Abstract
Copolímeros em bloco anfifílicos como bloco polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG- b- PLA) pode auto-montar em micelas acima da concentração micelar crítica formando núcleos hidrofóbicos cercadas por escudos hidrofílicos em ambientes aquosos. O núcleo destas micelas pode ser utilizado para carregar medicamentos hidrofóbicos, fracamente solúveis em água, como o docetaxel (DTX) e everolimus (EVR). Caracterização sistemática da estrutura de micelas e carregamento de drogas capacidades são importantes antes in vitro e estudos in vivo podem ser conduzidos. O objectivo do protocolo aqui descrito é o de proporcionar os passos de caracterização necessárias para obter produtos normalizados micelares. DTX e IVE têm solubilidades intrínsecas de 1,9 e 9,6 ug / ml, respectivamente, de preparação dessas micelas pode ser conseguido através de evaporação de solvente, que aumenta a solubilidade aquosa da DTX e IVE a 1,86 e 1,85 mg / ml, respectivamente. Estabilidade do fármaco em micelas evalmicas situadas à temperatura ambiente durante 48 hr indica que 97% ou mais dos fármacos são retidos na solução. Tamanho das micelas foi avaliado usando dispersão dinâmica de luz e indicou que o tamanho dessas micelas era inferior a 50 nm e dependente do peso molecular do polímero. A libertação do fármaco a partir das micelas foi avaliada por meio de diálise em condições de imersão a pH 7,4 a 37 ° C durante 48 h. Resultados indicam que o ajustamento da curva de libertação do fármaco é accionado por um processo de primeira ordem indicando que ele está orientado difusão.
Introduction
Copolímeros em bloco anfifílicos com estrutura de repetição compostas de domínios hidrofílicos e hidrofóbicos pode auto-montar espontaneamente para formar três montagens macromoleculares tridimensionais conhecidas como micelas poliméricas. Estas estruturas têm um núcleo hidrófobo interior rodeado por uma camada hidrófila. O núcleo hidrofóbico tem a capacidade para incorporar drogas hidrofóbicas, quer por armadilha física através de interacções hidrofóbicas ou por conjugação química sobre a espinha dorsal do polímero. 1 Muitas vantagens existem para a utilização desses copolímeros em bloco, para formar micelas para entrega da droga. Estes incluem incorporação de fármacos fracamente solúveis, melhorar a farmacocinética dos fármacos incorporados, e a biocompatibilidade e / ou a biodegradabilidade dos polímeros torna uma alternativa segura para solubilizadores convencionais. 2 Outra vantagem do uso de micelas poliméricas é o seu tamanho de partícula coloidal, entre 15- 150 nm 3, tornando-os atraentes para paentrega renteral. Por conseguinte, ao longo dos últimos 20 anos, surgiram micelas poliméricas como sistemas de distribuição de drogas viáveis para fármacos pouco solúveis em água, especialmente para a terapia do cancro 3,4.
Actualmente existem cinco formulações micelares poliméricos para a terapia do cancro em fase de ensaios clínicos. 4 Quatro das micelas em ensaios clínicos são os copolímeros dibloco baseados em PEG enquanto que a última é um copolímero de tribloco de óxido de polietileno contendo. O tamanho destas micelas variou de 20 nm a 85 nm. A vantagem da utilização de polímeros à base de PEG é a sua biocompatibilidade e, dependendo do segundo bloco também pode ser biodegradável. Recentemente, os sistemas de administração de fármacos à base nova no bloco polyethyleneglycol- ácido -polylactic (PEG-b--PLA) micelas poliméricas têm sido desenvolvidos para a entrega simultânea de vários fármacos anti-cancerígenos. As micelas de PEG-PLA B- são ambos biocompatível e biodegradável. Estes fármacos múltiplos micelas carregadas têm mostrado comoynergistic inibição de diferentes cancros em modelos in vitro e in vivo 2,5,6 e inserem-se no paradigma actual de utilização de vários fármacos em quimioterapia para prevenir a resistência e diminuir a toxicidade. Portanto, há uma grande quantidade de interesse em preparar e caracterizar esses sistemas de entrega de drogas micelares para uso no cancro e outros estados de doença.
No trabalho abaixo nós esboçamos um processo passo-a-passo pelo qual tais micelas podem ser preparados e caracterizados antes de avaliá-los em estados de doença de interesse. Para os fins deste trabalho dois agentes anti-cancro fracamente solúveis, docetaxel (DTX) e everolimus (EVR) ter sido escolhido. Ambos DTX e EVR são compostos pouco solúveis em água com solubilidades intrínsecas de água em 1,9 e 9,6 ng / ml, respectivamente. 7,8 Duas PEG polímeros b -PLA com diferentes pesos moleculares foram utilizados neste protocolo como os blocos de construção para a polimérica formulados micelas,estes polímeros são PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) e PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG micelas b -PLA pode, portanto, fornecer uma plataforma única como um nanocarrier para DTX e EVR individualmente e em combinação. Os reagentes necessários / Materiais e equipamentos necessários para preparar e caracterizar estas micelas estão listadas na Tabela 1.
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Protocol
1. Preparação de individuais e multi-drogas Micelles carregado pelo método de fundição de solvente
- Pesar DTX 1 mg ou 1 mg EVR ou ambas as drogas em 1 mg cada, para as micelas dupla droga (DDM).
- Pesar 15 mg de PEG 2000 - b -PLA 1800 ou PEG 4000 - b -PLA 2200 para qualquer indivíduo ou DDM.
- Dissolve-se os medicamentos e / ou drogas e do polímero em 0,5 ml de acetonitrilo e colocar num frasco de fundo redondo de 5 ml.
- Formar uma película fina de polímero de droga distribuída por evaporação do (s) fármaco -polymer solução de acetonitrilo sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo. Definir o evaporador rotativo a 100 rpm, a temperatura do banho de água de 40 ° C e uma pressão de vácuo de 260 mbar durante 5 minutos, seguido de uma redução para 100 mbar durante mais 3 min.
- Re-hidratar o filme de fármaco e polímero, com 0,5 ml de água desionizada a 50 ° C e agitar suavemente o frasco para formar as micelas.
- Filtrar o resultadoing solução micelar através de um filtro de nylon de 0,2 um para remover qualquer droga ou contaminantes dissolvidos-un para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
2. Avaliação da droga carregamento e da estabilidade em micelas de fase reversa usando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) de
- Realizar a análise por RP-HPLC com uma coluna C8 equilibriated a 40 ° C num modo isocrático com uma fase móvel de acetonitrilo / água (62/38) contendo ácido fosfórico a 0,1% e 1% de metanol a um caudal de 1 ml / min e um volume de injecção de 10 ul.
- Diluir micelas recém-preparados (Ponto 1) 1: 100 em fase móvel antes de analisar por RP-HPLC para determinar a carga de medicamento inicial. Loja não diluídas micelas individuais e DDM à temperatura ambiente (25 ° C) durante 48 horas e preparar frescos 1: 100 amostras diluídas em fase móvel para re-avaliar por RP-HPLC e determinar medicamento (s) em micelas estabilidade ao longo de 24 horas.
- Monitorar DTX e IVE picos a 227 e 279 nm, respectivamentecom tempos de retenção de 1,7 e 5,7 min, respectivamente. Executar todas as medições em triplicado. Apresentam dados como a carga média ± SD de drogas.
3. Avaliação das micelas de tamanho de partículas por espalhamento dinâmico de luz (DLS)
- Diluir micelas preparadas de fresco (como descrito na secção 1) em água desionizada a uma razão de 1:20 para dar uma concentração final de polímero de 1,5 mg / ml.
- Medir a intensidade do laser He-Ne (633 nm) a 173 ° para determinar espalhamento. Executar todas as medições a 25 ° C após um pré-equilibração durante 2 min.
- Executar todas as medições em triplicado. Dados apresentam-se como a dimensão média de Z-média ± DP, juntamente com o índice de polidispersibilidade (PDI) da distribuição.
4. Avaliação da In Vitro Drogas lançamento de micelas individuais e DDM
- Prepare micelas individuais e DDM, conforme descrito na secção 1. Carga de 2,5 ml das micelas numa cassete de diálise com 3 mlum peso molecular de corte (MWCO) de 7000 g / mol.
NOTA: Este MWCO foi escolhido para permitir que o fármaco livre (s), juntamente com as moléculas do polímero não associados a difundir livremente para fora da cassete e, assim, assegurar as condições de imersão. - Coloque as cassetes em 2,5 L de pH 7,4 mM de tampão de fosfato 10 (preparado por diluição de solução stock de 200 mM) e mudar o tampão de cada 3 horas para garantir as condições de imersão. Manter a temperatura do tampão a 37 ° C durante toda a duração da experiência.
- Aos 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, e 48 h, retirar 150 ul da solução nas cassetes e substituir com 150 ul de tampão fresco.
- Analisar as amostras usando RP-HPLC, tal como estabelecido na secção 2 para determinar a concentração do fármaco. Curve-se ajustar os dados de liberação da droga (s) com base em um modelo de difusão simples, com uma fase de uma associação exponencial usando software stastitical.
- Calcular o tempo necessário para alcançar 50% de libertação do fármaco (t 1/2) de eACH droga em micelas individuais ou DDM com base no ajuste de curva. Executar todas as medições em quádruplo.
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Representative Results
DTX individual ou micelas EVR e DTX e IVE DDM em micelas de PEG-b--PLA são formuladas com sucesso, quer em PEG 4000 - b -PLA 2200 ou PEG 2000 - b -PLA 1800 (Figura 1).
DTX, RVP e o DDM mostraram estabilidade semelhante em PEG 4000 - b -PLA 2200 ou PEG 2000 - 1800 b -PLA mais de 48 h (Figura 2). Carga de droga inicial de EVR em PEG 4000 - b -PLA 2200 e PEG 2000 - b -PLA 1800 é de 1,86 e 1,87 mg / ml, respectivamente. Embora o carregamento inicial DTX em PEG 4000 - b -PLA 2200 e em PEG 2000 - b -PLA 1800 é de 1,85 e 1,78 mg / ml. O carregamento inicial de ambos DTX e IVE em micelas DDM usando cada um dos polímeros é semelhante a micelas individuais. Todas as micelas retido 97% ou mais da carga iniciala 48 h à temperatura ambiente.
Tamanho das micelas é avaliada por DLS e com base nos resultados de todas as micelas mostrou uma distribuição unimodal com valores PDI de menos de 0,2. Os tamanhos médios de z-média para DTX, EVR e DDM em PEG 2000 - b -PLA 1800 é de cerca de 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0,013), enquanto no PEG 4000 - b -PLA 2200 o tamanho é de aproximadamente 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (Figura 3).
Para representar a utilidade de usar ambos os polímeros as experiências de libertação são realizadas utilizando PEG 4000 - b -PLA 2200 para micelas EVR ou DDM e PEG 2000 - b -PLA 1800 para as micelas DTX. A libertação in vitro do fármaco (s) a partir de micelas é avaliada em tampão de pH 7,4 a 37 ° C por diálise em condições de imersão durante 48 h. Com base nos dados, DTX libertação das micelas individuais e DDM é aproxoximately 60% ao longo de 48 h (Figura 4). RVP libertação das micelas individuais e DDM foi de 60% e 50% respectivamente (Figura 4). O t 1/2 para cada fármaco a partir de micelas individuais e DDM e da bondade de dados do ajuste estão apresentados na Tabela 2. A bondade de ajuste de curva (r 2) para todas as micelas exceto EVR micelas individuais está acima de 0,950, o que significa que o pressuposto de liberação de primeira ordem é uma boa aproximação para explicar a libertação do fármaco a partir de micelas individuais e DDM.
Figura 1: Representação esquemática do DTX indivíduo ou EVR PEG- b- PLA micelas e DDM carregado com DTX e EVR.
Figura 2:Droga (s) de carga e a estabilidade da DTX e IVE micelas individuais e DDM em PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) ou PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). A concentração de fármaco nas micelas é quantificado por RP-HPLC a 0, 24, e 48 h. Dados representados em Média ± DP de triplicados executado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: micela individual e DDM determinação do tamanho por DLS em PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) ou PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). O tamanho micelar é avaliada por dispersão de luz dinâmica. Os dados são apresentados é uma representante da distribuição para o tele micelas individuais e DDM nos dois polímeros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: droga (s) de libertação de DTX (A) e IVE (B) a partir de mi celas individuais e DDM (C). Estudos de libertação de fármaco são realizados por diálise e em condições de imersão, mantendo a temperatura se o sistema a 37 ° C. Os dados apresentados é Média de Libertação do Medicamento ± SD de 4 repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Micelle | t 1/2 (hr) | R 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0,82 |
| DDM | DTX - 8,86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabela 2: O tempo necessário para 50% de libertação de drogas (t 1/2) e bondade de ajuste de curva (r 2) a partir de estudo de libertação in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
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