Abstract
polyethyleneglycol- ブロック -polylactic酸（PEG-B-PLA）のような両親媒性ブロックコポリマーは、水性環境中の親水性シェルによって囲まれた疎水性コアを形成し、その臨界ミセル濃度以上のミセルに自己組織化することができます。これらのミセルのコアは、ドセタキセル（DTX）とエベロリムス（EVR）のような疎水性、水難溶性薬物をロードするために利用することができます。ミセル構造と薬物負荷能力の体系的特徴付けを行うことができ、 インビトロおよびインビボ研究の前に重要です。本明細書に記載されたプロトコルの目的は、標準化されたミセル生成物を達成するのに必要な特性評価手順を提供することにあります。 DTXとEVRはそれぞれ、これらのミセルの調製は、それぞれ、1.86および1.85 mg / mlの、にDTXとEVRの水溶性を増加させ、溶媒キャスティングを介して達成することができるML / 1.9と9.6μgの固有の溶解度を有します。 evalのミセル中の薬物安定性48時間にわたって室温でuatedは、薬物の97％以上が溶液中に保持されていることを示しています。ミセルのサイズは、動的光散乱法を用いて評価し、これらのミセルの大きさが50nm未満であったポリマーの分子量に依存することが示されました。ミセルからの薬物放出は、48時間にわたって37℃でO pH7.4のシンク条件下で透析を用いて評価しました。カーブフィッティングの結果は、薬物の放出は、それが拡散が駆動されることを示す一次プロセスによって駆動されることを示します。
Introduction
親水性および疎水性ドメインからなる繰り返し構造を有する両親媒性ブロック共重合体は自発的に重合体ミセルとして知られている三次元の高分子集合体を形成するために自己組織化することができます。これらの構造は、親水性シェルによって囲まれた内側の疎水性コアを有します。疎水性コアは、ポリマー骨格上に疎水性相互作用を介して、または化学結合により物理的捕捉のいずれかによって疎水性薬物を組み込む能力を有している。1、多くの利点は、薬物送達のためのミセルを形成するために、これらのブロックコポリマーを使用して存在します。これらは難溶性薬物、組み込まれた薬物の薬物動態を改善し、生体適合性および/ またはポリマーの生分解性の組み込みは、従来の可溶化剤への安全な代替なり含む2高分子ミセルを使用する別の利点は、15-間に、それらのコロイド粒子のサイズであります150nmの3、PAのためにそれらが魅力的renteral配信。このため、過去20年間にポリマーミセルは、特に、癌治療のための難水溶性薬物のための実行可能な薬物送達システムとして浮上している。3,4
現在臨床試験を受けている癌治療のための5つの高分子ミセル製剤がある。最後にポリエチレンオキシドを含むトリブロック共重合体であるが、臨床試験中でミセルの4つは、PEGベースのジブロックコポリマーです。これらのミセルのサイズは、85ナノメートル、20ナノメートルから変化しました。 PEGベースのポリマーを使用することの利点は、その生体適合性であり、第二のブロックに応じて、また生分解性であることができます。 polyethyleneglycol- ブロック -polylactic酸（-pla PEG- B）高分子ミセルに基づいて、最近、新しい薬物送達システムは、複数の抗癌剤の同時送達のために開発されています。 PEG-B-PLAミセルは、生体適合性および生分解性の両方です。ロードされたミセルのように示されているこれらの多剤ynergistic インビトロおよびインビボ 2,5,6- における異なる癌モデルの阻害および抵抗を防止するために化学療法で複数の薬物を利用し、毒性を低下させる現在のパラダイムに適合。したがって、癌および他の疾患状態において使用するためのこれらのミセルの薬物送達システムを調製し、特徴付けるにおける大きな関心があります。
私たち以下の作業では、このようなミセルが関心の疾患状態でそれらを評価する前に準備し、特徴付けすることが可能なステップバイステップのプロセスを概説しています。この研究の目的のために2難溶性の抗がん剤は、ドセタキセル（DTX）及びエベロリムス（EVR）が選択されています。 DTXとEVRの両方がそれぞれML / 1.9と9.6μgのに固有の水溶解性と難水溶性化合物である。分子量の異なる7,8-二PEG-Bの -plaポリマーを配合、ポリマーのためのビルディングブロックとして、このプロトコルで使用されていましたミセル、-pla 1800（3800ダ）およびPEG 4000 B - - -pla 2200（6200 Da）でBこれらのポリマーは、PEG 2000です。 PEG-Bの -plaミセルは、したがって、個別に組み合わせてDTXとEVRのためのナノキャリアとしてのユニークなプラットフォームを提供することができます。必要な試薬/材料および装置は、これらのミセルを準備し、特徴づけるために必要な、表1に記載されています。
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Protocol
ソルベントキャスト法により個人およびマルチ薬剤ロードミセルの調製
- デュアル薬物ミセルのために各1mg（DDM）でDTX 1 mgまたはそれEVR 1ミリグラムまたは両方の薬剤を秤量。
- PEG 2000の15 mgの秤量- -pla 1800またはPEG 4000 bを - B -pla 2200個人またはDDMのいずれかのために。
- 薬物/薬物や5ミリリットルの丸底フラスコ中のアセトニトリルと場所の0.5ミリリットル中にポリマーを溶解します。
- ロータリーエバポレーターを用いて減圧下薬（S） - ポリマーアセトニトリル溶液を蒸発させて、薄い薬物分散ポリマーフィルムを形成します。 100rpmで、40°Cのウォーターバスの温度とさらに3分間100ミリバールに還元し、5分間260ミリバールの真空圧力に回転蒸発器を設定します。
- 50 O℃で脱イオン水0.5mlを有する薬物-ポリマーフィルムを再水和及び穏やかにミセルを形成するために、フラスコを振盪します。
- 結果をフィルター1.5ミリリットル遠心管に任意の未溶解した薬物または汚染物質を除去するために0.2μmのナイロンフィルターを通してミセル溶液をる。
逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を用いてミセル中の薬物負荷と安定性の評価2。
- 1ml /分の流速で0.1％のリン酸および1％のメタノールを含有するアセトニトリル/水の移動相（62/38）を用いてアイソクラチックモードで、40℃で平衡化C8カラムでRP-HPLC分析を行い、 10μlの注入量。
- 初期薬物負荷を決定するために、RP-HPLCで分析する前に、移動相中の100：新たに調製したミセル（セクション1）1を希釈します。 RP-HPLCにより再評価し、24時間かけてミセル中の薬剤（複数可）の安定性を決定するために、移動相に100希釈したサンプル：ストア希釈していない個々のミセルと48時間室温（25 O℃）でのDDMとは、新鮮な1を準備します。
- それぞれ227および279 nmでのDTXとEVRピークを監視1.7および5.7分の保持時間で、それぞれ。三連ですべての測定を実行します。平均±SD薬物負荷として存在するデータ。
動的光散乱によってミセル粒子サイズの3アセスメント（DLS）
- 1.5 mg / mlの最終的なポリマー濃度を得るために、1：20の比率で脱イオン水（セクション1に記載したように）新たに調製されたミセルを希釈します。
- 散乱を決定するために、173℃でHe-Neレーザー（633nm）の強度を測定します。 2分間プレ平衡化した後、25℃ですべての測定を実行します。
- 三連ですべての測定を実行します。分布の多分散指数（PDI）と共に、平均値±SD Z平均サイズとして存在するデータ。
個々のミセルとDDMから4次評価でのインビトロ薬物放出
- ミセルの1ロード2.5ミリリットルがで3ミリリットル透析カセットにセクションで説明したように、個々のミセルとDDMを準備7,000グラム/モルの分子量カットオフ（MWCO）。
注：このMWCOは、カセットの外に自由に拡散することにより、シンク条件を確保するために関連付けられていないポリマー分子と一緒に遊離薬物（複数可）を有効にするために選ばれました。 - （株式200 mM溶液を希釈することにより調製）10mMのpH7.4のリン酸緩衝液2.5リットルにカセットを置き、シンク条件を確保するために、バッファごとに3時間を変更します。実験期間を通じて37°Cの時のバッファの温度を維持します。
- 0、0.5、1、2、3、6、9、12、24、および48時間では、カセット内の溶液の150μLを撤回し、新鮮な緩衝液150μlで交換してください。
- セクション2で確立された薬物の濃度を決定するためにRP-HPLCを用いてサンプルを分析します。薬剤（複数可）stastiticalソフトウェアを使用して、1つの位相指数関数的会合を持つ単純な拡散モデルに基づく放出データを曲線適合。
- Eの薬物放出（T 1/2）の50％に達するのに必要な時間を算出しますフィッティング曲線に基づいて、個々のミセルまたはDDMでACH薬。四つですべての測定を実行します。
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Representative Results
個々のDTXまたはEVRミセルおよびミセルが正常にPEG 4000のいずれかで処方される-pla bは PEG-でDTXとEVR DDM - B -pla 2200またはPEG 2000 - B -pla 1800（ 図1）。
48時間（ 図2）を介して-pla 1800 bは - -pla 2200またはPEG 2000 B - DTX、EVR、とDDMは、PEG 4000で同様の安定性を示しました。 PEG 4000でEVRの初期薬物負荷- -pla 2200及びPEG 2000 B - -pla 1800 Bそれぞれ/ 1.86と1.87ミリグラムmLです。 -pla 2200 BおよびPEG 2000年 - - PEG 4000の最初のDTXロード中に-pla 1800 bが 1.85および1.78 mg / mlです。ポリマーのそれぞれを使用して、DDMミセル内DTXとEVR両方の初期ロードは、個々のミセルに似ています。すべてミセルは、初期ロードの97％以上を保持し室温で48時間で。
ミセルのサイズは、DLSによって評価し、その結果に基づいて、すべてのミセルは、0.2未満のPDI値を有する単峰性分布を示しました。 PEG 2000年の DTX、EVRとDDMのためのz平均平均サイズは- -pla 1800 bは約18.05±0.06 nmである（PDI = 0.079±0.013）、PEG 4000は一方で- B -pla 2200サイズが約34.09±0.24であり、 NM（PDIは0.137±0.004 =）（ 図3）。
EVRミセルまたはDDMとPEG 2000の -pla 2200 bを - - -pla 1800 bは 、DTXミセルのリリース実験は、PEG 4000を使用して実行され 、両方のポリマーを使用することの有用性を表します。ミセルからのインビトロ薬物（複数可）の放出は48時間シンク条件下で透析することにより、37℃でpH7.4の緩衝液中で評価されます。データに基づいて、個々のミセルとDDMからDTXリリースはAPPRですoximately 60％48時間以上（ 図4）。個々のミセルとDDMからEVRのリリースでは、それぞれ60％及び50％（ 図4）でした。個々のミセルとDDMと適合データの良さから、各薬剤のためのT 1/2 は 、表 2に示されている。EVRの個々のミセルを除くすべてのミセルの曲線フィッティング（R 2）の良さが0.950以上であることを意味しているという仮定一次放出の個々のミセルとDDMからの薬物放出を説明するための良好な近似です。
図1：DTXとEVRを搭載した個々のDTXまたはEVR PEG-B-PLAミセルとDDMの模式図。
図2：薬剤（複数可）、PEG 2000年 DTXとEVR個々のミセルとDDMのロードと安定性- -pla 1800（A）またはPEG 4000 B - -pla 2200 B（B）。ミセル中の薬物濃度は、0、24、及び48時間後にRP-HPLCによって定量化されます。三連の実験の平均±SDとして表されるデータ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：個々のミセルとPEG 2000年に DLSによって、DDMサイズの決意- -pla 1800（A）またはPEG 4000 B - -pla 2200 B（B）。ミセルのサイズは、動的光散乱によって評価されます。データが提示され、Tのための分布の代表であります彼二つのポリマーの個々のミセルとDDM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：個々のミセルとDDM（C）からDTX（A）とEVR（B）の薬剤（複数可）のリリース。 37 O Cであれば、システムの温度を維持しながら、薬物放出研究は、透析により、シンク条件下で行われます提示されたデータは、4反復の平均±SD薬剤放出である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ミセル | T 1/2（時間） | R 2 |
| DTX | 10 | 0.986 |
| EVR | 35 | 0.82 |
| DDM | DTX - 8.86 | DTX - 0.987 |
| EVR - 48 | EVR - 0.955 |
表2： インビトロ放出研究から50％の薬物放出（T 1/2）および曲線フィッティングの良さ（R 2）のために必要な時間。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
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