lite om viral invasjon pathway (e) i vev på cellenivå 2. For studier av HSV hud eller slimhinneinfeksjoner, mus, har kaniner og marsvin blitt anvendt som dyremodeller. Hudinfeksjon ble etablert ved intradermal injeksjon eller ved å skrape huden i nærvær av viruset, og sykdomsutvikling ble korrelert med virusproduksjon. Disse metodene har hjulpet til å forstå ulike aspekter av sykdom patogenese, og blir brukt for å evaluere antivirale medikamenter. Å studere HSV infeksjon på tissue nivå, har organotypiske menneskelig hud modeller blitt påført. Som frekvensen av infeksjon er begrenset i disse flåte kulturer, har blitt publisert bare et begrenset antall studier som undersøker infeksjon, viral spredning og effekter av antivirale komponenter 3-6.

For å karakter cellulære determinants som spiller en rolle under HSV-1-infeksjon i intakt epitel, etablerte vi en protokoll for ex vivo infeksjon studier av murine epidermis 7. Huden ble fremstilt av nyfødte eller fra haler av voksne mus. Siden HSV-1 ikke kan forurense fullstendige hudprøver, som ble nedsenket i virusholdig medium, separeres vi epidermis fra dermis ved dispase II behandling. Etter flytende av de epidermale arkene på virusinneholdende medium, kan infiserte celler visualiseres i epidermal basallaget ved forskjellige tider postinfection (pi) 7. For å visualisere initieringen av infeksjon hos individuelle celler før en viral replikasjonnd virusproduksjon, vi farget med et antistoff mot infiserte celleprotein 0 (ICP0), som er en av de første proteinene uttrykt i løpet av HSV-1 infeksjon. Den cellulære lokalisering av ICP0 går gjennom forskjellige faser i løpet av tidlig infeksjon. Mens ICP0 er til stede i kjerne foki i løpet av et tidlig stadium av viral genekspresjon, relocalization av ICP0 til cytoplasma indikerer en etterfølgende fase av infeksjonen 8.

Vi brukte ex vivo infeksjon assay av epidermale ark fra forskjellige musemodeller for å teste potensielle rolle av ulike cellulære faktorer i løpet av infeksjonen. For å møte virkningen av Rac1 som en viktig regulator av aktin dynamikk, vi smittet epidermis av mus med en keratinocyte spesifikk sletting av Rac1 genet 9. Denne modellen tillot oss å studere konsekvensene av mangelfull Rac1 på effektiviteten av HSV-1-infeksjon i epidermal keratinocytt lag. Sammenligningen til infiserte epidermis av kontroll littermates revealed ingen signifikant forskjell, noe som indikerer at det ikke foreligger Rac1 hadde ingen effekt på initiering av infeksjon i basallaget av epidermis 7. Bruken av ytterligere musemodeller tillater oss å ta opp som cellulære reseptorer medierer inntreden i epidermis. Infiserer epidermale ark fra enten nectin-1- eller HVEM-manglende mus med HSV-1 viste at den opprinnelige viral inngang til vev avhenger sterkt av tilstedeværelsen av en 10-nectin. Videre våre resultater viser at HVEM kan også tjene som reseptoren i murine epidermis, men mindre effektivt enn nectin-1 10.

For å møte den romlige fordelingen av infiserte celler i epidermal lag, visualiserer vi ICP0 uttrykk i vevssnitt og epidermal hele mounts (figur 1). I frysesnitt av fullstendig hud, blir ingen ICP0-uttrykkende celler detektert (Figur 1). I motsetning til dette frysesnitt av epidermale lag demonstrere cytoplasmiskICP0 ekspresjon i basallaget allerede ved 3 timer pi (figur 1). På senere tidspunkt, viral spredning til suprabasal lag kan visualiseres. Den romlige fordeling av infiserte celler i det basale lag kan lett følges i epidermale hele monteringer (figur 1). Etter infeksjon med HSV-1 ved 100 PFU / celle, ca. 50% av basale keratinocytter i interfollicular epidermis viser ICP0 ekspresjon på 1,5 timer pi På dette tidspunkt de infiserte celler uttrykker atom ICP0. Den relocalization av ICP0 til cytoplasma som indikerer et senere stadium av tidlig genekspresjon er til stede i nesten alle celler i 3 timer pi (figur 1). Disse modi for å visualisere infiserte celler ved ex vivo HSV-1 infeksjon tilveiebringe en kraftig assay for å studere effekten av inhibitorer eller slettede / muterte cellulære komponenter på viral inngang og spredning i vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse.

Utarbeidelse av epidermal ark fra ofret dyr blir utført i henhold til anbefalingene fra Guide av Landesamt für Natur, Umwelt og Verbraucherschutz, Northrhine-Westfalen (Tyskland). Studien ble godkjent av LANUV NRW (Antall 8.84-02.05.20.13.018).

1. Utarbeidelse av Instrumenter og Culture Media

  1. Dyrk epidermale ark i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) / high glucose inneholdende glutamin dipeptid, 10% FCS, 100 IU / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (heretter referert til som "DMEM").
  2. For fremstilling av epidermale lag, nøye oppløse dispase II-pulver (5 mg / ml) i PBS oppvarmet (opp til 37 ° C). Filtrer løsningen gjennom et 0,22 um filter og bruke den direkte for behandling.
  3. For utarbeidelse av epidermal hele monterer 13, forberede blokkerer buffer med 0,5% melkepulver, 0.25% gelatin fra kaldtvannsfiskeskinn og 0,5% Triton X-100 i TBS. Tillat stoffer for å oppløse ved å inkubere blandingen i minst 2 timer ved RT på en roterende blander. Også forberede 0,2% Tween 20 i PBS som vaskebuffer. For fiksering, forberede 3,4% og 4% formaldehyd i PBS.
  4. For farging av frysesnitt, forberede blokkeringsbuffer med 5% normalt geiteserum og 0,2% Tween 20 i PBS. For fiksering, forberede 0,5% formaldehyd i PBS.

2. Utarbeidelse av epidermal blad fra Muse Skin

  1. Utarbeidelse av epidermis fra nyfødt tilbake huden for infeksjonsstudier
    1. Plasser en falt mus (1 til 3 dager etter fødsel) i en disseksjon skål og kuttet av ekstremiteter og halen nær torsoen for å tillate effektiv fjernelse av huden fra en fullstendig torso. Under fjerning av ekstremitetene, prøver å holde kutt så liten som mulig i diameter.
    2. Fest torso med buet fin pinsett ennd forsiktig bevege butte spiss saks under huden fra kraniale til kaudal langs baksiden for å skille skinnet fra torsoen. Slit huden langs ryggen.
    3. For FACS analyse, isolering av keratinocytter eller utarbeidelse av RNA, skrelle av hele huden fra torso med tang for å fikse vevet og sløv spiss saks til å dytte bort torso. For fremstilling av frysesnitt eller hele monteringer kan bare deler av rygghuden.
    4. Hakk tilbake huden med en skalpell i 1-2 stykker av ca 10 x 10 mm. Sette bitene i en brønn i en seks-brønns plate med ~ 1 ml steril PBS. Kontroller at dermal siden vender mot bunnen.
    5. Erstatte PBS med 1,5 ml dispase II (5 mg / ml PBS) og inkuberes i 30 minutter ved enten 37 ° C (for hele monteringer) eller O / N ved 4 ° C. Vask 3 ganger med PBS. Forsiktig fjerne overhuden som en intakt ark ved hjelp av en pinsett til å fikse de underliggende dermis og de andre pinsett til å løfte overhuden. Bruk en kikkert for å gjøre dette trinnet easy. Overfør den epidermale arket i DMEM med den basale siden mot bunnen. Bruk ark umiddelbart for smitteforsøk.
      MERK: Bruk utarbeidelse av epidermis fra nyfødt hud hovedsakelig for FACS analyse, isolering av keratinocytter eller utarbeidelse av RNA. På grunn av sin skjørhet, er fremstillingen av infiserte ark for frysesnitt eller hele monteringer mindre egnet.
  2. Utarbeidelse av epidermis fra voksen hale huden for infeksjonsstudier
    1. Avlive musene i en alder av 1 til 3 måneder ved cervikal dislokasjon. Ta hale i stedet for tilbake huden siden lenge innebygde hårsekkene på baksiden hemme separasjon av intakte epidermal ark. Skjær av halen fra ofret mus og slit den på langs med en skalpell.
    2. Trekk av skinnet fra benet og hakk det med en skalpell i biter på ca 5 x 5 mm. Sett opp til 4 stykker i en brønn, og fortsette med inkubasjon i dispase II som beskrevet under 2.1.5
      MERK: Bruk voksen tail huden til å forberede frysesnitt eller hele mounts. Alternativt til umiddelbar bruk, kan haler lagres eller transporteres i ca. 24 timer ved 4 ° C uten å tape signifikant infeksjon effektivitet. Hvis haler er holdt opp til 48 timer, kan epidermal ark bli knapt infisert med HSV-1.
  3. Dissosiasjon av epidermis for FACS analyse
    MERK: Påvisning av overflateprotein-ekspresjon ved FACS-analyse krever egnede celledissosiasjon teknikker som ikke skader celleoverflaten og proteinet av interesse.
    1. Inkuber nyfødte epidermale ark i en 6-brønns plate med basalsiden på 1,5 ml / brønn rekombinant trypsin-baserte celledissosiasjon løsning i 15 min ved romtemperatur og i 15 min ved 37 ° C.
    2. Stopp inkubasjon ved å legge 3 ml DMEM. Dissosiere keratinocytter ved hjelp av en buet pinsett for å forsiktig fin bevege epidermis i 6-brønns plate, slik at keratinocytter blir oppløst. Samle cellesuspensjonen og gjenta dette trinnet 3 gangeralltid med ferske DMEM.
      MERK: Denne dissosiasjon fremgangsmåten er passende for å påvise nectin-1 på overflaten av keratinocytter.
    3. Alternativt inkuber epidermale arkene på enzym-fri celledissosiasjon løsning (CDS) i 15 minutter ved romtemperatur og 15 minutter ved 37 ° C. Inkuber i 15 min ved RT til forsiktig å spyle ut keratinocytter ved pipettering CDS opp og ned.
    4. Samle cellesuspensjonen og gjenta spyle trinn 3 ganger med ferske DMEM.
      MERK: Dette dissosiasjon er egnet til å påvise overflaten uttrykk for HVEM. Ulempen med CDS løsningen er at færre celler er dissosiert enn med rekombinant trypsin-baserte celledissosiasjon løsning. I tillegg til overflaten uttrykk, kan nukleær eller cytoplasmisk ekspresjon, for eksempel ICP0 ekspresjon analyseres ved FACS etter dissosiering av de infiserte epidermale ark med rekombinant trypsin-baserte celledissosiasjon løsning.
  4. Dissosiasjon av epidermis å isolere keratinocytter eller exkanalen RNA
    1. Sett nyfødte epidermale ark i en 6-brønns plate med basal side mot bunnen av fatet, som inneholder 1,5 ml / brønn rekombinant trypsin-baserte celledissosiasjon løsning. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Tilsett 3 ml DMEM og distansere keratinocytter ved hjelp av en buet fin pinsett for å forsiktig flytte epidermis i retten.
    2. Samle cellesuspensjonen og gjenta dette trinnet 3 ganger med ferske DMEM. Bruk dette cellesuspensjonen til å trekke ut RNA eller til kultur primære muse keratinocytter.

3. Infeksjon av epidermal Ark med HSV-1

  1. Forbered en løsning av HSV-1 vekt belastning 17 11 i ikke mindre enn 500 mL DMEM og erstatte mediet med virus løsning som epidermal ark er flytende. Dette tidspunkt er definert som tiden 0 12. Utføre infeksjon av en epidermal ark i en brønn av en 24-brønners plate ved 37 ° C. Beregningen av virustiter er basert på estimert antallav celler i det basale lag per epidermal ark (ca. 2 x 10 5 celler pr 5 x 5 mm ark).
  2. Infisere med HSV-1 på ca 100 plakkdannende enheter (PFU) / celle og erstatte virusholdig medium med DMEM på 1 time pi
    MERK: Ved epidermal ark fra nyfødt hud, husk at laken begynner å distansere under inkubasjon.

4. Visualisering av infiserte celler

  1. Epidermal Whole Mounts 13
    1. Løs epidermale ark med 3,4% formaldehyd, enten i 2 timer ved RT, eller O / N ved 4 ° C. Vask to ganger med PBS og blokker med 0,5% melkepulver, 0.25% gelatin fra kaldtvannsfiskeskinn og 0,5% Triton X-100 i TBS i 1 time ved RT 14.
    2. Inkuber platene O / N-mus med anti-ICP0 (monoklonalt antistoff 11060) fortynnet 1:60 i 15 blokkeringsbuffer ved RT. For å visualisere det mellomliggende filamentnettverket inkubert samtidig med kanin polyklonale anti-mus keratin 14 (100 ng / ml).
    3. Vask 4 til 5 ganger med PBS-0,2% Tween 20 i løpet av 4 timer ved RT. Inkuber O / N med AF488-konjugert anti-mus IgG (1 pg / ml), AF555-konjugert anti-kanin-IgG (1 pg / ml), og DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) (100 ng / ml) i blokkeringsbuffer ved RT.
    4. Vask med PBS-0,2% Tween 20 i 4 timer ved RT. Mount epidermal ark med sine basal side på toppen av et objektglass, bygge inn i fluorescerende montering medium og dekk med dekkglass.
  2. Epidermal frysesnitt
    1. Voksen epidermale ark ble fiksert i 4% formaldehyd i PBS i 20 minutter ved romtemperatur og vasket 2 ganger med PBS. Embed fast arkene i vev frysing medium og fryse i flytende nitrogen. Skjær 8-10 mikrometer seksjoner med en cryomicrotome.
    2. Løse delene igjen med 0,5% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur, vaskes 2 ganger med PBS, blokk med 5% normalt geiteserum og 0,2% Tween 20 i PBS i 30 minutter ved romtemperatur, og deretter beis i 60 min med mOuse anti-ICP0 (monoklonalt antistoff 11060) 15 fortynnet 1:60 i blokkering buffer, etterfulgt av 3 ganger vasking med blokkeringsbuffer.
    3. Deretter inkuberes med AF488-konjugert anti-mus IgG (1 pg / ml) og DAPI (100 ng / ml) i blokkeringsbuffer i 45 minutter ved romtemperatur og vaskes 3 ganger. Embed seksjoner i fluoriserende monteringsmedium og dekk med dekkglass.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utfordringen med fremgangsmåten er å fremstille epidermale lag i hvilket HSV-1 kan trenge fra basallaget. Det kritiske trinnet er separasjon av epidermis fra dermis ved dispase II-behandling, som, avhengig av musestammen, må tilpasses. Konsentrasjonen av dispase II kan variere fra 2,5 til 5 mg / ml, og inkubasjonstiden 20-45 min. Farging av mellomfilament protein keratin 14 lett kan forutsi om basal epidermal lag kan bli smittet eller om det vil vise bare et svært begrenset antall infiserte celler (figur 2). Ideelt sett bør den keratin 14 farging av epidermale hele monteringer indikere en intakt lag av basale celler (figur 2A). I verste fall, dispase II behandlingen avbrutt basallaget og det er ingen celler farget i interfollicular epidermis som indikerer at keratin 14-uttrykkende basale keratinocytter dissosierte (figur 2B 16 (figur 2B) . Bare etter reduksjon av dispase II til 2,5 mg / ml i 30 minutter, ble en intakt basallaget erholdt som visualisert ved keratin 14 farging (figur 2C).

På grunn av den tette hårsekkene som vedheng av epidermis, er separasjon av epidermis fra dermis mest praktisk når huden er tatt fra halene til voksne mus. Alternativt kan rygghuden av nyfødte mus med utvikling av hårsekkene brukes, selv om skjørhet av arkene etter inkubering begrenser størrelsen på analyserbare områder. Hittil var det ingen forskjell i effektiviteten av HSV-1 infeksjon merke til, avhengig av hvorvidt epidermis ble tatt fra nyfødte eller voksne mus (figur 3). Hele festene på newborn epidermis visual effektiv infeksjon i interfollicular epidermis samt av de tettpakkede celler lining utviklings hårsekkene (figur 3). Mens interfollicular epidermis av voksen epidermis er effektivt smittet, blir håret bakterier og bare deler av de ytre rot kapper av hårsekkene smittet (figur 3). Talgkjertlene under hårskaftet er alltid farget, som imidlertid, på grunn av ikke-spesifikk farging av det sekundære antistoff som er vist i ikke-infiserte kontroller (figur 3).

Bruke hemmer studiene vi undersøkt, om kolesterol spiller en rolle for HSV-1 trer i epidermis. Epidermale ark av voksne mus ble forbehandlet med metyl-β-cyklodekstrin (MβCD), som tømmes kolesterol fra plasmamembranen 17-19. Før infeksjon, ble MβCD fjernet ved flere vaske tiltak for å unngå eventuelle nedbrytende effekt på kolesterolet i viral envelope. Ved forbehandling med 20 mM MβCD nesten ikke-infiserte celler ble observert i enten interfollicular epidermis eller hår bakterier, men bare den ikke-spesifikk farging av talgkjertlene var synlig (figur 4A). Som en kontroll at vevet ikke ble skadet av inhibitor behandling, la vi 500 mikrogram / ​​ml kolesterol å etterfylle MβCD-behandlede epidermal ark (Figur 4A). Denne behandlingen fullstendig restaurert infektivitet viser at forbehandlingen med inhibitoren ikke forstyrrer levedyktighet av vevet.

Ved hjelp av musemodeller vi adressert involvering av nectin-en og herpesvirus oppføring mediator (HVEM) som cellulære reseptorer for HSV-1 i epidermis 10. Begge proteiner er kjent for å virke som effektive reseptorer for HSV i forskjellige cellelinjer 20,21, og de ​​er tilstrekkelig for sykdomsutvikling i mus 22. Vi er fast bestemt epidermis-spesifikke roller nectin-en og HVEM som HSV1 reseptorer 10. Etter flytende epidermale ark fra villtype, nectin-1- eller HVEM-manglende mus med virusinneholdende medium, ble hele monteringer fremstilt i 3 timer pi for å visualisere det antall infiserte celler. Sammenligningen av de interfollicular epidermises indikerer at bare nectin-1-mangel dramatisk redusert antall ICP0-uttrykkende celler (figur 4B). I tillegg, viral spredning var temmelig begrenset i fravær av nectin-1 som vist på frysesnitt på 18 timer pi (Figur 4C). For kvantifisering av de infiserte celler, er det viktig å overvåke hvorvidt antallet infiserte celler er likt fordelt på de interfollicular epidermis eller om klynger av infiserte celler observeres. I nectin-1-manglende epidermis for eksempel infeksjon effektivitet varierte med ca. 10% infeksjon i enkelte områder, og ca. 30% i andre områder av interfollicular epidermis 10. Dermed bestemte vi oss to gir ingen antall infiserte celler for å demonstrere reduksjonen av infeksjon, men er tilstede hele monteringer som kvalitative data.

Figur 1
Figur 1:. Visualisering av infiserte celler i epidermis deler eller hele mounts Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

På toppen er en ordning som illustrerer komplett voksen hudprøver, epidermal seksjoner etter separasjon fra dermis, og epidermal hele mounts med den synlige overflaten av basal keratinocyte lag. Pilen peker mot en hårsekken og stjernen indikerer interfollicular epidermis. Hudprøver og epidermal ark fremstilt av tre uker gamle mus ble infisert med HSV-1 på ca 100 PFU / celle og fastsatt til 1,5 eller 3 hr pi Prøvene var stained med anti-ICP0 (grønt) etter at mock-infeksjon, eller ved 1,5 eller 3 timer pi å visualisere infiserte celler, og kontra av kjernene med DAPI (blå) viser alle cellene i de forskjellige lag. Som en kontroll blir mock-infiserte komp hudprøver vist i sammenligning med infiserte prøver på 3 timer pi viser ingen ICP0 farging (venstre del). Mock-infiserte eller infiserte epidermal ark fremstilt som frysesnitt vises i den midterste delen. Epidermal hele mounts infiserte for 1,5 eller 3 timer vises på den høyre delen. Bar, 25 mikrometer (frysesnitt), og 40 mikrometer (hele mounts).

Figur 2
Fig. 2: Keratin 14 farging av epidermale hele monteringer etter inkubasjon med ulike konsentrasjoner av dispase II epidermis fra C57BL / 6 eller B6.A2G-Mx1 mus ble skilt fra dermis med dispase II. Epidermal hele mounts ble farget med anti-keratin 14 (rød) og med DAPI (blå). Epidermale ark ble inkubert med 5 mg / ml (A, B) eller 2,5 mg / ml (C) dispase II i 30 minutter ved 37 ° C. Bar, 25 mikrometer. Forkortelser:. Hårsekkceller (HF), interfollicular epidermis (IFE), talgkjertel (SG) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Visualisering av ICP0 uttrykk i hele festene på nyfødte eller voksne epidermis Ordninger som illustrerer epidermal hele mounts med hårsekker eller utviklings hårsekkene, som viser den synlige overflaten av basal laget fra voksne og nyfødte epidermises hhv. Epidermal ark ble infisert med HSV-1 på ca 100 PFU / celle, og hele mounts ble farget medanti-ICP0 (grønn) og med DAPI (blå) ved 3 timer pi Som en kontroll, ble uinfiserte epidermale hele monteringer fra voksen hale hud farget bare med sekundært antistoff som viser den ikke-spesifikk farging av talgkjertlene. Bar, 25 mikrometer. Forkortelser: utvikle hårsekken (DHF), hårsekken (HF), interfollicular epidermis (IFE), talgkjertel (SG). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Vurdere virkningen av cellulære faktorer ved hjelp av enten hemmer MβCD eller nectin-1- eller HVEM-mangel epidermises (A) epidermal ark fra voksen hale huden av tre uker gamle wt mus (C57BL / 6) ble forbehandlet med MβCD (20 mM) og infisert med HSV-1 ved approxiinstans 100 PFU / celle. Som en kontroll, ble ubehandlede epidermale lag infisert, og epidermale plater forbehandlet med 35 mM MβCD ble behandlet med 500 ug / ml kolesterol før infeksjon. Epidermale hele monteringer ble farget med anti-ICP0 (grønn) og med DAPI (blå) ved 3 timer pi å demonstrere antall infiserte celler etter uttømming av kolesterol ved MβCD behandling. Som vist i figur 3, er farging av talgkjertler (SG) ikke-spesifikk. Forkortelser: HF (hårsekken), IFE (interfollicular epidermis), SG (talgkjertel). Bar, 150 mikrometer. (B) Voksen hale epidermises av vekt (C57BL / 6), nectin-1- 23, eller HVEM-mangelfull mus 24 (1 måned gammel) ble smittet på ca 100 PFU / celle. Epidermale hele monteringer ble farget med anti-ICP0 (grønn) og med DAPI (blå) ved 3 timer pi (C) frysesnitt av epidermale ark fra wt (C57BL / 6) eller nectin-1-manglende mus 23 ble farget i 18 timer pi Results vist i (B) og (C) er modifisert fra referanse 10. I A, B og C konfokale anslag og fusjonert bildene blir vist. Bar, 150 mikrometer (A), og 25 mikrometer (B, C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når epidermale ark av voksen hud fra C57BL / 6 er infisert med HSV-1 ved omtrent 100 PFU / celle, vi observerer infeksjon i nesten alle celler av basallaget i interfollicular epidermis mens lavere virusdoser korrelerer med mindre infiserte celler og en langsommere fremdriften av infeksjon. Generelt hårsekker viser et variabelt antall infiserte celler; mens de fleste av de ganske små keratinocytter lining utviklings hårsekkene blir smittet, er det bare håret kimen til den voksne hårsekken fullstendig infisert. Avhengig av hvor skånsom separasjon av epidermis ved dispase II behandlingen skrider frem, deler av hårsekkene tapt. I de fleste tilfeller er keratinocytt lagene mellom talgkjertlene og interfollicular epidermis mangler og laget fôr de ytre rot hylser kan bli forstyrret. I alle fall, kan fremgangsmåten for separering av epidermis fra dermis og infeksjon effektivitet varierer fra en musestamme til en annen (

Til sammen utfordringen av ex vivo infeksjon analysen er utarbeidelse og vedlikehold av epidermal ark. Skjørheten vevet krever svært forsiktig håndtering og styrer hvor godt vevet er bevart etter separasjon fra dermis. Et ytterligere problem er den begrensede levedyktigheten av arkene i kultur. Ettersom celleviabilitet avtar over tid, bør smitteforsøk utføres umiddelbart eller i det minste 3 timer etter fremstillingen av platene. I tillegg til den murine huden, kan epidermale lag også fremstilles fra human hud eller slimhinneprøver. Avhengig av typen og tykkelsen av epidermis, har dispase behandling må tilpasses.

Å følge løpet av infeksjon, er det mest hensiktsmessig å visualisere infiserte celler i frysesnitt. Man må huske på at med høy PFU / celle og lengre perioder med infeksjon, epidermal ark starte noen form for oppbrytersjon. På bakgrunn av den cytopatiske effekt, cellene runde opp og celle-celle-kontakter bli forstyrret. Ved 24 timer pi med 100 PFU / celle, kan noen infiserte basal celler tapt, som også kan være avhengig av dispase II behandling. Med lavere PFU / celle, kan infeksjonen ganger utvides uten å føre til alvorlig vevsskade. Alternativt, kan omfanget av skaden bli brukt som markør for hvordan patogene forskjellige virusstammer er.

Vi foretrekker å visual infiserte celler ved farging ICP0 uttrykk. Fordelen er et ganske tidlig påvisning av infiserte celler, og, basert på ICP0 fargemønster, kan cellene på et tidlig tidspunkt i løpet av infeksjonen kan skilles fra de på et avansert stadium. Alternativt kan infiserte celler bli visualisert ved farging ekspresjon av tidlige gener andre slik som det virale kapsid-proteinet VP5 og det virale kappeprotein gD.

Vi har også prøvd å visualisere innkommende viruspartikler før viral genuttrykk enten ved infEL med GFP-merket HSV-1 eller ved farging capsids i faste prøver. Ifølge vår erfaring, mønsteret av GFP-fluorescens eller fargemønsteret i vevssnitt er for komplisert å tydelig demonstrere tilstedeværelse av internviruspartikler. Alternativt kan viruspartikler bli visualisert ved elektronmikroskopi, ved høye titer av viruset ~ 1000 - 1500 PFU / celle blir brukt. Ved lavere dose virus, viruspartikler kan være nesten ikke detekteres.

I stedet for å visualisere infiserte celler i intakte epidermale lag, epidermis kan bli dissosiert for å analysere RNA-nivåer eller kvantifisere antallet celler med overflate, cytoplasmisk eller kjerne ekspresjon av gener som er av interesse ved FACS-analyse.

Vi antar at denne ex vivo infeksjon protokollen kan tilpasses i det minste til de virus som er kjent for å infisere basale keratinocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Peter Staeheli for å gi B6.A2G-MX1 mus og Semra Özçelik for teknisk rådgivning.

Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Foundation gjennom SFB829 og KN536 / 16, og Köln Fortune Program / Det medisinske fakultet, Universitetet i Köln.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX Life Technologies 31966047 needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder Roche 4942078001 has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution Sigma C5914 needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution Life Technologies 12563-029 needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin Bio-Rad 142-2832 needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin  Sigma G7765 needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) Covance PRB-155P used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-11029 used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-21429 used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml) Sigma 36670 used to counterstain the nucleus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 6th edition, 1823-1897 (2013).
  3. Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
  4. Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
  5. Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
  6. Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
  7. Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
  8. Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
  9. Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
  10. Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
  11. McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
  12. Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
  13. Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
  14. Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
  15. Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
  16. Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
  17. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
  18. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
  19. Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
  20. Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
  21. Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
  22. Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
  23. Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
  24. Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).

Tags

Immunologi Virology herpes simplex virus type 1, murine epidermis viral oppføring viral spredning
<em>Ex vivo</em> Infeksjon av murine Epidermis med Herpes simplex virus type 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rahn, E., Thier, K., Petermann, P.,… More

Rahn, E., Thier, K., Petermann, P., Knebel-Mörsdorf, D. Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1. J. Vis. Exp. (102), e53046, doi:10.3791/53046 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter