Abstract
Amfifila segmentsampolymerer som polyethyleneglycol- blocket -polylactic syra (PEG b- PLA) kan själv montera in miceller över deras kritiska micellkoncentration bildar hydrofoba kärnor omgivna av hydrofila skal i vattenmiljöer. Kärnan i dessa miceller kan användas för att ladda hydrofoba, dåligt vattenlösliga läkemedel som docetaxel (DTX) och everolimus (EVR). Systematisk karakterisering av micellstruktur och narkotika laddning möjligheter är viktigt innan in vitro och in vivo-studier kan genomföras. Målet med det protokoll som beskrivs häri är att tillhandahålla de nödvändiga karakterisering åtgärder för att uppnå standardiserade micellära produkter. DTX och EVR har inneboende lösligheter av 1,9 och 9,6 pg / ml respektive Framställning av dessa miceller kan uppnås genom lösningsmedelsgjutning som ökar vattenlösligheten av DTX och EVR till 1,86 och 1,85 mg / ml, respektive. Läkemedelsstabilitet i miceller evaluated vid rumstemperatur över 48 h indikerar att 97% eller mer av läkemedlen kvarhålls i lösning. Micell storlek bedömdes med dynamisk ljusspridning och meddelade att storleken på dessa miceller var under 50 nm och beroende på molekylvikten hos polymeren. Läkemedelsfrisättning från micellerna bedömdes med hjälp av dialys under diskbänken förhållanden vid pH 7,4 vid 37 ° C under 48 timmar. Kurvanpassnings resultat indikerar att läkemedelsfrisättning drivs av en första ordningens process indikerar att den diffusion driven.
Introduction
Amfifila segmentsampolymerer med upprepande struktur bestående av hydrofila och hydrofoba domäner kan spontant själv montera för att bilda tredimensionella makromolekylära församlingar kallas polymera miceller. Dessa strukturer har en inre hydrofob kärna omgiven av ett hydrofilt skal. Den hydrofoba kärnan har förmåga att införliva hydrofoba läkemedel, antingen genom fysikalisk inneslutning genom hydrofoba interaktioner eller genom kemisk konjugering på till polymerhuvudkedjan. 1 Många fördelar finns med att använda dessa segmentsampolymerer för att bilda miceller för läkemedelsavgivning. Dessa innefattar införlivande av svårlösliga läkemedel, förbättra farmakokinetiken för de införlivade droger och biokompatibiliteten och / eller bionedbrytbarheten hos polymererna gör dem till en säker alternativ till konventionella solubiliseringsmedel. 2 En annan fördel med användning av polymera miceller är deras kolloidal partikelstorlek, mellan 15- 150 nm 3, vilket gör dem attraktiva för parenteral leverans. Därför under de senaste 20 åren polymera miceller har dykt upp som livskraftiga drogleveranssystem för dåligt vattenlösliga läkemedel särskilt för cancerbehandling. 3,4
För närvarande finns det fem polymera micellära formuleringar för cancerterapi som genomgår kliniska prövningar. 4 Fyra av miceller i de kliniska prövningarna är PEG-baserade disegmentsampolymerer medan den sista är en trisegmentsampolymer innehållande polyetylenoxid. Storleken på dessa miceller varierade från 20 nm till 85 nm. Fördelen med att använda PEG baserade polymerer är deras biokompatibilitet och beroende på det andra blocket kan också vara biologiskt nedbrytbara. Nyligen nya drug delivery system baserade på polyethyleneglycol- blocket -polylactic syra (PEG-b -PLA) polymera miceller har utvecklats för samtidig leverans av flera cytostatika. De PEG b- PLA miceller är både biokompatibla och bionedbrytbara. Dessa multiläkemedels laddade miceller har visat somynergistic hämning av olika cancerformer modeller in vitro och in vivo 2,5,6 och passar in i nuvarande paradigm att utnyttja flera läkemedel vid kemoterapi för att förhindra motstånd och sänka toxicitet. Därför finns det ett stort intresse för att förbereda och karakterisera dessa micellära drug delivery system för behandling av cancer och andra sjukdomstillstånd.
I arbetet under vi har beskrivit en steg-för-steg-process genom vilken sådana miceller kan framställas och karakteriseras före utvärdera dem i sjukdomstillstånd av intresse. För att detta arbete två svårlösliga anti-cancermedel, docetaxel (DTX) och everolimus (EVR) har valts. Både DTX och EVR är dåligt vattenlösliga föreningar med inneboende vattenlöslighet på 1,9 och 9,6 mikrogram / ml. 7,8 Två PEG-b -PLA polymerer med olika molekylvikter användes i detta protokoll som byggstenar för den formulerade polymera miceller,dessa polymerer är PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) och PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG-b -PLA miceller kan därför ge en unik plattform som nanocarrier för DTX och EVR individuellt och i kombination. De nödvändiga Reagenser / Material och utrustning som behövs för att förbereda och karakterisera dessa miceller anges i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av individuella och Multi-drog Loaded Miceller av lösningsmedel gjutmetod
- Väg upp DTX 1 mg eller EVR 1 mg eller båda läkemedlen på 1 mg vardera för dubbla läkemedels miceller (DDM).
- Väg upp 15 mg av PEG 2000 - b -PLA 1800 eller PEG 4000 - b -PLA 2200 för antingen individuellt eller DDM.
- Lös läkemedel / droger och polymeren i 0,5 ml acetonitril och placera det i en 5 ml rundbottnad kolv.
- Bilda en tunn läkemedel distribuerat polymerfilm genom förångning av läkemedlet (läkemedlen) -polymer acetonitrillösning under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare. Ställ in rotationsindunstare till 100 varv per minut, den vattenbadtemperatur på 40 ° C och ett vakuumtryck av 260 mbar under 5 min följt av en minskning till 100 mbar under 3 ytterligare minuter.
- Rehydrera läkemedlet polymerfilm med 0,5 ml avjoniserat vatten vid 50 ° C och försiktigt skaka kolven för att bilda miceller.
- Filtrera resultateting micellär lösning genom ett 0,2 ^ m nylonfilter för avlägsnande av eventuellt icke-upplöst läkemedel eller föroreningar in i en 1,5 ml centrifugrör.
2. Bedömning av narkotika Lastning och stabilitet Miceller omvänd fas högupplösande vätskekromatografi (RP-HPLC)
- Utför RP-HPLC-analys med en C8-kolonn equilibriated vid 40 ° C i en isokratisk mod med en mobil fas av acetonitril / vatten (62/38) innehållande 0,1% fosforsyra och 1% metanol vid en flödeshastighet av 1 ml / min och en injektionsvolym av 10 ul.
- Späd nylagade miceller (avsnitt 1) 1: 100 i mobila fasen före analys genom RP-HPLC för att bestämma initial läkemedelsladdning. Förvara outspädda individuella miceller och DDM vid rumstemperatur (25 ° C) under 48 timmar och förbereda färska 1: 100 utspädda prover i mobil fas att omvärdera genom RP-HPLC och bestämma läkemedel (er) stabilitet i miceller över 24 timmar.
- Övervaka DTX och EVR toppar vid 227 och 279 nm respektivemed retentionstider på 1,7 och 5,7 minuter respektive. Utför alla mätningar i tre exemplar. Nuvarande data som medelvärde ± SD läkemedelsladdning.
3. Bedömning av micell partikelstorlek från Dynamic Light Scattering (DLS)
- Späd nyberedda miceller (som beskrivs i avsnitt 1) i avjoniserat vatten i ett förhållande av 01:20 för att ge en slutlig polymerkoncentration av 1,5 mg / ml.
- Mäta intensiteten av He-Ne-laser (633 nm) vid 173 ° för att bestämma spridning. Utför alla mätningar vid 25 ° C efter pre-jämvikt under 2 min.
- Utför alla mätningar i tre exemplar. Nuvarande data som den genomsnittliga Z-genomsnittliga storleken ± SD tillsammans med polydispersitetsindex (PDI) av distributionen.
4. Bedömning av in vitro läkemedelsfrisättningen från enskilda Miceller och DDM
- Förbered individuella miceller och DDM som beskrivs i avsnitt 1. Fyll 2,5 ml micellerna i en 3 ml dialyskassett meden molekylvikt cut-off (MWCO) av 7000 g / mol.
NOTERA: Detta MWCO valdes för att möjliggöra den fria läkemedlet (er) tillsammans med de icke-associerade polymermolekylerna att diffundera fritt ut ur kassetten och därigenom säkerställa sjunkförhållanden. - Placera kassetterna i 2,5 L av 10 mM pH 7,4 fosfatbuffert (framställd genom att späda lager 200 mM lösning) och ändra bufferten varje tre timmar för att säkerställa sjunkförhållanden. Upprätthåll temperaturen av bufferten vid 37 ° C under hela experimentet.
- Vid 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 och 48 timmar, återkalla 150 ul av lösningen i kassetterna och ersätt med 150 pl färsk buffert.
- Analysera prover med RP-HPLC enligt avsnitt 2 för att bestämma läkemedelskoncentrationen. Curve-montera läkemedel (s) släpp data baserat på en enkel diffusion modell med en fas exponentiell förening med hjälp av stastitical programvara.
- Beräkna den tid som krävs för att nå 50% av läkemedelsfrisättning (t 1/2) each läkemedel i enskilda miceller eller DDM baserat på kurvan montering. Utför alla mätningar i fyrling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Individuell DTX eller EVR miceller och DTX och EVR DDM i PEG-b -PLA miceller framgångsrikt formuleras antingen PEG 4000 - b -PLA 2200 eller PEG 2000 - b -PLA 1800 (Figur 1).
DTX, EVR och DDM uppvisade liknande stabilitet i PEG 4000 - b -PLA 2200 eller PEG 2000 - b -PLA 1800 över 48 h (fig 2). Inledande läkemedelsladdning av EVR i PEG 4000 - b -PLA 2200 och PEG 2000 - b -PLA 1800 är 1,86 och 1,87 mg / ml. Medan första DTX lastning i PEG 4000 - b -PLA 2200 och PEG 2000 - b -PLA 1800 är 1,85 och 1,78 mg / ml. Den ursprungliga laddningen av både DTX och EVR i DDM miceller genom att använda var och en av polymererna liknar enskilda miceller. Alla micellerna behöll 97% eller mer av den initiala laddningsvid 48 h vid rumstemperatur.
Micell storlek bedöms av DLS och baserat på resultaten alla micellerna visade en unimodal fördelning med PDI värden mindre än 0,2. Z-genomsnittliga medel storlekar för DTX, EVR och DDM i PEG 2000 - b -PLA 1800 är cirka 18,05 ± 0,06 nm (PDI = 0,079 ± 0,013) medan PEG 4000 - b -PLA 2200 storleken är ungefär 34,09 ± 0,24 nm (PDI = 0,137 ± 0,004) (Figur 3).
För att representera nyttan av att använda båda polymerfrisättningsexperiment utförs med PEG 4000 - b -PLA 2200 för EVR miceller eller DDM och PEG 2000 - b -PLA 1800 för DTX miceller. In vitro-läkemedlet (läkemedlen) frisättning från miceller bedöms i pH 7,4 buffert vid 37 ° C genom dialys enligt sjunkförhållanden för 48 timmar. Baserat på data, DTX frigivning från enskilda miceller och DDM är ca.oximately 60% under 48 h (fig 4). EVR frisättning från enskilda miceller och DDM var 60% respektive 50% (Figur 4). T 1/2 för varje läkemedel från individuella miceller och DDM och godhet passar data presenteras i tabell 2. Godhet kurvpassning (r 2) för alla miceller utom EVR individuella miceller är över 0.950, vilket innebär att antagandet av första ordningens frisättning är en god approximation för att förklara läkemedelsfrisättningen från enskilda miceller och DDM.
Figur 1: Schematisk bild av enskilda DTX eller EVR PEG b- PLA miceller och DDM lastad med DTX och EVR.
Figur 2:Läkemedel (er) lastning och stabiliteten hos DTX och EVR individuella miceller och DDM i PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) eller PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Läkemedelskoncentrationen i micellerna kvantifieras genom RP-HPLC vid 0, 24, och 48 timmar. Data representeras som medelvärde ± SD för trippel körningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Individuell micell och DDM storleksbestämning av DLS i PEG 2000 - b -PLA 1800 (A) eller PEG 4000 - b -PLA 2200 (B). Micellen storlek fastställs genom dynamisk ljusspridning. Data presenteras är en representant för distributionen för than individuella miceller och DDM i de två polymererna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Läkemedels (s) frigivning av DTX (A) och EVR (B) från enskilda miceller och DDM (C). Läkemedelsfrisättningsstudier genomförs genom dialys och under sjunkförhållanden medan temperaturen om systemet upprätthölls vid 37 ° C De data som presenteras är Mean Drug Release ± SD av 4 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Micell | t 1/2 (h) | r 2 |
| DTX | 10 | 0,986 |
| EVR | 35 | 0,82 |
| DDM | DTX - 8,86 | DTX - 0,987 |
| EVR - 48 | EVR - 0,955 |
Tabell 2: Den tid som krävs för 50% läkemedelsfrisättning (t 1/2) och godhet kurvanpassning (r 2) från in vitro-frisättningsstudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG2000-b-PLA1800 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/2000 | PLA MW can be specified on ordering |
| PEG4000-b-PLA2200 | Advanced Polymer Materials, Inc | 6-01- PLA/4000 | PLA MW can be specified on ordering |
| Docetaxel | LC Laboratories | D-1000 | 100 mg |
| Everolimus | LC Laboratories | E-4040 | 100 mg |
| Acetonitrile | EMD/VWR | EM-AX0145-1 | HPLC grade; 4 L |
| Round bottom flask | Glassco/VWR | 89426-496 | 5 ml |
| RV 10 Control Rotary Evaporators | IKA Works | 8025001 | Rotoevaporator |
| Shimadzhu HPLC with DAD detector | Shimadzhu | RP-HPLC | |
| Slide-a-lyzer dialysis casette MWCO 7000 | Thermo Scientific, Inc | 66370 | 3 ml |
| Phosphate buffer pH 7.4, 200 mM | VWR | 100190-870 | 500 ml |
| Malvern NanoZS | Malvern Instruments, UK | DLS | |
| Nylon filter | Acrodisc/VWR | 28143-242 | 13 mm; 0.2µM |
| Phosphoric acid, NF | Spectrum Chemical/VWR | 700000-626 | 100 ml |
| GraphPad Prism | www.graphpad.com | Analysis software | |
| Zorbax SB-C8 Rapid Resolution cartridge | Agilent Technologies | 866953-906 | 4.6 ×75 mm, 3.5 μm |
References
- Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
- Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
- Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
- Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
- Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
- Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
- Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
- Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
- Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
- Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315 (2013).
- Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).
