Abstract
Polyethyleneglycol- ब्लॉक -polylactic एसिड (पीएलए बी PEG-) जैसे Amphiphilic ब्लॉक सहपॉलिमरों जलीय वातावरण में हाइड्रोफिलिक गोले से घिरा हाइड्रोफोबिक कोर के गठन के लिए उनके महत्वपूर्ण micellar एकाग्रता ऊपर मिसेलस में स्वयं को इकट्ठा कर सकते हैं। इन मिसेलस की कोर docetaxel (DTX) और everolimus (ईवीआर) जैसे हाइड्रोफोबिक, खराब पानी में घुलनशील दवाओं लोड करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। मिसेल संरचना और दवा लोड क्षमताओं के व्यवस्थित लक्षण वर्णन किया जा सकता है इन विट्रो और इन विवो अध्ययनों में पहले से महत्वपूर्ण हैं। यहाँ बताया प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानकीकृत micellar उत्पादों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदम लक्षण वर्णन प्रदान करना है। DTX और ईवीआर क्रमश इन मिसेलस की तैयारी में क्रमश: 1.86 और 1.85 मिलीग्राम / एमएल, करने के लिए DTX और ईवीआर के जलीय घुलनशीलता बढ़ जाती है जो विलायक कास्टिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता मिलीग्राम / 1.9 और 9.6 माइक्रोग्राम की आंतरिक solubilities है। Eval मिसेलस में ड्रग स्थिरता48 घंटा से अधिक कमरे के तापमान पर uated दवाओं के 97% या उससे अधिक के घोल में रखा जाता है कि इंगित करता है। मिसेल आकार गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग कर मूल्यांकन और इन मिसेलस का आकार 50 एनएम से नीचे था और बहुलक का आणविक वजन पर निर्भर करता है कि संकेत दिया गया था। मिसेलस से दवा रिहाई 48 घंटा से अधिक 37 ओ सी में पीएच 7.4 से सिंक की शर्तों के तहत डायलिसिस का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। वक्र ढाले परिणाम दवा रिहाई यह प्रसार प्रेरित है यह दर्शाता है कि एक पहले के आदेश की प्रक्रिया से प्रेरित है कि संकेत मिलता है।
Introduction
हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक डोमेन से बना दोहरा संरचना के साथ Amphiphilic ब्लॉक सहपॉलिमरों अनायास polymeric मिसेलस के रूप में जाना जाता है तीन आयामी macromolecular विधानसभाओं के लिए फार्म का स्वयं को इकट्ठा कर सकते हैं। इन संरचनाओं एक हाइड्रोफिलिक खोल से घिरा एक भीतरी हाइड्रोफोबिक कोर है। हाइड्रोफोबिक कोर शारीरिक फंसाने द्वारा हाइड्रोफोबिक बातचीत के माध्यम से या बहुलक रीढ़ की हड्डी पर रासायनिक विकार द्वारा या तो हाइड्रोफोबिक दवाओं को शामिल करने की क्षमता है। एक कई फायदे दवा वितरण के लिए मिसेलस फार्म के लिए इन ब्लॉक सहपॉलिमरों का उपयोग करने के लिए मौजूद हैं। इन पॉलिमर की खराब घुलनशील दवाओं के समावेश, निगमित दवाओं के pharmacokinetics में सुधार, और biocompatibility और / या biodegradability शामिल उन्हें पारंपरिक solubilizers के लिए एक सुरक्षित वैकल्पिक बना देता है। 2 polymeric मिसेलस का उपयोग करने का एक और लाभ यह 15 के बीच, उनके कोलाइडयन कण आकार है देहात के लिए उन्हें आकर्षक बनाने के लिए 150 एनएम 3,renteral वितरण। इसलिए, पिछले 20 वर्षों में polymeric मिसेलस विशेष रूप से कैंसर के उपचार के लिए खराब पानी में घुलनशील दवाओं के लिए व्यवहार्य दवा वितरण प्रणाली के रूप में उभरा है। 3,4
पिछले polyethyleneoxide युक्त triblock copolymer है, जबकि वर्तमान में क्लिनिकल परीक्षण के दौर से गुजर कैंसर के उपचार। क्लिनिकल परीक्षण में मिसेलस के 4 चार के लिए पांच polymeric micellar योगों खूंटी-आधारित diblock सहपॉलिमरों कर रहे हैं। इन मिसेलस का आकार 20 एनएम से 85 समुद्री मील दूर करने के लिए अलग। खूंटी आधारित पॉलिमर का उपयोग कर के लाभ उनके biocompatibility है और दूसरे खंड के आधार पर भी biodegradable हो सकता है। Polyethyleneglycol- ब्लॉक -polylactic एसिड (-PLA ख PEG-) polymeric मिसेलस के आधार पर हाल ही में नई दवा वितरण प्रणाली कई विरोधी दवाओं की समवर्ती प्रसव के लिए विकसित किया गया है। PEG- बी पीएलए मिसेलस biocompatible और biodegradable दोनों हैं। भरी हुई मिसेलस के रूप में दिखाया गया है ये बहु-दवाynergistic विट्रो और इन विवो 2,5,6 में अलग-अलग तरह के कैंसर के मॉडल के निषेध और प्रतिरोध को रोकने के लिए कीमोथेरेपी में कई दवाओं के उपयोग और विषाक्तता को कम करने की वर्तमान प्रतिमान में फिट। इसलिए, तैयारी और कैंसर और अन्य रोग राज्यों में उपयोग के लिए इन micellar दवा वितरण प्रणाली निस्र्पक में ब्याज की एक महान सौदा है।
काम में हम इस तरह के मिसेलस तैयार किया है और ब्याज की रोग राज्यों में उन्हें मूल्यांकन करने से पहले होती जा सकता है जिसके द्वारा एक कदम दर कदम प्रक्रिया रेखांकित किया है नीचे। इस काम के प्रयोजन के लिए दो खराब घुलनशील विरोधी कैंसर एजेंटों, docetaxel (DTX) और everolimus (ईवीआर) चुना गया है। DTX और ईवीआर दोनों क्रमश मिलीग्राम / 1.9 और 9.6 माइक्रोग्राम पर आंतरिक पानी solubilities के साथ खराब पानी में घुलनशील यौगिकों हैं। अलग आणविक वजन के साथ 7.8 दो PEG- ख -PLA पॉलिमर तैयार की polymeric के लिए ब्लॉकों इमारत के रूप में इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया मिसेलस,-PLA 1800 (3800 दा) और खूंटी 4000 - B - -PLA 2200 (6,200 दा) ख इन पॉलिमर खूंटी 2000 हैं। PEG- ख -PLA मिसेलस इसलिए DTX और ईवीआर व्यक्तिगत रूप से और संयोजन में एक nanocarrier के रूप में एक अनूठा मंच प्रदान कर सकते हैं। आवश्यक अभिकर्मकों / सामग्री और उपकरण तैयार करने और इन मिसेलस 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं विशेषताएँ करने की जरूरत है।
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Protocol
विलायक कास्टिंग विधि द्वारा व्यक्तिगत और मल्टी ड्रग भरा micelles की 1. तैयारी
- दोहरी दवा मिसेलस के लिए 1 मिलीग्राम प्रत्येक (DDM) पर DTX 1 मिलीग्राम या ईवीआर 1 मिलीग्राम या दोनों दवाओं वजन।
- खूंटी 2000 के 15 मिलीग्राम वजन - -PLA 1800 या खूंटी 4000 बी - बी -PLA 2200 व्यक्ति या DDM के लिए या तो।
- दवा / दवाओं और एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क में acetonitrile और जगह के 0.5 मिलीलीटर में बहुलक भंग।
- एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करते हुए कम दबाव के तहत दवा (एस) -polymer acetonitrile समाधान वाष्पन द्वारा एक पतली दवा वितरित बहुलक फिल्म के रूप में। 100 आरपीएम, 40 ओ सी के पानी से स्नान तापमान और अधिक 3 मिनट के लिए 100 मिलीबार करने के लिए एक कमी के बाद 5 मिनट के लिए 260 मिलीबार की एक वैक्यूम दबाव के रोटरी बाष्पीकरण सेट करें।
- 50 ओ सी में विआयनीकृत पानी की 0.5 मिलीलीटर के साथ दवा बहुलक फिल्म rehydrate और धीरे मिसेलस के लिए फार्म का कुप्पी हिला।
- परिणाम फ़िल्टर0.2 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर के माध्यम से micellar समाधान आईएनजी एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में किसी भी संयुक्त राष्ट्र भंग दवा या को दूर करने के लिए।
रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) का उपयोग करना आकलन micelles में ड्रग लोड हो रहा है और स्थिरता का 2.
- 1 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर में एक मोबाइल acetonitrile / पानी के चरण (62/38) युक्त 0.1% फॉस्फोरिक एसिड और 1% मेथनॉल के साथ एक isocratic मोड में 40 डिग्री सेल्सियस पर equilibriated एक सी 8 स्तंभ के साथ आरपी-एचपीएलसी विश्लेषण करते हैं और 10 μl का एक इंजेक्शन की मात्रा।
- से पहले प्रारंभिक दवा लोड हो रहा है निर्धारित करने के लिए आरपी-एचपीएलसी से विश्लेषण करने के लिए मोबाइल चरण में 100: हौसले से तैयार मिसेलस (खंड 1) एक पतला। आरपी-एचपीएलसी द्वारा फिर से आकलन और 24 घंटा से अधिक मिसेलस में दवा (ओं) स्थिरता का निर्धारण करने के लिए मोबाइल चरण में 100 पतला नमूने: स्टोर undiluted व्यक्ति मिसेलस और 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान (25 ओ सी) पर DDM और ताजा 1 तैयार करते हैं।
- क्रमश: 227 और 279 एनएम पर DTX और ईवीआर चोटियों मॉनिटरक्रमश: 1.7 और 5.7 मिनट की अवधारण समय के साथ। तीन प्रतियों में सभी मापन प्रदर्शन करते हैं। मतलब ± एसडी दवा लोडिंग के रूप में मौजूद डेटा।
गतिशील लाइट बिखरने से मिसेल कण आकार के 3. आकलन (डीएलएस)
- 1.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम बहुलक एकाग्रता उपज के लिए 01:20 के अनुपात में विआयनीकृत पानी में (खंड 1 में वर्णित) हौसले से तैयार मिसेलस पतला।
- बिखरने का निर्धारण करने के लिए 173 डिग्री पर वह-ने लेजर (633 एनएम) की तीव्रता को मापने। 2 मिनट के लिए पूर्व संतुलन निम्नलिखित 25 डिग्री सेल्सियस पर सभी मापन प्रदर्शन करते हैं।
- तीन प्रतियों में सभी मापन प्रदर्शन करते हैं। वितरण की polydispersity सूचकांक (PDI) के साथ एसडी मतलब ± जेड औसत आकार के रूप में मौजूद डेटा।
व्यक्तिगत micelles और DDM से 4. आकलन में की इन विट्रो दवा रिलीज
- एक 3 मिलीलीटर डायलिसिस कैसेट के साथ में खंड 1. लोड में मिसेलस के 2.5 मिलीलीटर के रूप में वर्णित व्यक्ति मिसेलस और DDM तैयार7000 ग्राम / मोल के एक आणविक वजन कट ऑफ (MWCO)।
नोट: इस MWCO कैसेट से बाहर स्वतंत्र रूप से फैलाना और इस तरह सिंक की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए असंबद्ध बहुलक अणु के साथ नि: शुल्क दवा (एस) को सक्रिय करने के लिए चुना गया था। - (शेयर 200 मिमी समाधान गिराए द्वारा तैयार) 10 मिमी 7.4 पीएच फॉस्फेट बफर के 2.5 एल में कैसेट की जगह और सिंक की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए बफर हर 3 घंटा बदल जाते हैं। प्रयोग की अवधि के दौरान 37 ओ सी में बफर के तापमान को बनाए रखें।
- 0 पर, 0.5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, और 48 घंटा, कैसेट में समाधान के 150 μl वापस लेने और ताजा बफर के 150 μl के साथ बदलें।
- दवा एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए धारा 2 में स्थापित के रूप में आरपी-एचपीएलसी का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण करें। Stastitical सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक एक चरण घातीय संघ के साथ एक सरल प्रसार मॉडल के आधार पर दवा (एस) रिहाई डेटा वक्र फिट।
- ई की दवा रिहाई का 50% तक पहुंचने की जरूरत समय की गणना (टी 1/2)वक्र ढाले के आधार पर अलग-अलग मिसेलस या DDM में ACH दवा। चार वस्तुओं में सभी मापन प्रदर्शन करते हैं।
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Representative Results
व्यक्तिगत DTX या ईवीआर मिसेलस और मिसेलस सफलतापूर्वक खूंटी 4000 में या तो तैयार कर रहे हैं -PLA ख PEG- में DTX और ईवीआर DDM - बी -PLA 2200 या खूंटी 2000 - ख -PLA 1800 (चित्रा 1)।
DTX, ईवीआर, और DDM खूंटी 4000 में इसी तरह की स्थिरता से पता चला - 48 घंटा से अधिक -PLA 1800 बी (चित्रा 2) - -PLA 2200 या खूंटी 2000 बी। -PLA 2200 ख और खूंटी 2000 - - -PLA 1800 1.86 और 1.87 मिलीग्राम है बी / क्रमशः मिलीलीटर खूंटी 4000 में ईवीआर की प्रारंभिक दवा लोड हो रहा है। -PLA 2200 ख और खूंटी 2000 में - - खूंटी 4000 में प्रारंभिक DTX लोड करते समय -PLA 1800 ख 1.85 और 1.78 मिलीग्राम / एमएल है। पॉलिमर से प्रत्येक का उपयोग DDM मिसेलस में DTX और ईवीआर दोनों की प्रारंभिक लोडिंग व्यक्ति मिसेलस के समान है। सभी मिसेलस प्रारंभिक लदान का 97% या उससे अधिक बरकरार रखाकमरे के तापमान पर 48 घंटे में।
मिसेल आकार सभी मिसेलस कम से कम 0.2 की पीडीआई मूल्यों के साथ एक unimodal वितरण दिखाया परिणामों पर डीएलएस द्वारा मूल्यांकन और आधारित है। खूंटी 2000 में DTX, ईवीआर और DDM के लिए Z-औसत मतलब आकार - -PLA 1800 ख लगभग 18.05 ± 0.06 एनएम है (पीडीआई = 0.079 ± 0.013) खूंटी में 4000 जबकि - बी -PLA 2200 आकार लगभग 34.09 ± 0.24 है एनएम (चित्रा 3) (पीडीआई 0.137 ± 0.004 =)।
ईवीआर मिसेलस या DDM और खूंटी 2000 के लिए -PLA 2200 - B - -PLA 1800 ख DTX मिसेलस के लिए रिलीज प्रयोगों खूंटी 4000 का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं दोनों पॉलिमर का उपयोग की उपयोगिता का प्रतिनिधित्व करने के लिए। मिसेलस से इन विट्रो दवा (एस) रिहाई के लिए 48 घंटे के लिए सिंक की शर्तों के तहत डायलिसिस से 37 डिग्री सेल्सियस पर 7.4 पीएच बफर में मूल्यांकन किया है। डेटा, व्यक्तिगत मिसेलस और DDM से DTX रिलीज पर आधारित appr हैoximately 60% 48 से अधिक घंटा (चित्रा 4)। व्यक्तिगत मिसेलस और DDM से ईवीआर रिहाई 60% और 50% क्रमशः (चित्रा 4) था। व्यक्तिगत मिसेलस और DDM और फिट डेटा की अच्छाई से प्रत्येक दवा के लिए टी 1/2 तालिका 2 में प्रस्तुत किया है। धारणा जिसका मतलब है कि वक्र ढाले (2 आर) ईवीआर व्यक्ति मिसेलस को छोड़कर सभी मिसेलस के लिए ऊपर 0.950 है की भलाई पहले के आदेश रिहाई के व्यक्तिगत मिसेलस और DDM से दवा रिहाई को समझाने के लिए एक अच्छा सन्निकटन है।
चित्रा 1: DTX और ईवीआर के साथ भरी हुई अलग-अलग DTX या ईवीआर PEG- बी पीएलए मिसेलस और DDM की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
चित्र 2:ख -PLA 2200 (बी) - -PLA 1800 (ए) या खूंटी 4000 ख - खूंटी 2000 में दवा (ओं) लदान और DTX और ईवीआर व्यक्ति मिसेलस और DDM की स्थिरता। मिसेलस में दवा एकाग्रता 0, 24, और 48 घंटा में आरपी-एचपीएलसी द्वारा मात्रा निर्धारित है। तीन प्रतियों रनों का मतलब ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व डेटा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: खूंटी 2000 में डीएलएस द्वारा व्यक्तिगत मिसेल और DDM आकार दृढ़ संकल्प - बी -PLA 2200 (बी) - -PLA 1800 (ए) या खूंटी 4000 बी। मिसेल आकार गतिशील लाइट छितराया द्वारा मूल्यांकन किया है। डेटा प्रस्तुत किया है टी के लिए वितरण का एक प्रतिनिधि हैदो पॉलिमर में वह व्यक्ति मिसेलस और DDM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: व्यक्तिगत मिसेलस और DDM (सी) से DTX (ए) और ईवीआर (बी) की दवा (ओं) रिहाई। 37 ओ सी पर सिस्टम यदि तापमान को बनाए रखते हुए दवा रिलीज के अध्ययन डायलिसिस द्वारा और सिंक की शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं प्रस्तुत डाटा 4 प्रतिकृति के एसडी ± मतलब ड्रग जारी है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मिसेल | टी 1/2 (मानव संसाधन) | आर 2 |
| DTX | 10 | 0.986 |
| ईवीआर | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0.987 |
| ईवीआर - 48 | ईवीआर - 0.955 |
तालिका 2: इन विट्रो रिहाई अध्ययन से 50% दवा रिहाई (टी 1/2) और वक्र ढाले की अच्छाई (2 आर) के लिए आवश्यक समय।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
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