Abstract
Para entrar en su huésped humano, virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) debe superar la barrera de la mucosa superficies, la piel o córnea. HSV-1 Objetivos queratinocitos durante la entrada inicial y establece una infección primaria en el epitelio, que es seguido por la infección latente de las neuronas. Después de la reactivación, los virus pueden ser evidentes en los sitios de mucocutáneas que aparecen como vesículas en la piel o úlceras de la mucosa. Cómo HSV-1 invade la piel o la mucosa y llega a sus receptores es poco conocido. Para investigar la ruta invasión de HSV-1 en el tejido epidérmico en el nivel celular, se estableció un modelo ex vivo de la infección epidermis murino, que representa el sitio de la infección primaria y recurrente en la piel. El ensayo incluye la preparación de la piel murina. La epidermis se separa de la dermis mediante el tratamiento dispasa II. Después de que las láminas epidérmicas que flota en el medio que contiene el virus, el tejido es fija y la infección puede ser visualizado en diversos momentos después de la infección portinción de las células infectadas con un anticuerpo contra el HSV-1 ICP0 proteína inmediata temprana. -Expresión de ICP0 células se puede observar en la capa basal de queratinocitos ya en 1,5 hr después de la infección. Con tiempos más largos de infección, las células infectadas se detectan en las capas suprabasales, lo que indica que la infección no se limita a los queratinocitos basales, pero el virus se propaga a otras capas en el tejido. El uso de láminas epidérmicas de varios modelos de ratón, el protocolo de la infección permite la determinación de la implicación de los componentes celulares que contribuyen a HSV-1 invasión en el tejido. Además, el ensayo es adecuado para poner a prueba inhibidores en el tejido que interfieren con los pasos iniciales de entrada, propagación de célula a célula y la producción de virus. Aquí se describe el protocolo ex vivo infección en detalle y presentamos nuestros resultados utilizando ratones nectin-1- o Hvem deficiente.
Introduction
El virus del herpes simple (VHS) puede causar una serie de enfermedades en los seres humanos a partir de lesiones mucocutáneas sin complicaciones leves a las infecciones que amenazan la vida. HSV tipo 1 (HSV-1) está predominantemente asociado con las infecciones orofaciales y la encefalitis, mientras que HSV tipo 2 (HSV-2) más probable causa infecciones genitales 1. Si bien hay un avance significativo en la comprensión de cómo el VHS entra en las células en cultivo, se inicia la infección y produce progenie viral, sabemos poco sobre la vía viral invasión (s) en el tejido a nivel celular 2. Para los estudios de la piel HSV o infecciones de las mucosas, ratones, conejos y cobayas se han utilizado como modelos animales. Infección de la piel fue establecida por la inyección intradérmica o por el rascado de la piel en la presencia de virus, y desarrollo de la enfermedad se correlacionó con la producción de virus. Estos métodos ayudaron a entender varios aspectos de la patogénesis de la enfermedad, y se utilizan para evaluar fármacos antivirales. Para estudiar la infección por HSV en el tissuNivel E, se han aplicado modelos de piel humana organotípicos. A medida que la tasa de infección está restringida de estas culturas balsa, sólo un número limitado de estudios de investigación de la infección, propagación viral y los efectos de los componentes antivirales han sido publicados 3-6.
Para caracterizar determinantes celulares que juegan un papel en la infección por HSV-1 en el epitelio intacto, hemos establecido un protocolo para estudios ex vivo de infección de la epidermis murinos 7. Se preparó a partir de la piel recién nacidos o de las colas de ratones adultos. Desde HSV-1 no podía infectar muestras de piel completas, que fueron sumergidos en un medio que contiene el virus, separamos la epidermis de la dermis mediante el tratamiento dispasa II. Después de flotación de las hojas epidérmicas en un medio que contiene el virus, las células infectadas se pueden visualizar en la capa basal de la epidermis en las varias horas después de la infección (pi) 7. Para visualizar el inicio de la infección en las células individuales antes de la replicación viral de unand producción de virus, se tiñeron con un anticuerpo contra la proteína de las células infectadas 0 (ICP0), que es una de las primeras proteínas expresadas durante HSV-1 infección. La localización celular de ICP0 pasa a través de fases distintas durante la infección temprana. Mientras ICP0 está presente en focos nucleares durante una etapa temprana de la expresión génica viral, relocalización de ICP0 al citoplasma indica una fase posterior de la infección 8.
Se utilizó el ensayo ex vivo infección de láminas epidérmicas de diferentes modelos de ratón para probar el papel potencial de diversos factores celulares durante la infección. Para hacer frente al impacto de Rac1 como un regulador clave de la dinámica de la actina, estamos infectados la epidermis de ratones con una deleción-queratinocitos específica del gen Rac1 9. Este modelo nos permitió estudiar las consecuencias de la deficiencia de Rac1 en la eficiencia de HSV-1 infección en capas de queratinocitos epidérmicos. La comparación con la epidermis infectados de camada de control rerevelado ninguna diferencia significativa, lo que indica que la ausencia de Rac1 no tuvo efecto sobre la iniciación de la infección en la capa basal de la epidermis 7. El uso de otros modelos de ratón nos ha permitido abordar la cual los receptores celulares median entrada en la epidermis. La infección de láminas epidérmicas de cualquiera nectin-1- o ratones deficientes en Hvem con HSV-1 reveló que la entrada viral inicial en el tejido depende fuertemente de la presencia de nectin-1 10. Además, nuestros resultados demuestran que Hvem también puede servir como receptor en la epidermis murinos, aunque menos eficiente que nectin-1 10.
Para hacer frente a la distribución espacial de las células infectadas en las capas epidérmicas, visualizamos expresión ICP0 en secciones de tejido y los montajes enteros epidérmico (Figura 1). En cryosections de piel completa, no hay células que expresan ICP0 se detectan (Figura 1). En contraste, cryosections de láminas epidérmicas demuestran citoplásmicaICP0 expresión en la capa basal ya a las 3 horas pi (Figura 1). En épocas posteriores, virus se propague a suprabasal capas se puede visualizar. La distribución espacial de las células infectadas en la capa basal se puede seguir fácilmente en preparaciones completas epidérmico (Figura 1). Tras la infección con HSV-1 en 100 PFU / célula, aproximadamente el 50% de los queratinocitos basales de la epidermis interfolicular muestran expresión ICP0 en 1,5 hr pi En este punto de tiempo de las células infectadas expresan más ICP0 nuclear. La relocalización de ICP0 al citoplasma que indica una etapa posterior de la expresión génica temprana está presente en casi todas las células en 3 pi hr (Figura 1). Estos modos de visualización de las células infectadas ex vivo sobre HSV-1 infección proporcionan un poderoso ensayo para estudiar el efecto de los inhibidores o de componentes celulares mutados eliminados / en la entrada viral y la propagación en el tejido.
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Protocol
Declaración de Ética.
La preparación de láminas epidérmicas de los animales sacrificados se lleva a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía de Landesamt für Natur, Umwelt y Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia (Alemania). El estudio fue aprobado por LANUV NRW (Número 8.84-02.05.20.13.018).
1. Preparación de los instrumentos y medios de cultivo
- Cultivar láminas epidérmicas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / alto contenido de glucosa que contiene dipéptido glutamina, 10% de FCS, 100 IU / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina (denominado en lo sucesivo "DMEM").
- Para la preparación de láminas epidérmicas, disolver cuidadosamente dispasa II polvo (5 mg / ml) en PBS climatizada (hasta 37 ° C). Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras y utilizarlo directamente para el tratamiento.
- Para la preparación de toda epidérmica monta 13, el bloqueo de buff prepararer con 0,5% de leche en polvo, 0,25% de gelatina de piel de pescado de agua fría y 0,5% de Triton X-100 en TBS. Permitir que las sustancias se disuelvan mediante la incubación de la mezcla durante al menos 2 horas a RT en un mezclador giratorio. También hay que preparar 0,2% de Tween 20 en PBS como tampón de lavado. Para la fijación, preparar 3,4% y 4% de formaldehído en PBS.
- Para la inmunotinción de criosecciones, preparar tampón de bloqueo con 5% de suero normal de cabra y 0.2% Tween 20 en PBS. Para la fijación, preparar 0,5% de formaldehído en PBS.
2. Preparación de láminas epidérmicas de la piel murina
- Preparación de la epidermis de la piel de la espalda del recién nacido para los estudios de infección
- Coloque un ratón decapitado (1 a 3 días después del nacimiento) en un plato de disección y cortar las extremidades y la cola cerca del torso para permitir la eliminación eficaz de la piel contra el torso completo. Durante la eliminación de las extremidades, trate de mantener los recortes lo más pequeña posible de diámetro.
- Fijar el torso con curva pinzas finas unnd mueva suavemente tijeras de punta roma debajo de la piel de craneal a caudal a lo largo de la espalda para separar la piel del torso. Corte la piel a lo largo de la parte posterior.
- Para el análisis FACS, el aislamiento de los queratinocitos o preparación de ARN, pelar la piel completa del torso utilizando pinzas para fijar el tejido y las tijeras de punta roma para empujar el torso. Para la preparación de cryosections o montajes enteros tomar sólo piezas de la piel de la espalda.
- Picar la piel de la espalda con un bisturí en 1-2 trozos de aproximadamente 10 x 10 mm. Ponga los pedazos en un pocillo de una placa de 6 pocillos con ~ 1 ml de PBS estéril. Asegúrese de que el lado dérmico se enfrenta a la parte inferior.
- Reemplace PBS por 1,5 ml de dispasa II (5 mg / ml de PBS) y se incuba durante cualquiera de 30 minutos a 37 ° C (para montajes enteros) o O / N a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBS. Retire suavemente la epidermis como una hoja intacta usando uno pinzas para fijar la dermis subyacente y las otras pinzas para levantar la epidermis. Utilice un binocular para hacer este paso easy. La transferencia de la hoja epidérmica en DMEM con su lado basal hacia la parte inferior. Utilice las hojas de inmediato para experimentos de infección.
NOTA: Utilice la preparación de la epidermis de la piel del recién nacido principalmente para el análisis FACS, el aislamiento de los queratinocitos o preparación de ARN. Debido a su fragilidad, la preparación de hojas infectadas de cryosections o montajes enteros es menos adecuado.
- Preparación de la epidermis de la piel de la cola de adultos para estudios de infección
- La eutanasia a los ratones a la edad de 1 a 3 meses por dislocación cervical. Tome la cola en lugar de piel de la espalda ya que los folículos del pelo largo incrustados en la parte posterior dificultan la separación de láminas epidérmicas intactas. Cortar la cola de los ratones sacrificados y raja longitudinalmente con un bisturí.
- Despegar la piel del hueso y cortar con un bisturí en trozos de unos 5 x 5 mm. Ponga hasta 4 piezas en un solo bien y proceder a la incubación en dispasa II como se describe en 2.1.5
NOTA: El uso del tai adultosl piel para preparar cryosections o montajes enteros. Como alternativa a la utilización inmediata, las colas pueden ser almacenados o transportados por aproximadamente 24 horas a 4 ° C sin perder eficiencia de infección significativo. Si sale cruz se mantienen hasta 48 horas, láminas epidérmicas podrían apenas infectadas con HSV-1.
- La disociación de la epidermis para el análisis FACS
NOTA: La detección de la superficie de la proteína de expresión por análisis FACS requiere técnicas de disociación de células apropiadas que no dañan la superficie celular y la proteína de interés.- Incubar láminas epidérmicas recién nacido en una placa de 6 pocillos con la parte basal de 1,5 ml / solución de disociación celular bien recombinante basado en tripsina durante 15 min a TA y durante 15 min a 37 ° C.
- Detener la incubación mediante la adición de 3 ml de DMEM. Disociar queratinocitos utilizando una curva pinzas finas para mover suavemente la epidermis de la placa de 6 pocillos para que los queratinocitos se disuelven. Recoger la suspensión celular y repita este paso 3 vecessiempre utilizando DMEM fresco.
NOTA: Este procedimiento de disociación es adecuada para detectar nectin-1 en la superficie de los queratinocitos. - Alternativamente, se incuban las láminas epidérmicas en solución de disociación celular libre de enzimas (CDS) durante 15 min a RT y 15 min a 37 ° C. Incubar otros 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar suavemente los queratinocitos pipeteando CDS arriba y hacia abajo.
- Recoger la suspensión de células y repetir el paso de lavado 3 veces utilizando DMEM fresco.
NOTA: Esta disociación es adecuada para detectar la expresión superficial de Hvem. La desventaja de la solución CDS es que menos células se disocian con una solución de disociación celular a base de tripsina recombinante. Además de la superficie expresión, expresión nuclear o citoplásmica tal como la expresión ICP0 se puede analizar por FACS después de la disociación de las láminas epidérmicas infectados con solución de disociación celular a base de tripsina recombinante.
- La disociación de la epidermis para aislar queratinocitos o exARN del tracto
- Ponga láminas epidérmicas recién nacidos en una placa de 6 pocillos con el lado basal hacia el fondo del plato, que contiene 1,5 ml / solución de disociación celular a base de tripsina bien recombinante. Incubar durante 30 min a TA. Añadir 3 ml de DMEM y disociar los queratinocitos utilizando un curvadas unas pinzas finas para mover suavemente la epidermis en el plato.
- Recoger la suspensión celular y repita este paso 3 veces con DMEM fresco. Utilice esta suspensión de células para extraer el ARN o a los queratinocitos murinos cultivo primario.
3. La infección de las láminas epidérmicas con HSV-1
- Preparar una solución de HSV-1 cepa en peso 17 11 en no menos de 500 l DMEM y reemplazar el medio por la solución de virus en la que las láminas epidérmicas están flotando. Este punto de tiempo se define como tiempo 0 12. Efectuar la infección de una hoja epidérmica en un pocillo de una placa de 24 pocillos a 37 ° C. El cálculo de la concentración de virus se basa en el número estimadode las células en la capa basal epidérmica por hoja (aproximadamente 2 x 10 5 células por 5 x 5 mm hoja).
- Infectar con HSV-1 a aproximadamente 100 unidades formadoras de placa (UFP) / célula y reemplazar el medio que contiene el virus por DMEM a 1 hr pi
NOTA: En caso de láminas epidérmicas de la piel del recién nacido, tenga en cuenta que las hojas comienzan a disociarse durante la incubación.
4. Visualización de las células infectadas
- Epidérmico Whole Mounts 13
- Fijar láminas epidérmicas con 3,4% de formaldehído o bien durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Lavar dos veces con PBS y bloquear con 0,5% de leche en polvo, 0,25% de gelatina de piel de pescado de agua fría y 0,5% de Triton X-100 en TBS durante 1 h a RT 14.
- Incubar las hojas de O / N con el ratón anti-ICP0 (anticuerpo monoclonal 11060) 15 diluido 1:60 en tampón de bloqueo a temperatura ambiente. Para visualizar el red de filamentos intermedios se incuba simultáneamente con policlonal de conejo anti-queratina ratón 14 (100 ng / ml).
- Lavar 4 a 5 veces con PBS-Tween 20 0,2% durante 4 horas a RT. Incubar O / N con AF488-conjugado anti-IgG de ratón (1 mg / ml), IgG anti-conejo-AF555 conjugado (1 mg / ml), y DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) (100 ng / ml) en tampón de bloqueo a temperatura ambiente.
- Lavar con PBS-Tween 20 0,2% durante 4 horas a RT. Láminas epidérmicas de montaje con su parte basal en la parte superior de un portaobjetos, incrustar en medio de montaje fluorescente y cubren con cubreobjetos.
- Epidérmico criosecciones
- Láminas epidérmicas adultos fueron fijadas en formaldehído al 4% en PBS durante 20 min a TA y se lavaron 2 veces con PBS. Hojas fijas Insertar en el tejido medio de congelación y congelación en nitrógeno líquido. Cortar 8-10 micras secciones con un criomicrotomo.
- Fijar las secciones de nuevo con 0,5% de formaldehído en PBS durante 10 min a TA, se lava 2 veces con PBS, bloque con 5% de suero normal de cabra y 0.2% Tween 20 en PBS durante 30 min a TA, y luego manchar durante 60 min con mouse anti-ICP0 (anticuerpo monoclonal 11060) 15 diluido 1:60 en tampón de bloqueo, seguido de lavado 3 veces con el tampón de bloqueo.
- A continuación, se incuba con AF488-conjugado anti-IgG de ratón (1 mg / ml) y DAPI (100 ng / ml) en tampón de bloqueo durante 45 min a TA y lavar 3 veces. Insertar secciones en medio de montaje fluorescente y cubrir con cubreobjetos.
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Representative Results
El reto del método es para preparar láminas epidérmicas en el que HSV-1 puede penetrar desde la capa basal. El paso crítico es la separación de la epidermis de la dermis mediante el tratamiento dispasa II, que, dependiendo de la cepa de ratón, necesita ser adaptado. La concentración de dispasa II puede variar de 2,5 a 5 mg / ml, y el tiempo de incubación de 20 a 45 min. La tinción de la proteína de filamentos intermedios de queratina 14 permite fácilmente predecir si la capa epidérmica basal puede estar infectada o si va a mostrar sólo un número muy limitado de células infectadas (Figura 2). Idealmente, la queratina 14 tinción de preparaciones completas epidérmicas debe indicar una capa intacta de células basales (Figura 2a). En el peor de los casos, el tratamiento dispasa II interrumpe la capa basal y no hay células teñidas en la epidermis interfolicular que indican que la queratina 14-expresión de los queratinocitos basales se disocian (Figura 2B B6.A2G-16 (Figura 2B) . Sólo después de la reducción de dispasa II a 2,5 mg / ml durante 30 min, se obtuvo una capa basal intacta como se visualiza por la queratina 14 tinción (Figura 2C).
Debido a los folículos del pelo denso como apéndices de la epidermis, la separación de la epidermis de la dermis es más conveniente cuando la piel se toma de las colas de ratones adultos. Alternativamente, la espalda de la piel de ratones recién nacidos con el desarrollo de los folículos pilosos se puede utilizar, aunque la fragilidad de las hojas después de la incubación limita el tamaño de las áreas analizables. Hasta el momento, no hay diferencia en la eficiencia de la infección por HSV-1 se observó en función de si epidermis fue tomado de ratones recién nacidos o adultos (Figura 3). Montajes enteros de reciéepidermis rn visualizar la infección eficiente de la epidermis interfolicular, así como de las células densamente empaquetadas que revisten los folículos pilosos en desarrollo (Figura 3). Mientras que la epidermis interfoliculares de la epidermis para adultos está infectado de manera eficiente, los gérmenes de pelo y sólo partes de las vainas radiculares externas de los folículos pilosos están infectadas (Figura 3). Las glándulas sebáceas debajo del eje del pelo siempre están manchadas, que es, sin embargo, debido a la tinción no específica del anticuerpo secundario como se muestra en los controles no infectados (Figura 3).
El uso de inhibidores de estudios de investigación que hemos realizado, si el colesterol juega un papel para el VHS-1 entrada en la epidermis. Láminas epidérmicas de los ratones adultos fueron pretratados con metil-β-ciclodextrina (MβCD), que agota el colesterol de la membrana plasmática 17-19 de. Antes de la infección, MβCD se eliminó por varias etapas de lavado para evitar cualquier efecto ozono sobre el colesterol en el envel viralope. Tras la pre-tratamiento con 20 mM MβCD casi células no infectadas fueron observados ya sea en la epidermis interfolicular o gérmenes de pelo, pero sólo la tinción no específica de las glándulas sebáceas era visible (Figura 4A). Como control que el tejido no fue dañada por el tratamiento con inhibidor, hemos añadido 500 g / ml de colesterol para reponer las láminas epidérmicas tratados con MβCD (figura 4A). Este tratamiento completamente restaurado infectividad lo que demuestra que el pretratamiento con el inhibidor no interfirió con la viabilidad del tejido.
El uso de modelos de ratón se abordó la participación de nectin-1 y mediador entrada herpesvirus (Hvem) como receptores celulares para el VHS-1 en la epidermis 10. Ambas proteínas son conocidos por actuar como receptores eficientes para HSV en diversas líneas celulares 20,21, y son suficientes para el desarrollo de la enfermedad en ratones 22. Determinamos los papeles de nectin-1 y Hvem epidermis específicas como HSV-1 receptores 10. Después de láminas epidérmicas flotante de tipo salvaje, nectin-1- o Hvem ratones deficientes en un medio que contiene el virus, preparaciones completas se prepararon a 3 hr pi para visualizar el número de células infectadas. La comparación de las epidermis interfolicular indica que sólo nectin-1 deficiencia reduce drásticamente el número de células que expresan ICP0 (Figura 4B). Además, la propagación viral era bastante limitado en ausencia de nectin-1 como se muestra en criosecciones en 18 hr pi (Figura 4C). Para la cuantificación de las células infectadas, es importante para monitorear si el número de células infectadas se distribuye por igual a través de la epidermis interfolicular o si se observan grupos de células infectadas. En epidermis nectin-1-deficiente por ejemplo, la eficiencia de la infección varió con aproximadamente 10% de infección en algunas áreas y aproximadamente 30% en otras áreas de la epidermis interfolicular 10. Por lo tanto, decidimos to dar ningún número de células infectadas para demostrar la disminución de la infección, pero presentes montajes enteros como datos cualitativos.
Figura 1:. La visualización de las células infectadas en secciones epidérmicas o montajes enteros Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En la parte superior es un esquema que ilustra las muestras completas de la piel de adultos, secciones epidérmicas después de la separación de la dermis y la epidermis montajes enteros con la superficie visible de la capa de queratinocitos basales. La flecha señala un folículo piloso y la estrella indica la epidermis interfoliculares. Las muestras de piel y láminas epidérmicas preparados a partir de 3 semanas de edad ratones fueron infectados con el HSV-1 a aproximadamente 100 UFP / célula y se fijaron en 1,5 o 3 horas pi Las muestras fueron Stained con anti-ICP0 (verde) después de maqueta infección o en 1,5 o 3 hr pi para visualizar las células infectadas, y la contratinción de los núcleos con DAPI (azul) demuestra todas las células en las diversas capas. Como control, las muestras de piel completas falsamente infectadas se muestran en comparación con muestras infectadas en 3 hr pi demostrar ninguna tinción ICP0 (parte izquierda). Láminas epidérmicas falsamente infectadas o infectadas preparados como criosecciones se muestran en la parte media. Epidérmicas montajes enteros infectados por 1,5 o 3 horas se muestran en la parte derecha. Bar, 25 micras (cryosections), y 40 micras (montajes enteros).
Figura 2:. Queratina 14 tinción de epidérmicos su conjunto se monta después de la incubación con diferentes concentraciones de dispasa II epidermis de ratones C57BL / 6 o ratones B6.A2G-Mx1 se separó de la dermis con dispasa II. Epidérmicas montajes enteros fueron teñidas con anti-queratinocitosn 14 (rojo) y con DAPI (azul). Láminas epidérmicas fueron incubadas con 5 mg / ml (A, B) o 2,5 mg / ml (C) dispasa II durante 30 min a 37 ° C. Bar, 25 micras. Abreviaturas:. Folículo piloso (HF), epidermis interfoliculares (IFE), la glándula sebácea (SG) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Visualización de expresión ICP0 en preparaciones completas de la epidermis recién nacidos o adultos Esquemas ilustran epidérmicas su conjunto se monta con los folículos pilosos o en desarrollo folículos pilosos, que muestra la superficie visible de la capa basal de la epidermis adultos y de recién nacidos, respectivamente. Láminas epidérmicas fueron infectadas con HSV-1 a aproximadamente 100 UFP / célula, y los montajes enteros fueron teñidas conanti-ICP0 (verde) y con DAPI (azul) a las 3 h pi Como control, epidérmicas montajes enteros no infectadas de la piel de la cola de adultos fueron teñidas únicamente con anticuerpos secundarios que demuestra la tinción inespecífica de las glándulas sebáceas. Bar, 25 micras. Abreviaturas: el desarrollo del folículo piloso (FHD), folículo piloso (HF), epidermis interfoliculares (IFE), la glándula sebácea (SG). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Evaluación del impacto de factores celulares utilizando ya sea el MβCD inhibidor o nectin-1 o epidermis Hvem deficientes (A) láminas epidérmicas de la piel de la cola adulta de 3 semanas de edad ratones wt (C57BL / 6) fueron pretratados con MβCD (20 mM) y se infectaron con HSV-1 en aproximadamente 100 UFP / célula. Como control, láminas epidérmicas no tratadas se infectaron, y láminas epidérmicas pretratadas con 35 mM MβCD fueron tratados con 500 mg / ml de colesterol antes de la infección. Epidérmicas montajes enteros fueron teñidas con anti-ICP0 (verde) y con DAPI (azul) a las 3 h pi para demostrar el número de células infectadas después de agotamiento de colesterol por el tratamiento MβCD. Como se muestra en la Figura 3, la tinción de las glándulas sebáceas (SG) no es específica. Abreviaturas: HF (folículo piloso), el IFE (epidermis interfoliculares), SG (glándulas sebáceas). Bar, 150 micras. (B) epidermis cola adulto de peso (C57BL / 6), nectin-1- 23, o Hvem ratones deficientes 24 (1 mes de edad) se infectaron aproximadamente 100 UFP / célula. Epidérmicas montajes completos se tiñeron con anti-ICP0 (verde) y con DAPI (azul) en 3 pi hr (C) criosecciones de láminas epidérmicas de peso (C57BL / 6) o-nectin 1-ratones deficientes 23 se tiñeron en 18 hr pi ResULTS mostrados en (B) y (C) se modifican de la referencia 10. En A, B y C proyecciones confocal y se fusionaron las imágenes se muestran. Bar, 150 m (A) y 25 m (B, C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Cuando las hojas epidérmicas de la piel del adulto de ratones C57BL / 6 están infectadas con HSV-1 a aproximadamente 100 UFP / célula, se observa infección en casi todas las células de la capa basal en la epidermis interfolicular mientras que las dosis de virus más bajos se correlacionan con células menos infectados y una más lenta el progreso de la infección. En general, los folículos pilosos muestran un número variable de células infectadas; mientras que la mayoría de los más pequeños queratinocitos que recubren los folículos pilosos en desarrollo están infectados, sólo el germen de pelo del folículo piloso adulto está completamente infectada. Dependiendo de cómo suave la separación de la epidermis por avanza el tratamiento dispasa II, partes de los folículos del pelo se perdió. En la mayoría de los casos, las capas de queratinocitos entre las glándulas sebáceas y la epidermis interfoliculares faltan y la capa que recubre las vainas radiculares externas pueden interrumpirse. En cualquier caso, el procedimiento de separar la epidermis de la dermis y la eficiencia de infección puede variar de una cepa de ratón a otro ( Tomados en conjunto, el reto del ensayo de infección ex vivo es la preparación y el mantenimiento de las láminas epidérmicas. La fragilidad de los tejidos requiere un manejo muy cuidadoso y controla qué tan bien se preserva el tejido después de la separación de la dermis. Otra cuestión es la viabilidad limitada de las hojas en la cultura. Desde la viabilidad celular disminuye con el tiempo, experimentos de infección se deben realizar inmediatamente o al menos 3 horas después de la preparación de las hojas. Además de la piel murina, láminas epidérmicas pueden ser también preparados a partir de muestras de piel o mucosa humanos. Dependiendo de la naturaleza y el espesor de la epidermis, el tratamiento dispasa tiene que ser adaptado. Para seguir el curso de la infección, es más adecuado para visualizar las células infectadas en criosecciones. Uno tiene que tener en cuenta que con la alta UFP / célula y tiempos más largos de la infección, las láminas epidérmicas inician algún tipo de disintegración. Basado en el efecto citopático, células redondas y contactos célula-célula quedan interrumpidos. Por 24 pi h con 100 UFP / célula, algunas células basales infectadas podrían perderse, que también puede depender el tratamiento dispasa II. Con menor UFP / célula, los tiempos de infección se puede extender sin provocar daños graves en los tejidos. Alternativamente, la extensión del daño podría ser utilizado como marcador de cómo diversas cepas de virus patógenos. Preferimos visualizar las células infectadas por tinción expresión ICP0. La ventaja es una detección temprana de células muy infectadas, y, basándose en el patrón de tinción ICP0, las células en una etapa temprana durante la infección se puede distinguir de los que están en una etapa avanzada. Alternativamente, las células infectadas pueden ser visualizados por tinción de expresión de otros genes tempranos tales como la proteína de la cápside viral VP5 y la proteína de la envoltura viral gD. También tratamos de visualizar partículas entrantes de virus antes de la expresión de genes virales, ya sea por infSECCIÓN con GFP-etiquetados HSV-1 o por tinción cápsides en muestras fijadas. Según nuestra experiencia, el patrón de las buenas prácticas agrarias-fluorescencia o el patrón de tinción en secciones de tejido son demasiado complejos para demostrar claramente la presencia de partículas virales internalizados. Alternativamente, las partículas de virus se pueden visualizar por microscopía electrónica, cuando los títulos elevados de virus de ~ 1000 - 1500 se utilizan PFU / célula. En caso de dosis de virus más bajo, las partículas del virus pueden ser difícilmente detectados. En lugar de visualizar las células infectadas en láminas epidérmicas intactas, la epidermis pueden disociarse para analizar los niveles de ARN o cuantificar el número de células con la superficie, la expresión citoplasmática o nuclear de genes de interés por el análisis FACS. Suponemos que este protocolo ex vivo la infección se puede adaptar al menos a aquellos virus que se sabe que infectan los queratinocitos basales.
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Acknowledgments
Damos las gracias a Peter Staeheli para proporcionar ratones B6.A2G-MX1 y Semra Özcelik de asesoramiento técnico.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación a través SFB829 y KN536 / 16, y el Köln fortuna Programa / Facultad de Medicina de la Universidad de Colonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
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