Abstract
Amfifiele blok-copolymeren als polyethyleneglycol- blok -polylactic zuur (PEG-b- PLA) kunnen zichzelf assembleren in micellen boven hun kritische micellaire concentratie vormen hydrofobe kernen omringd door hydrofiele schelpen in waterige omgevingen. De kern van deze micellen kunnen worden gebruikt om hydrofobe, slecht wateroplosbare geneesmiddelen laden zoals docetaxel (DTX) en everolimus (EVR). Systematische karakterisering van de micellen structuur en geneesmiddelbelading mogelijkheden zijn belangrijk voor in vitro en in vivo studies worden uitgevoerd. Het doel van de hierin beschreven protocol is de nodige maatregelen karakterisering gestandaardiseerde micellaire producten inderdaad bereiken. DTX en EVR intrinsieke oplosbaarheid van 1,9 en 9,6 ug / ml bereiding van deze micellen kunnen worden bereikt door oplosmiddelgieten die de oplosbaarheid van DTX en EVR stijgt tot 1,86 en 1,85 mg / ml, respectievelijk. Stabiliteit drug in micellen evaluated bij kamertemperatuur gedurende 48 uur aan dat 97% of meer van de geneesmiddelen worden vastgehouden in oplossing. Micel grootte werd bepaald met dynamische lichtverstrooiing en bleek dat de omvang van deze micellen was dan 50 nm en afhankelijk van het molecuulgewicht van het polymeer. Geneesmiddelafgifte uit de micellen werd beoordeeld met behulp van dialyse onder de gootsteen omstandigheden bij een pH van 7,4 bij 37 ° C gedurende 48 uur. Curve fitting resultaten geven aan dat geneesmiddelafgifte wordt aangedreven door een eerste orde proces aangeeft dat het diffusie aangedreven.
Introduction
Amfifiele blokcopolymeren met herhalende structuur bestaande uit hydrofiele en hydrofobe domeinen spontaan zelfassemblage driedimensionale macromoleculaire samenstellingen zogenaamde polymere micellen te vormen. Deze structuren hebben een binnenste hydrofobe kern omgeven door een hydrofiele schil. De hydrofobe kern heeft de mogelijkheid om hydrofobe geneesmiddelen nemen door fysieke opsluiting tot hydrofobe interacties of door chemische conjugatie aan het polymeerskelet. 1 vele voordelen bestaan om het gebruik van deze blokcopolymeren te micellen voor geneesmiddelafgifte vormen. Deze omvatten incorporatie van slecht oplosbare geneesmiddelen te verbeteren farmacokinetiek van de gebruikte geneesmiddelen en de biologische verenigbaarheid en / of biologische afbreekbaarheid van de polymeren maakt ze veilig alternatief voor conventionele oplosbaarmakende. 2 Een ander voordeel van het gebruik van polymere micellen hun colloïdale deeltjesgrootte tussen 15- 150 nm 3, waardoor ze aantrekkelijk voor parenteral levering. Daarom is in de afgelopen 20 jaar polymere micellen voren zijn gekomen als levensvatbare drug delivery systemen voor het slecht in water oplosbare geneesmiddelen in het bijzonder voor de behandeling van kanker. 3,4
Momenteel zijn er vijf polymere micellaire formuleringen voor kankertherapie klinische proeven. 4 Vier van de micellen in de klinische studies PEG-gebaseerde diblokcopolymeren terwijl de laatste is een triblokcopolymeer met polyethyleenoxide. De omvang van deze micellen varieerde van 20 nm tot 85 nm. Het voordeel van PEG gebaseerde polymeren is hun biocompatibiliteit en afhankelijk van het tweede blok kan ook biologisch afbreekbaar zijn. Onlangs nieuwe geneesmiddelafgiftesystemen gebaseerd op polyethyleneglycol- blok -polylactic acid (PEG b -PLA) polymere micellen zijn ontwikkeld voor het gelijktijdig leveren van meerdere geneesmiddelen tegen kanker. De PEG-b- PLA micellen zijn zowel biocompatibel en biologisch afbreekbaar. Deze multi-geneesmiddel beladen micellen hebben getoond alsynergistic remming van verschillende kankers modellen in vitro en in vivo 2,5,6 en passen in het huidige paradigma van gebruik van meerdere geneesmiddelen bij chemotherapie resistentie of omlaagbrengen toxiciteit. Daarom is er veel belangstelling voor het bereiden en karakteriseren deze micellaire geneesmiddelafgiftesystemen voor gebruik bij kanker en andere ziekten.
In het werk dat we hieronder geschetste stap-voor-stap proces waarbij dergelijke micellen kunnen worden bereid en gekarakteriseerd voor evaluatie daarvan bij ziektetoestanden plaats. Voor de toepassing van dit werk twee slecht oplosbare anti-kankermiddelen, docetaxel (DTX) en everolimus (EVR) zijn gekozen. Zowel DTX en EVR zijn slecht in water oplosbare verbindingen met intrinsieke oplosbaarheid in water bij 1,9 en 9,6 ug / ml. 7,8 Twee PEG-b -PLA polymeren met verschillende molecuulgewichten werden gebruikt in dit protocol als de bouwstenen voor de geformuleerde polymere micellen,deze polymeren zijn PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) en PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG-b -PLA micellen kan dus zorgen voor een uniek platform als Nanodrager voor DTX en EVR afzonderlijk en in combinatie. De vereiste reagentia / materialen en apparatuur die nodig is voor te bereiden en te karakteriseren deze micellen worden opgenomen in tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de individuele en multi-drug Loaded Micellen door Solvent Casting Methode
- Weeg DTX 1 mg of EVR 1 mg of beide drugs op 1 mg elk voor de dubbele drug micellen (DDM).
- Weeg 15 mg PEG 2000 - b -PLA 1800 of PEG 4000 - b -PLA 2200 voor individuele of DDM.
- Los de geneesmiddel / drugs en het polymeer in 0,5 ml acetonitril en in een 5 ml rondbodemkolf.
- Vorm een dunne polymeerfilm geneesmiddel verspreid door verdamping van het geneesmiddel (en) -polymeer acetonitril oplossing onder verlaagde druk met een rotatieverdamper. Stel de rotatieverdamper tot 100 rpm, het waterbad temperatuur van 40 ° C en een onderdruk van 260 mbar gedurende 5 min gevolgd door een daling tot 100 mbar gedurende 3 min.
- Hydrateren de drug-polymeerfilm met 0,5 ml gedemineraliseerd water bij 50 o C en schud de kolf met de micellen te vormen.
- Filter het resultaating micellaire oplossing door een 0,2 um nylon filter aan een VN-opgeloste geneesmiddel of verontreinigingen te verwijderen in een 1,5 ml centrifugebuis.
2. Beoordeling van de Drug Laden en Stabiliteit in Micellen behulp van reverse-phase hogedrukvloeistofchromatografie (RP-HPLC)
- Voer RP-HPLC-analyse met een C8 kolom equilibriated bij 40 ° C in een isocratische modus met een mobiele fase van acetonitril / water (62/38) met 0,1% fosforzuur en 1% methanol bij een stroomsnelheid van 1 ml / min en Een injectievolume van 10 ul.
- Verdun vers bereide micellen (deel 1) 1: 100 in mobiele fase voorafgaand aan analyse door middel van RP-HPLC initiële geneesmiddelbelading bepalen. WINKEL onverdund individuele micellen en DDM bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 48 uur en vers bereid 1: 100 verdunde monsters in mobiele fase opnieuw te beoordelen door RP-HPLC en bepaald geneesmiddel (en) stabiliteit in micellen in 24 uur.
- Monitor DTX en EVR pieken op 227 en 279 nm respectievelijkmet retentietijden van 1,7 en 5,7 min respectievelijk. Voer alle metingen in drievoud. Huidige gegevens als Mean ± SD drug laden.
3. Beoordeling van micellen deeltjesgrootte door dynamische lichtverstrooiing (DLS)
- Verdun vers bereid micellen (zoals beschreven in punt 1) in gedeïoniseerd water in een verhouding van 01:20 tot een uiteindelijke polymeerconcentratie van 1,5 mg / ml verkregen.
- Meet de intensiteit van He-Ne laser (633 nm) bij 173 ° verstrooiing te bepalen. Voer alle metingen bij 25 ° C na pre-equilibratie gedurende 2 min.
- Voer alle metingen in drievoud. Aanwezig gegevens als het gemiddelde Z-gemiddelde grootte ± SD met de polydispersiteitsindex (PDI) van de verdeling.
4. Beoordeling van In Vitro geneesmiddelafgifte uit Individuele Micellen en DDM
- Bereid individuele micellen en DDM zoals beschreven in hoofdstuk 1. Plaats 2,5 ml van de micellen in een 3 ml dialyse cassette meteen molecuulgewicht cut-off (MWCO) van 7000 g / mol.
Opmerking: Deze MWCO werd gekozen om het vrije geneesmiddel (en) samen met de niet-gekoppelde polymeermoleculen vrij achterwaarts kunnen diffunderen uit de cassette en aldus zorgen bezinkingsvoorwaarden. - Plaats de cassettes in 2,5 L 10 mM pH 7,4 fosfaatbuffer (bereid door verdunning van voorraad 200 mm-oplossing) en wijzig de buffer elke 3 uur om ervoor te zorgen gootsteen voorwaarden. Houd de temperatuur van de buffer bij 37 ° C gedurende de duur van het experiment.
- Op 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 en 48 uur intrekken 150 ul van de oplossing in de cassettes en vervangen door 150 pl vers buffer.
- Analyseer de monsters met behulp van RP-HPLC zoals vastgesteld in deel 2 van de concentratie van het geneesmiddel te bepalen. Curve-fit de release data drug (s) op basis van een eenvoudige diffusie model met een één fase exponentiële associatie met stastitical software.
- Bereken de tijd die nodig is om 50% van geneesmiddelafgifte te bereiken (t 1/2) van de each geneesmiddel in individuele micellen of DDM basis van de curve fitting. Voer alle metingen in quadruplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Individuele DTX of EVR micellen en DTX en EVR DDM in PEG-b -PLA micellen succesvol zijn geformuleerd hetzij PEG 4000 - b -PLA 2200 of PEG 2000 - b -PLA 1800 (figuur 1).
DTX, EVR en de DDM toonde vergelijkbare stabiliteit van PEG 4000 - b -PLA 2200 of PEG 2000 - 1800 b -PLA dan 48 uur (Figuur 2). Aanvankelijke drug laden van EVR in PEG 4000 - b -PLA 2200 en PEG 2000 - b -PLA 1800 is 1,86 en 1,87 mg / ml. Hoewel de eerste DTX laden in PEG 4000 - b -PLA 2200 en PEG 2000 - b -PLA 1800 is 1,85 en 1,78 mg / ml. De initiële lading van zowel DTX en EVR in DDM micellen gebruik van elk van de polymeren is gelijk aan individuele micellen. Alle micellen behield 97% of meer van de eerste belastingbij 48 uur bij kamertemperatuur geroerd.
Micel grootte wordt bepaald door DLS en gebaseerd op de resultaten alle micellen vertoonden een unimodale verdeling met PDI-waarden van minder dan 0,2. De z-gemiddelde gemiddelde grootte voor DTX, EVR en DDM in PEG 2000 - b -PLA 1800 ongeveer 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0.079 ± 0.013), terwijl in de PEG 4000 - b -PLA 2200 de grootte ongeveer 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (figuur 3).
B -PLA 2200 voor EVR micellen of DDM en PEG 2000 - - b -PLA 1800 de DTX micellen Om het nut van het gebruik van beide polymeren van de afgifte-experimenten worden uitgevoerd met PEG 4000 vertegenwoordigen. De in vitro drug (s) afgifte van micellen worden geëvalueerd in pH 7,4 buffer bij 37 ° C door dialyse onder zink-omstandigheden gedurende 48 uur. Op basis van de gegevens, DTX vrijlating uit individuele micellen en DDM is ca.oximately 60% over 48 uur (Figuur 4). EVR afgifte van individuele micellen en DDM was 60% en 50% respectievelijk (Figuur 4). De T 1/2 voor elk geneesmiddel individueel micellen en DDM en goedheid van fit gegevens in tabel 2. De goedheid van curve-fitting (r 2) voor micellen behalve EVR individuele micellen boven 0,950 waardoor de aanname van de eerste orde release is een goede benadering om geneesmiddelafgifte uit individuele micellen en DDM verklaren.
Figuur 1: Schematische weergave van individuele DTX of EVR PEG-b- PLA micellen en DDM geladen met DTX en EVR.
Figuur 2:Drug (s) laden en stabiliteit van de DTX en EVR individuele micellen en DDM in PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) of PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). De geneesmiddelconcentratie in de micellen wordt gekwantificeerd door middel van RP-HPLC op 0, 24 en 48 uur. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD van drievoudige runs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Individuele micelle en DDM grootte bepaling door DLS in de PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) of PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). De micel grootte wordt bepaald door Dynamic Light Scattering. Gegevens worden gepresenteerd is een vertegenwoordiger van de verdeling voor tHij individuele micellen en DDM in de twee polymeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Drug (s) afgifte van DTX (A) en EVR (B) individueel micellen en DDM (C). Geneesmiddelafgifte studies worden uitgevoerd door dialyse onder bezinkingsvoorwaarden terwijl de temperatuur van het stelsel bij 37 oC De gepresenteerde gegevens is Mean geneesmiddelafgifte ± SD van 4 herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Micelle | t 1/2 (h) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabel 2: De tijd die nodig is voor 50% geneesmiddelafgifte (t 1/2) en goedheid van curve fitting (r 2) uit de in vitro afgifte studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
- Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
- Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
- Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
- Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
- Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
- Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
- Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
- Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
- Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
- Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315 (2013).
- Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).
