Abstract
Para introduzir o seu hospedeiro humano, vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) tem de ultrapassar a barreira de superfícies mucosas, pele e córnea. HSV-1 alvos os queratinócitos durante a entrada inicial e estabelece uma infecção primária no epitélio, que é seguida por uma infecção latente de neurónios. Após a reativação, o vírus pode tornar-se evidente em locais mucocutâneas que aparecem como vesículas ou úlceras cutâneas mucosas. Como o HSV-1 invade pele ou mucosa e atinge os seus receptores é mal compreendida. Para investigar a via de invasão de HSV-1 no tecido epidérmico, ao nível celular, estabelecemos um modelo ex vivo de infecção epiderme murino, que representa o local da infecção primária e recorrente da pele. O ensaio inclui a preparação de pele de murino. A epiderme é separada da derme por tratamento com dispase II. Depois de as folhas epidérmicas flutuante em meio contendo vírus, o tecido é fixa e a infecção pode ser visualizado em vários momentos após a infecção pelacoloração de células infectadas com um anticorpo contra o HSV-1 de proteína precoce imediata ICP0. ICP0 células que expressam podem ser observados na camada basal dos queratinócitos já em 1,5 h após a infecção. Com vezes mais longo da infecção, as células infectadas são detectados nas camadas suprabasais, indicando que a infecção não se limita aos queratinócitos basais, mas o vírus propaga-se para outras camadas no tecido. Utilizando folhas epidérmicas de vários modelos de ratinho, o protocolo de infecção permite a determinação do envolvimento de componentes celulares que contribuem para o HSV-1 no tecido invasão. Além disso, o ensaio é adequado para testar inibidores em tecidos que interferem com os passos iniciais de entrada, disseminação célula-a-célula e produção de vírus. Aqui, descrevemos o protocolo ex vivo infecção em detalhes e apresentar os nossos resultados utilizando camundongos Nectin-1- ou HVEM deficiente.
Introduction
Herpes simplex vírus (HSV) pode causar uma série de doenças em humanos de lesões mucocutâneas sem complicações leves a infecções potencialmente fatais. HSV tipo 1 (HSV-1) é predominantemente associada com infecções orofacial e encefalites, enquanto o HSV tipo 2 (HSV-2), mais provavelmente provoca infecções genitais 1. Embora haja progressos significativos na compreensão de como HSV entra nas células em cultura, inicia a infecção e produz progênie viral, sabemos pouco sobre a via de invasão viral (s) no tecido no nível celular 2. Para os estudos de HSV pele ou infecções das mucosas, ratinhos, coelhos e porquinhos da índia foram utilizados como modelos animais. Infecção da pele foi estabelecida por injecção intradérmica ou por raspagem da pele, na presença de vírus, e o desenvolvimento da doença foi correlacionada com a produção de vírus. Estes métodos ajudou a compreender vários aspectos da patogénese da doença, e são usados para avaliar as drogas antivirais. Para estudar a infecção por HSV na tissunível e, organotípicas modelos de pele humana foram aplicados. À medida que a taxa de infecção é restrita nestas culturas jangadas, apenas um número limitado de estudos que investigam a infecção, propagação virai e os efeitos dos componentes antivirais foram publicados 3-6.
A fim de caracterizar determinantes celulares que desempenham um papel durante a infecção por HSV-1 no epitélio intacto, foi estabelecido um protocolo ex vivo para estudos de infecção de epiderme 7 de murídeo. A pele foi preparada a partir de recém-nascidos ou da cauda de camundongos adultos. Uma vez que o HSV-1 não pode infectar amostras de pele completos, que foram submersas em meio contendo vírus, que separada da epiderme da derme por tratamento com dispase II. Após flutuação das folhas epidérmicas em meio contendo vírus, as células infectadas podem ser visualizados na camada basal da epiderme vários momentos após a infecção em (PI) 7. Para visualizar a iniciação da infecção em células individuais antes da replicação de um vírusND produção de vírus, é corada com um anticorpo contra a proteína de célula infectada 0 (ICP0), que é uma das primeiras proteínas expressas durante a infecção por HSV-1. A localização celular de ICP0 passa por fases distintas durante a infecção inicial. Enquanto ICP0 está presente em focos nucleares durante a fase inicial da expressão de genes virais, relocalização de ICP0 para o citoplasma indica uma fase posterior da infecção 8.
Utilizou-se o ensaio ex vivo infecção de folhas epidérmicas a partir de diferentes modelos de ratinho para testar o papel potencial de vários factores celulares durante a infecção. Para lidar com o impacto da Rac1 como um regulador chave da dinâmica de actina, que infectou os epiderme de camundongos portadores de deleção específicas de queratinócitos do gene rac1 9. Este modelo permitiu-nos estudar as consequências da deficiência Rac1 na eficiência de infecção por HSV-1 em camadas epidérmicas de queratinócitos. A comparação com epiderme infectadas da mesma ninhada de controle revealed nenhuma diferença significativa, indicando que a falta de Rac1 não teve nenhum efeito sobre o início da infecção na camada basal da epiderme 7. O uso de mais modelos de ratos nos permitiu abordar quais os receptores celulares mediar entrada para a epiderme. Infectar folhas epidérmicas a partir de qualquer Nectin-1- ou murganhos deficientes em HVEM com o HSV-1 revelou que a entrada viral inicial no tecido depende fortemente da presença de Nectin-1 10. Além disso, os nossos resultados demonstram que o HVEM pode também servir como receptor de epiderme em murinos, embora de forma menos eficiente do que Nectin-1 10.
Para abordar a distribuição espacial de células infectadas nas camadas epidérmicas, que ICP0 visualizar a expressão em secções de tecido e as peças inteiras da epiderme (Figura 1). Em criocortes de pele completa, não há células que expressam ICP0 são detectados (Figura 1). Em contraste, criocortes de folhas epidérmicas demonstrar citoplasmáticaICP0 expressão na camada basal às 3 horas já pi (Figura 1). Em tempos mais recentes, a propagação viral camadas suprabasais pode ser visualizado. A distribuição espacial de células infectadas na camada basal pode ser facilmente seguido de pele epidérmicos em montagens inteiras (Figura 1). Após a infecção com HSV-1 a 100 UFP / célula, aproximadamente 50% dos queratinócitos basais interfoliculares na epiderme mostram expressão ICP0 em 1,5 h pi Neste ponto de tempo a maioria das células infectadas expressam ICP0 nuclear. A relocalização da ICP0 para o citoplasma, indicando uma fase posterior de expressão do gene precoce está presente em quase todas as células a 3 hr pi (Figura 1). Estes modos de visualizar as células infectadas ex vivo após a infecção por HSV-1 proporcionam um ensaio poderoso para estudar o efeito de inibidores ou de excluídos / componentes celulares mutadas para a entrada virai e disseminação no tecido.
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Protocol
Declaração de ética.
A preparação de folhas epidérmicas de animais sacrificados é realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia de Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz, Renânia do Norte-Vestfália (Alemanha). O estudo foi aprovado pelo LANUV NRW (Número 8.84-02.05.20.13.018).
1. Preparação de Instrumentos e Meios de Cultura
- Cultivar folhas epidérmicas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / elevado teor de glucose contendo dipéptido glutamina, FCS a 10%, 100 IU / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina (a seguir referido como "DMEM").
- Para a preparação de folhas epidérmicas, dissolver cuidadosamente dispase II em pó (5 mg / ml) em PBS aquecido (até 37 ° C). Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um e usá-lo directamente para tratamento.
- Para a preparação de toda monta epidérmica 13, preparar o bloqueio lustreer com 0,5% de leite em pó, 0,25% de gelatina de pele de peixe de água fria e 0,5% de Triton X-100 em TBS. Permitir substâncias para dissolver por incubação da mistura durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente num misturador rotativo. Também preparar 0,2% de Tween 20 em PBS como tampão de lavagem. Para a fixação, preparar 3,4% e 4% de formaldeído em PBS.
- Para a imunocoloração de criocortes, preparar tampão de bloqueio com 5% de soro normal de cabra e 0,2% de Tween 20 em PBS. Para a fixação, preparar 0,5% de formaldeído em PBS.
2. Preparação de lâminas de epiderme da pele Murino
- Preparação da epiderme da pele recém-nascido de volta para os estudos de infecção
- Coloque um rato decapitados (1 a 3 dias após o nascimento) num prato de dissecação e cortar as extremidades e a cauda perto do tronco para permitir a remoção eficiente da pele do tronco completa. Durante a remoção das extremidades, para tentar manter os cortes tão pequena quanto possível de diâmetro.
- Corrigir o tronco curvado com uma pinça finand mover suavemente tesoura ponta romba debaixo da pele do crânio de caudal ao longo das costas de separar a pele do tronco. Slit a pele ao longo das costas.
- Para a análise FACS, o isolamento dos queratinócitos ou preparação de RNA, retire a pele completa do tronco, utilizando uma pinça para fixar o tecido e as tesouras ponta romba para empurrar o torso. Para a preparação de criosecções ou peças inteiras levar apenas pedaços de pele para trás.
- Pique a pele para trás com um bisturi em 1-2 pedaços de aproximadamente 10 x 10 mm. Coloque as peças em um poço de uma placa de 6 poços com ~ 1 ml de PBS estéril. Certifique-se de que o lado dérmico virado para o fundo.
- Substituir 1,5 ml de PBS por dispase II (5 mg / ml PBS) e incubar durante 30 min quer a 37 ° C (para as peças inteiras) ou O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS. Remova cuidadosamente a epiderme como uma folha intacta usando uma pinça para fixar a derme subjacente e os outros pinça para levantar a epiderme. Use um binóculo para dar este passo easy. Transferir a folha epidérmica em DMEM com o lado basal para o fundo. Use as folhas imediatamente para experimentos de infecção.
NOTA: Utilize a preparação da epiderme da pele recém-nascido, principalmente para análise FACS, o isolamento dos queratinócitos ou preparação de RNA. Por causa da sua fragilidade, a preparação de folhas infectadas para criossecções ou peças inteiras é menos adequado.
- Preparação da epiderme de pele da cauda de adulto para estudos de infecção
- Eutanásia dos ratos com a idade de 1 a 3 meses, por deslocamento cervical. Tome cauda em vez de pele para trás uma vez que os folículos pilosos longo embutidos na parte traseira dificultar a separação de folhas epidérmicas intactas. Corte a cauda de camundongos sacrificados e cortou-o no sentido do comprimento com um bisturi.
- Retire a pele do osso e pique-o com um bisturi em pedaços de cerca de 5 x 5 mm. Coloque até 4 peças em um bem e prosseguir com a incubação em dispase II como descrito em 2.1.5
NOTA: Use tai adultol pele para preparar criocortes ou peças inteiras. Como alternativa à utilização imediata, caudas pode ser armazenado ou transportado para, aproximadamente, 24 h a 4 ° C sem perda significativa de eficiência de infecção. Se caudas são mantidos até 48 horas, folhas epidérmicas poderia ser mal infectados com HSV-1.
- A dissociação da epiderme, para a análise por FACS
Nota: A detecção da expressão da proteína de superfície por análise de FACS requer técnicas de dissociação de células adequadas que não prejudiquem a superfície da célula e a proteína de interesse.- Incubar lâminas de epiderme recém-nascidos em uma placa de 6 poços, com o lado basal em 1,5 mL / poço recombinante solução de dissociação de células de tripsina à base durante 15 min à TA e durante 15 min a 37 ° C.
- Parar a incubação pela adição de 3 ml de DMEM. Dissociar queratinócitos utilizando uma pinça fina curvadas para mover suavemente a epiderme na placa de 6 poços de modo a que os queratinócitos se dissolvem. Recolha a suspensão de células e repetir este passo 3 vezessempre usando DMEM fresco.
NOTA: Este procedimento de dissociação é adequado para detectar Nectin-1 na superfície de queratinócitos. - Alternativamente, as folhas epidérmicas incubar em solução de dissociação de células sem enzima (CDS) durante 15 min à temperatura ambiente e 15 min a 37 ° C. Incubar mais 15 minutos à temperatura ambiente para limpar suavemente os queratinócitos pipetando CDS cima e para baixo.
- Recolha a suspensão de células e repita o passo de lavagem 3 vezes com DMEM fresco.
NOTA: Esta dissociação é adequado para detectar a expressão de superfície de HVEM. A desvantagem da solução CDS é que menos células são dissociadas com uma solução de dissociação de células recombinante baseado em tripsina. Além disso a superfície de expressão, expressão citoplasmática ou nuclear, tais como expressão ICP0 podem ser analisados por SCAF após a dissociação das folhas epidérmicas infectadas com o recombinante solução de dissociação de células de tripsina à base.
- A dissociação da epiderme para isolar queratinócitos ou exRNA trato
- Coloque folhas epidérmicas recém-nascidos em uma placa de 6 poços, com o lado basal para o fundo do prato que contém 1,5 ml / poço solução de dissociação de células recombinante baseado em tripsina. Incubar durante 30 min à TA. Adicionar 3 ml de DMEM e dissociar queratinócitos utilizando uma pinça fina curvadas para mover suavemente a epiderme do prato.
- Recolha a suspensão de células e repetir este passo 3 vezes usando fresco DMEM. Utilizar esta suspensão de células para extrair ARN ou aos queratinócitos murinos cultura primária.
3. A infecção das lâminas epidérmicas com HSV-1
- Prepara-se uma solução de HSV-1 estirpe 17 11 em peso, em não menos de 500 ul de DMEM e substituir o meio por a solução de vírus em que as folhas epidérmicas são flutuante. Este ponto de tempo é definido como o tempo 0 12. Execute infecção de uma folha epidérmica em um poço de uma placa de 24 poços a 37 ° C. O cálculo do título do vírus é baseada no número estimadode células na camada basal da epiderme por folha (de aproximadamente 2 x 10 5 células por folha de 5 x 5 mm).
- Infect com o HSV-1 em cerca de 100 unidades formadoras de placas (PFU) / célula e substituir o meio contendo vírus por DMEM a 1 hr pi
NOTA: No caso de folhas epidérmicas de pele recém-nascido, tenha em mente que as folhas começam a dissociar durante a incubação.
4. Visualização de células infectadas
- Epidérmica Whole Mounts 13
- Fix folhas epidérmicas com 3,4% de formaldeído, quer durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Lavar duas vezes com PBS e bloquear com 0,5% de leite em pó, 0,25% de gelatina de pele de peixe de água fria e 0,5% de Triton X-100 em TBS durante 1 hora à TA 14.
- Incubar as folhas de O / N com murganho anti-ICP0 (anticorpo monoclonal 11060) 15 diluída 1:60 em tampão de bloqueio à temperatura ambiente. Para a visualização da rede intermédia de filamentos simultaneamente incubar com anticorpo policlonal de coelho anti-rato queratina 14 (100 ng / mL).
- Lavar 4 a 5 vezes com PBS-Tween 20 a 0,2% durante 4 horas à temperatura ambiente. Incubar O / N com AF488-conjugado anti-IgG de ratinho (1 mg / ml), AF555-conjugado anti-IgG de coelho (1 ug / ml), e DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng / ml) em tampão de bloqueio à temperatura ambiente.
- Lavar com PBS-0,2% de Tween 20, durante 4 h à TA. Folhas epidérmicas Monte com o seu lado basal em cima de uma lâmina de amostra, incorporar no meio de montagem fluorescente e cobrir com lamelas.
- Epidérmica Cortes congelados
- Folhas epidérmicas mediana foram fixadas em formaldeído a 4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente e lavou-se 2 vezes com PBS. Folhas fixas Incorporar em tecido de congelação médio e congelamento em nitrogênio líquido. Corte 8-10 mm seções com um cryomicrotome.
- Fixar as secções mais uma vez com 0,5% de formaldeído em PBS durante 10 min à temperatura ambiente, lava-se 2 vezes com PBS, bloco com 5% de soro normal de cabra e 0,2% de Tween 20 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, e em seguida corar durante 60 min com mouse anti-ICP0 (anticorpo monoclonal 11060) 15 diluída 1:60 em tampão de bloqueio, seguido por lavagem 3 vezes com tampão de bloqueio.
- Em seguida incubar com anti-IgG de ratinho conjugado com AF488 (1 ug / ml) e DAPI (100 ng / ml) em tampão de bloqueio durante 45 minutos à temperatura ambiente e lava-se 3 vezes. Seções incorporar em meio de montagem fluorescente e cobrir com lamelas.
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Representative Results
O desafio do método é o de preparar as folhas epidérmicas em que o HSV-1 pode penetrar a partir da camada basal. O passo crítico é a separação da epiderme da derme por tratamento com dispase II, que, dependendo da estirpe de ratinho, deve ser adaptado. A concentração de dispase II pode variar de 2.5 a 5 mg / ml, e o tempo de incubação de 20 a 45 min. A coloração da proteína de filamento intermediário queratina 14 permite prever prontamente se a camada basal da epiderme pode ser infectado ou se irá mostrar apenas um número muito limitado de células infectadas (Figura 2). Idealmente, a queratina 14, a coloração de montagens inteiras epidérmicas deve indicar uma camada intacta de células basais (Figura 2A). No pior dos casos, o tratamento com dispase II interrompida da camada basal e que não existem células coradas na epiderme interfoliculares indicando que a queratina 14-expressando queratinócitos basais são dissociadas (Figura 2B B6.A2G-16 (Figura 2B) . Só após a redução de dispase II a 2,5 mg / ml durante 30 min, uma camada basal intacta foi obtido como visualizado por coloração de queratina 14 (Figura 2C).
Por causa dos folículos pilosos densas como apêndices da epiderme, a separação da epiderme da derme é mais conveniente quando a pele é retirado dos caudas de ratos adultos. Alternativamente, para trás da pele de ratos recém-nascidos com o desenvolvimento de folículos de cabelo pode ser usado, embora a fragilidade das folhas após incubação limita o tamanho das áreas de analisáveis. Até agora, não houve diferença na eficiência de infecção por HSV-1 foi notado dependendo se epiderme foi feita a partir de ratos recém-nascidos ou adultas (Figura 3). Montagens inteiras de newboepiderme rn visualizar infecção eficiente da epiderme interfoliculares, bem como das células densamente compactadas que revestem os folículos capilares em desenvolvimento (Figura 3). Enquanto a epiderme interfoliculares de epiderme adultos está infectado de forma eficiente, germes de cabelo e apenas partes das bainhas externa da raiz dos folículos pilosos são infectadas (Figura 3). As glândulas sebáceas por baixo do eixo do cabelo são sempre corados, que é, no entanto, devido a coloração não específica do anticorpo secundário como mostrado em controlos não infectados (Figura 3).
Utilizando estudos de inibidor foi investigado, se o colesterol desempenha um papel para o HSV-1 entrada em epiderme. Folhas epidérmicas de ratos adultos foram pré-tratados com metil-β-ciclodextrina (MβCD), que esgota o colesterol da membrana plasmática 17-19. Antes da infecção, MβCD foi removido por vários passos de lavagem, para evitar qualquer efeito de empobrecimento em colesterol no Envel viralope. Após pré-tratamento com 20 mM de MβCD quase células não infectadas foram observadas em ambas as epiderme interfoliculares ou germes de cabelo, mas apenas a coloração não específica das glândulas sebáceas era visível (Figura 4A). Como um controlo que não o tecido foi danificado por tratamento com inibidor, foram adicionados 500 ug / ml de colesterol para repor as folhas epidérmicas tratados com MβCD (Figura 4A). Este tratamento completamente restaurado infecciosidade demonstrando que o pré-tratamento com o inibidor de não interferir com a viabilidade do tecido.
Utilizando modelos de murganho que dirigiu-se ao envolvimento de Nectin-1 e mediador entrada herpesvirus (HVEM) como receptores celulares para o HSV-1 em 10 epiderme. Ambas as proteínas são conhecidas por actuarem como receptores eficientes para o HSV em várias linhas celulares de 20,21, e que são suficientes para o desenvolvimento da doença em ratos 22. Nós determinamos os papéis de Nectin-1 e HVEM epiderme específicas como HSV1 receptores 10. Após flutuante folhas epidérmicas a partir de tipo selvagem, Nectin-1- ou HVEM-ratinhos deficientes em meio contendo vírus, as peças inteiras foram preparados em 3 h PI para visualizar o número de células infectadas. A comparação das epidermes interfoliculares indica que apenas Nectin-1 deficiência reduzida drasticamente o número de células que expressam ICP0 (Figura 4B). Além disso, a propagação viral era bastante limitada na ausência de Nectin-1 como mostrado na criocortes em 18 hr pi (Figura 4C). Para a quantificação das células infectadas, é importante verificar se o número de células infectadas é igualmente distribuída entre a epiderme interfoliculares ou se aglomerados de células infectadas são observados. Na epiderme Nectin-1-deficiente, por exemplo, a eficiência da infecção variou com aproximadamente 10% de infecção em algumas áreas e cerca de 30% em outras áreas da epiderme interfoliculares 10. Assim, decidimos to dar nenhum número de células infectadas para demonstrar a diminuição da infecção, mas apresentam peças inteiras como dados qualitativos.
Figura 1:. Visualização de células infectadas em seções epidérmicas ou peças inteiras Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Na parte superior é um esquema ilustrando amostras de pele completa adulto, as secções de pele epidérmicos após a separação da derme, epiderme e as peças inteiras com a superfície visível da camada basal de queratinócitos. A seta aponta para um folículo piloso e da estrela indica a epiderme interfoliculares. As amostras de pele epidérmicos e folhas preparadas a partir de 3 semanas de ratos velhos foram infectados com HSV-1 em cerca de 100 PFU / célula e fixado em 1,5 ou 3 amostras hr pi foram Stained com anti-ICP0 (verde) pós-infecção simulada ou a 1,5 ou 3 hr pi para visualizar as células infectadas, e contracoloração dos núcleos com DAPI (azul) demonstra todas as células nas várias camadas. Como um controlo, as amostras de pele falsamente infectadas completas são mostrados em comparação com amostras infectadas a 3 hr pi demonstrando nenhuma coloração ICP0 (parte esquerda). Folhas epidérmicas falsamente infectadas ou infectadas preparados como criocortes são mostradas na parte média. Epidérmicas peças inteiras infectadas para 1,5 ou 3 horas são mostradas na parte direita. Bar, 25 uM (criocortes), e 40 ^ m (as peças inteiras).
Figura 2:. Queratina 14 coloração da epiderme peças inteiras após incubação com diferentes concentrações de dispase II Epidermis de ratinhos C57BL / 6 ou ratinhos B6.A2G-Mx1 foi separada da derme com dispase II. Epidérmicas peças inteiras foram coradas com anti-keratin 14 (vermelho) e com DAPI (azul). Folhas epidérmicas foram incubadas com 5 mg / ml (A, B) ou 2,5 mg / ml (C) dispase II durante 30 min a 37 ° C. Bar, de 25 um. Abreviaturas:. Folículo piloso (HF), epiderme interfoliculares (IFE), glândula sebácea (SG) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. A visualização de expressão ICP0 em peças inteiras de epiderme recém-nascido ou adulto Esquemas ilustram epidérmicas peças inteiras com folículos pilosos ou desenvolvimento folículos pilosos, que mostra a superfície visível da camada basal de adultos e recém-nascidos epidermes, respectivamente. Folhas epidérmicas foram infectados com HSV-1 em cerca de 100 PFU / célula, e as peças inteiras foram coradas comanti-ICP0 (verde) e com DAPI (azul) a 3 hr pi Como um controlo, as peças inteiras epidérmicas não infectadas de pele da cauda adulto foram coradas apenas com o anticorpo secundário demonstrando a coloração não específica das glândulas sebáceas. Bar, de 25 um. Abreviaturas: desenvolvimento folículo piloso (FHD), folículo piloso (HF), epiderme interfoliculares (IFE), glândula sebácea (SG). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Avaliar o impacto de fatores celulares usando o MβCD inibidor ou Nectin-1- ou epidermes HVEM deficientes (A) folhas epidérmicas de pele da cauda adulto de 3 semanas de idade ratinhos wt (C57BL / 6) foram pré-tratados com MβCD (20 mM) e infectados com HSV-1 a aproximadamente 100 UFP / célula. Como um controlo, as folhas epidérmicas foram infectados não tratados e pré-tratados com folhas epidérmicas MβCD 35 mM foram tratados com 500 ug / ml de colesterol antes da infecção. Epidérmicos peças inteiras foram coradas com anti-ICP0 (verde) e com DAPI (azul) a 3 hr pi para demonstrar o número de células infectadas após a depleção de colesterol por tratamento MβCD. Como mostrado na Figura 3, a coloração das glândulas sebáceas (SG) é não específico. Abreviaturas: HF (folículo piloso), IFE (epiderme interfoliculares), SG (glândulas sebáceas). Bar, a 150 uM. (B) epidermes cauda de peso Adulto (C57BL / 6), Nectin-1- 23, ou HVEM deficiente em ratinhos 24 (1-mês de idade) foram infectadas com aproximadamente 100 PFU / célula. Epidérmicas peças inteiras foram coradas com anti-ICP0 (verde) e com DAPI (azul) a 3 pi hr (C) Cortes congelados de folhas epidérmicas de peso (C57BL / 6) ou Nectin-1-deficiente ratinhos 23 foram coradas em 18 horas pi ResÜLTS mostrados em (B) e (C) são modificados de referência 10. Em A, B e C e projecções confocal fundidas imagens são mostradas. Bar, 150 mm (A), e 25 mm (B, C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Quando as folhas epidérmicas da pele de um adulto de ratinhos C57BL / 6 são infectadas com HSV-1 em cerca de 100 PFU / célula, observa-se infecção em quase todas as células da camada basal da epiderme interfoliculares enquanto que doses de vírus mais baixos correlacionam-se com as células menos infectados e um mais lento o progresso da infecção. Em geral, os folículos de cabelo mostram um número variável de células infectadas; enquanto a maioria dos queratinócitos bastante pequenas que revestem os folículos pilosos em desenvolvimento estão infectados, apenas o germe cabelo do folículo piloso adulto é completamente infectado. Dependendo de como a separação suave da epiderme por tratamento dispase II prossegue, as partes dos folículos capilares se perder. Na maioria dos casos, as camadas de queratinócitos entre as glândulas sebáceas e a epiderme interfoliculares estão ausentes e a camada que reveste as bainhas externa da raiz pode ser interrompido. Em qualquer caso, o processo de separar a epiderme da derme e da eficiência da infecção pode variar de uma para outra estirpe de ratinho ( Tomados em conjunto, o desafio de infecção do ensaio ex vivo é a preparação e manutenção das folhas epidérmicas. A fragilidade do tecido requer um tratamento muito cuidadoso e controla a forma como o tecido é preservado após a separação da derme. Uma outra questão é a viabilidade limitada das folhas na cultura. Uma vez que a viabilidade celular diminui ao longo do tempo, as experiências de infecção deve ser realizada imediatamente ou, pelo menos, 3 horas após a preparação das folhas. Além da pele de murino, as folhas epidérmicas podem também ser preparados a partir de amostras de pele ou mucosa humana. Dependendo da natureza e a espessura da epiderme, o tratamento dispase tem de ser adaptado. Para seguir o curso da infecção, é mais adequado para visualizar as células infectadas em criocortes. Um tem que ter em mente que, com alta UFP / célula e mais longos tempos de infecção, as folhas epidérmicas iniciar algum tipo de disintegração. Com base no efeito citopático, as células arredondar para cima e os contactos célula-célula são interrompidos. Por 24 hr pi com 100 UFP / célula, algumas células basais infectadas pode se perder, o que pode também depender do tratamento dispase II. Com menor UFP / célula, os tempos de infecção pode ser estendido sem levar a danos teciduais graves. Alternativamente, a extensão do dano pode ser usado como marcador de como diversas estirpes de vírus patogénicos são. Nós preferimos a visualizar as células infectadas por coloração expressão ICP0. A vantagem é uma detecção muito cedo de células infectadas, e, com base no padrão de coloração ICP0, as células numa fase precoce durante a infecção pode ser distinguido dos que estão em fase avançada. Alternativamente, as células infectadas podem ser visualizadas por coloração expressão de outros genes precoces, tais como a proteína VP5 cápside virai e a proteína gD de envelope virai. Nós também tentamos visualizar partículas de vírus de entrada antes da expressão gênica viral, quer por infexão com GFP HSV-1 ou cápsides através de coloração em amostras fixadas. Segundo a nossa experiência, o padrão de fluorescência de GFP-ou o padrão de coloração nas secções de tecido são demasiado complexo para demonstrar claramente a presença de partículas virais interiorizados. Alternativamente, partículas do vírus podem ser visualizadas por microscopia eletrônica, quando títulos elevados de vírus de ~ 1.000 - 1.500 UFP / célula são usados. No caso da dose de vírus inferior, partículas virais podem ser dificilmente detectado. Em vez de visualizar as células infectadas em folhas epidérmicas intactas, a epiderme pode ser dissociado para analisar os níveis de ARN ou quantificar o número de células com a superfície, a expressão citoplasmática ou nuclear de genes de interesse por análise de FACS. Assume-se que este protocolo de infecção ex vivo pode ser adaptado, pelo menos para aqueles vírus que são conhecidos por infectar queratinócitos basais.
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Acknowledgments
Agradecemos a Peter Staeheli para a prestação de ratos B6.A2G-MX1 e Semra Özcelik para assessoria técnica.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa através SFB829 e KN536 / 16, eo Köln Fortune Programa / Faculdade de Medicina da Universidade de Colónia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 6th edition, 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
