Abstract
وإدارة صارمة التعبير البروتين ضروري ليس فقط لكل كائن حي على قيد الحياة، ولكن أيضا استراتيجية هامة للتحقيق في وظائف البروتين في النماذج الخلوية. لذلك، اخترع البحوث التي أجريت مؤخرا أدوات مختلفة لاستهداف بروتين تعبير في خطوط الثدييات خلية أو حتى النماذج الحيوانية، بما في ذلك الحمض النووي الريبي وتدخل الأجسام المضادة. في حين أن الاستراتيجية الأولى جمعت الكثير من الاهتمام خلال العقدين الماضيين، والببتيدات التوسط إزفاء من الشحنات الأجسام المضادة عبر الأغشية الخلوية وداخل الخلايا، الحصول على الفائدة أقل من ذلك بكثير. في هذا المنشور، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة كيفية الاستفادة من الناقل الببتيد اسمه عربة في خلايا الكلى الجنينية البشرية، وكذلك في الخلايا العصبية الحصين الابتدائية لإجراء تجارب تدخل الأجسام المضادة وزيادة توضيح تطبيق إعادة البناء الثلاثية الأبعاد في تحليل وظيفة البروتين. وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن عربة هو، ربما نظرا لإشارة توطين النووية، particulaRLY مناسبة تماما لاستهداف البروتينات المقيمين في سوما والنواة. بشكل ملحوظ، عند تطبيق عربة على الثقافات الحصين الابتدائية، وتحول الكاشف إلى أن من المستغرب قبولا من قبل الخلايا العصبية فصلها.
Introduction
ورقابة مشددة من التعبير البروتين ضروري لكل كائن حي لقيادة تنميتها وكذلك للرد على إشارات البيئية. ومن هنا، فقد تم اختراع العديد من الآليات أثناء التطور لتنظيم بالضبط مستوى التعبير من كل البروتين المشفرة بواسطة التطبيق. 20000 الجينات الموجودة في أي خلية حقيقية النواة في أي وقت من حياته. تجري في مراحل مختلفة من الإنتاج بروتين، وتتراوح آليات تنظيمية من إدارة هيكل لونين، النسخ وRNA التعامل مع لاتجاه التعديلات البروتين posttranslational والنقل والتدهور.
وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن الأعطال في الأجهزة الجزيئية ومستويات بروتين تعبير غيرت الكامنة ارتبطت الأمراض المختلفة مثل السرطان أو الإعاقة الذهنية. في الواقع، بالنظر إلى تعقيد المتميز لتطوير الخلايا العصبية وظائف المخ لدى الثدييات، وسينسيالناقلية هذه الأنظمة المتطورة إلى تغييرات في التعبير البروتين يتجلى في العديد من العجز الفكرية المعروفة بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون (AD وPD)، فضلا عن اضطرابات طيف التوحد (ASD) مثل متلازمة X الهشة (FXS). يتميز هذا المرض الأخير من قبل misexpression واسعة من مجموعة متنوعة من البروتينات، والذي يرجع إلى فقدان واحد ترجمة تنظيم البروتين، FMRP (الهشة البروتين التخلف X العقلية) 1-4. وعلاوة على ذلك، إعادة ترتيب الكروموسومات التي تؤثر على تهمة متغير X يرتبط البروتين (VCXA)، وهو بروتين، التي تدير الاستقرار مرنا والترجمة عن طريق تعديل مرنا متوجا 5، ومؤخرا ارتبط مع العجز الفكرية، في حين لم تحدد الطفرات نقطة في المرضى الذين يعانون من الإعاقة الإدراكية اعتبارا من الآن 6، 7، مما يدل على أن التخلف العقلي احظ تنبع من التعبير VCXA تغير والتعبير dysregulated من المتواجد المستهدفالإضافية. وتماشيا مع هذه النتائج، دراسة تحقق فيما اذا كانت دي نوفو أنشأت عدد نسخ الاختلافات من الجينات ترتبط مع ASD أن الازدواجية الجينات الجديدة والحذف هي عامل خطر كبير للASD 8، مما يدعم فكرة أن ارتفاع أو تناقص مستويات التعبير البروتين قد يسبب العجز الفكرية.
بشكل ملحوظ، شريطة البحوث التي أجريت مؤخرا دليلا آخر على أن مستوى التعبير عن بروتين معين يتم تعديل على وجه التحديد لمنع تجميع لها نتيجة لكميات عالية من البروتين مع هوامش أمان تقريبا أي 9. ولذلك فقد تم اقتراح أنه حتى زيادات صغيرة تكفي للحث على أمراض مثل م وPD 9. على الرغم من أن العديد من الآليات الجزيئية التي تسهم في السيطرة على بروتين تعبير يشير إلى وجود مخطط التنظيم تعقيدا في ضوء هذه النتائج، أظهرت دراسة تحقق في مستوى التعبير من أكثر من 5،000 الجينات الثدييات 10 التيطبيعة فضل مخطط أكثر شحيح جدا: وتبين أن وفرة البروتينات الخلوية إلى أن ينظم في الغالب على مستوى الترجمة 10، وبالتالي توضح أن إدارة توافر RNA يخدم أساسا لضبط تعبير البروتين.
دراسة جرعة من البروتينات المهمة (POIs) وبالتالي ليس مهما فقط لفهم وظائف الذاتية للبروتين، ولكن أيضا إلى تحقيق العديد من الأمراض وتطوير العلاجات. وهكذا، فقد شهدت العقود الأخيرة قبل عدة استراتيجيات باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي لمعالجة البوي الجرعة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع تدخل الحمض النووي الريبي لدراسة وظيفة البروتين وحتى يتم تطبيقها في التجارب السريرية لعلاج السرطان أو العين من الأمراض وكذلك لمتابعة العلاجات المضادة للفيروسات في المرضى الذين يعانون 11-13، قد تنشأ بعض الصعوبات التي يمكن أن تجعل الاستراتيجية المستحيل. على سبيل المثال، تسلسل البذور، والذي يحرك ضربة قاضية من التماثل هو comparaبلي الآثار قصيرة، وبالتالي تعزيز بعيدا عن الهدف. منذ متواليات عالية الكفاءة نادرة وتحتاج إلى أن توجد من بين آلاف الخيارات (التي استعرضت في 14)، وتحديد التسلسل الصحيح يمكن أن يكون مضيعة للوقت ومكلفة، ولكن النتائج قد تكون لا تزال مخيبة للآمال.
استراتيجية بديلة هو استهداف مباشر البوي من الأجسام المضادة. هنا، نحن لتوضيح استخدام عربة البروتين الناقل (المصنعة من قبل النشطين الحافز) للحد من توافر البروتين الخلوي، وتوظيف إعادة البناء الثلاثية الأبعاد لدراسة وظيفة البروتين التالية تدق إلى أسفل.
عزر نشاطا من عربة، في حد ذاته 2.8 كيلو دالتون الببتيد، ويستخدم لالببتيدات المكوك والبروتينات والأجسام المضادة عبر أغشية خلايا الثدييات 15. واستوعبت الزميلة الببتيد مع النقاط المهمة من خلال تشكيل جانب غير تساهمي المجمعات الجزيئات باستخدام التفاعلات الطاردة للماء، وعندها المجمعات عربة-البوي إلى خلايا في جسيم داخلي، دائرة الهجرة والجنسيةالطريقة ependent. الأهم من ذلك، أشير إلى عربة للا تؤثر على توطين الخلايا من البروتينات مكوكية، ولا لممارسة تأثيرات السامة للخلايا أو أن تؤثر على النشاط البيولوجي للحمولتها 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحلول المالية
- Resuspend ومسحوق مجفف بالتجميد عزر نشط في H 2 O معقمة لتركيز النهائي من 2 ميكروغرام / ميكرولتر. اضغط بعناية لخلط.
- إعداد قسامات صغيرة (على سبيل المثال، 12 ميكرولتر لكل منهما، ويطلب 2 ميكرولتر في رد الفعل) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. إعداد الخلايا
- البذور خلايا الثدييات مثل الخلايا HEK293 أو الخلايا العصبية الأولية على 24 لوحة جيدا في 500 ميكرولتر المتوسطة النمو بما في ذلك المضادات الحيوية.
ملاحظة: عند استخدام الخلايا العصبية، البذور الخلايا في كثافة منخفضة وتستخدم سوى صفين الوسطى من 24 لوحة جيدا. وبالتالي فإن كل جانب لديهم نظيره فارغة الى الميناء المتوسط أثناء الحضانة (الخطوة 4.2). عند التعامل مع الخلايا العصبية، ودائما تأكد من أن الخلايا لا تبقى خارج الحاضنة لأكثر من بضع دقائق. - ثقافة الخلايا في ظروف مناسبة (ترطيب، 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية) حتى الخلايا هي التطبيق. 50٪متموجة.
ملاحظة: عند استخدام الخلايا العصبية، ثقافة الخلايا حتى المرحلة التنموية المرجوة يتم التوصل إلى وتغيير التطبيق. 25-50٪ من المتوسط مرتين في الأسبوع. المتوسطة: Neurobasal المتوسطة (التي تحتوي على 1X B27، 5 مم L-الجلوتامين و1X البنسلين والستربتوميسين، مقارنة مع المرجع 16).
3. عربة تشكيل مجمع
- في رد الفعل، وتمييع 0،1-2 ميكروغرام من البوي أو الأجسام المضادة المقابلة وكذلك البروتين السيطرة، أو مراقبة الأجسام المضادة، على التوالي، في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يعمل هذا الأسلوب أيضا مع المجمعات الجزيئات تتكون من الأجسام المضادة الأولية والثانوية ملزمة مسبقا (حزب المحافظين "ممثل النتائج، الشكل 1). خلط وزيادة ونقصان. - لكل عينة، وتمييع 2 ميكرولتر عربة حل الأسهم في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني باستخدام أنابيب منفصلة من أجل تجنب الارتباط الذاتي للعربة. خلط وزيادة ونقصان.
- نقل البوي المخفف أو الأجسام المضادة (الخطوة 3.1) إلى تخفيف عربة بواسطة الماصةتينغ. خلط وزيادة ونقصان.
- احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (والمجمعات عربة-البوي تشكيل).
4. ترنسفكأيشن من الخلايا
- تمييع المجمعات عربة (الخطوة 3.4) في 100 ميكرولتر المتوسطة النمو قبل تحسنت (37 درجة مئوية، أي إضافات). إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام قبل تحسنت برنامج تلفزيوني 1X.
ملاحظة: عند استخدام الخلايا العصبية، لا تجاهل المتوسطة، سيتم إعادة استخدامها. يبقيه عند 37 درجة مئوية. لغسل، استخدم برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.5 ملي MgCl 2 و CaCl 2.
اقتراح: الحفاظ على المتوسط في الآبار الفارغة في حين تفرخ لوحة (الخطوة 4.5). - تطبيق حل معقد عربة (الخطوة 4.1) إلى الخلايا والصخور الخلايا بلطف لضمان التوزيع حتى من الحل. تنمو الخلايا تحت الظروف القياسية (الخطوة 2.2) لمدة 1 ساعة. إضافة المصل إلى تركيز النهائي من 10٪. عند استخدام الخلايا العصبية، إضافة المتوسطة من الخطوة 4.1. تنمو الخلايا لمدة 1-2 ساعات أكثر.
لاحظ الفترة حضانة الأمثل يعتمد على حجم وخصائص البضائع وقد تحتاج إلى تعديل تجريبيا. الاقتراحات التالية قد تكون بمثابة المبدأ التوجيهي: للحصول على الببتيدات، 1 ساعة عادة ما تكون كافية، للبروتينات ينصح 1-2 ساعة، عن الأجسام المضادة 2 ساعة، ولترنسفكأيشن من الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة 4 ساعة. - خلايا عملية التحليل على النحو المعتاد. يرجى ملاحظة: هذه التقنية متوافقة مع التجارب باستخدام بروتوكولات تثبيت وكذلك التصوير الحي.
5. التصوير
- باستخدام الليزر مجهر المسح، واتخاذ مداخن ض الخلايا و / أو المقصورات خلية ذات الاهتمام باستخدام ما يقرب من 0.25-0.5 ميكرون بعد. المسافة طبقة دقيقة تعتمد على حجم وهيكل من أجل إعادة بنائها وتحتاج إلى أن تحدد بشكل فردي.
6. إعادة الإعمار
- في الخطوات التالية، استخدم أسفل خروج للتبديل بين تحديد وانتقل، CNTR لتحديد كائنات متعددة عن طريق النقر سن لهم ومفتاح التحول إلى قطع الكائنات (حزب المحافظين. الخطوة 6.10).
- فتح ملف مغلق في Imaris.
- باستخدام تعديل العرض لكل قناة، على النقيض من الصورة حتى ألمع هياكل تصل إلى التشبع. يرجى ملاحظة أن هذا التعديل لن تؤثر على تشييد سطح، فإنه لا يؤدي إلا إلى مساعدة مجرب في العتبة الصورة.
- انقر على إضافة السطوح جديدة رمز. سيتم فتح المعالج.
- اختر: الجزء فقط منطقة الفائدة. انتقل إلى الخطوة التالية.
- ضبط هوامش مربع التحديد لتناسب وجوه الخاص بك من الفائدة. يرجى أن تضع في الاعتبار أن الصورة لديها 3 الأبعاد والتي تحتاج التحديد إلى أن تعدل في الطائرة ض كذلك. إذا كان شكل مستطيل مربع التحديد لا يجب أن يطابق موضع اهتمام بشكل صحيح، وتحويل الكائن و / أو توسيع مربع حتى هي جزء لا يتجزأ جميع الهياكل المطلوبة. يمكن إزالة الكائنات غير المرغوب فيها في وقت لاحق (حزب المحافظين. الخطوة 6.10). تقدم.
- حدد الفصل المناسبannel. مستوى التفاصيل المساحة بالمتر المربع أو القطر المجال يجب تعيين لتتناسب مع الهياكل يعاد بناؤها. اعتمادا على خصائص إشارة، إما الكثافة المطلقة أو التباين المحلي يمكن استخدامها. عموما، على النقيض المحلي يعمل بشكل أفضل لإشارات منتشر. في أي حال، يجب أن يتم تعديلها بشكل منفصل لكل إشارة أو بنية الفائدة، على التوالي الإعدادات.
- باستخدام أداة استيفاء الحد الأدنى، وإعادة بناء هيكل الفائدة.
- استكمال إعادة الإعمار من خلال النقر على السهم أسفل الأخضر.
- ضبط الكائن مزيد باستخدام أداة القلم الرصاص لخفض وإزالة الأسطح كما هو مطلوب. فمن الممكن فقط لقطع في اتجاه الشمال والجنوب، وبالتالي، إمالة الصورة من أجل خفض الكائن المطلوب.
- الحصول على قياسات حجم والمساحة وكثافة لكل سطح عن طريق تحديد الإحصاء، الإحصائيات المفصلة، ومتوسط القيم.
- (خطوة اختيارية) لمراقبة إحصاءات مرمزة (حزب المحافظين. 2E الشكل وF)، حدد علامة التبويب لون السطح المقابل ووضع علامة "الإحصاء الأكواد 'بدلا من' قاعدة '. سيتم عرض عدة خيارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الفقرات التالية، نتائج نموذجية توضح ضربة قاضية وظيفية من البوي (Simiate، لمزيد من التفاصيل يرجى الاطلاع على 16، 17) باستخدام ترد كاشف عربة وتدخل الأجسام المضادة. النتائج تثبت أن تقلص تعبير عن Simiate يضعف النشاط النسخي، وبطريقة تعتمد على الجرعة، يستحث موت الخلايا المبرمج، وبلغت ذروتها في معدلات وفيات أكثر من 99٪ إذا تم تطبيق كميات الأجسام المضادة أعلى (> 1 ميكروغرام الضد) (نشرت هذه الاكتشافات سابقا في 16). هنا، نقدم الآن التقنيات والبروتوكولات المستخدمة في التفاصيل وإظهار علاوة على ذلك كيف كاشف عربة يمكن استخدامها ل transfect الخلايا العصبية الحصين فصل في الثقافات الأولية.
من أجل التحقيق في ما إذا الببتيدات عربة تسمح للمكوكية كفاءة من الأجسام المضادة، وبوجه خاص، إذا بقيت هذه الأجسام المضادة وظيفية خلال هذا الإجراء، عبرنا عن FLAG-Simiate لمدة 24 ساعة في الخلايا HEK293، وبعد ذلك transfected الخلايا باستخدام عربة يقترن الجزيئات rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (الشكل 1). وأعرب عن التركيبة-FLAG Simiate بشكل جيد من قبل HEK293 الخلايا ويموضع إلى somata فضلا عن نواة هذه الخلايا (الشكل 1A). هنا، مجموعات FLAG-Simiate بشكل ملحوظ (الشكل 1B)، مما يعكس توزيع مبقع من الذاتية Simiate في النواة.
ويبدو أن المجمعات الأجسام المضادة مكوكية عبر الغشاء الخلوي في تجمعات (الشكل 1A، في الحمراء، السهام الحمراء)، ولكن الأجسام المضادة سراح كشف FLAG-Simiate على وجه التحديد كما هو مبين من قبل colocalization العميق FLAG-Simiate والجزيئات rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (الشكل 1B ، باللون الأصفر، السهم الأصفر). اعتبارا من الملاحظة، التجربة ليس فقط توضح أن الأجسام المضادة لا تزال وظيفية خلال عربة بوساطةغشاء مرور، ولكن أن تكون أيضا قادرة على دخول النواة. منذ حجمها يستبعد الأجسام المضادة من الشروع النواة عن طريق نشر، فمن المرجح أن إشارة توطين النووية الحالية في عربة نفسها يسهل النبات من الجزيئات rbαSimiate-gtαrbAlexa568 داخل النواة. في الواقع، لوحظ تجمعات الأجسام المضادة أيضا في أو في، على التوالي، ومقصورة النووية (1B الشكل، السهام الحمراء).
باستخدام rbαSimiate-عربة مجمعات في استنزاف وظيفيا Simiate الذاتية في الخلايا HEK293 (الشكل 2)، وجدنا أننا كنا قادرين على استهداف ما يصل إلى 80٪ من المواقع rbαSimiate ملزمة، وذلك باستخدام 2.0 ميكروغرام من الأجسام المضادة 16. ومن المثير للاهتمام، في حين يتنقل الأجسام المضادة gtαrbAlexa568 وحدها في كلوة كان 293 الخلايا أي تأثير واضح على ظهور بقع النووية (الشكل 2A-C)، وفقدان Simiate ظيفية نصف القطر بقع النووية (الشكل 2D-F </ قوي>، حزب المحافظين 16) كما يتضح من إعادة البناء الثلاثية الأبعاد (الشكل 2B، C مقابل E، F)، وبطريقة تعتمد على الجرعة، موت الخلايا المبرمج الناجم عن (الشكل 3، حزب المحافظين 16).
وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية هي حساسة جدا لتأثيرات سامة، ونحن أيضا تطبيق هذه التقنية في الثقافات الحصين الابتدائية (الشكل 4). عن طريق النفق فحص وMAP2 تلطيخ لتحليل سلامة الخلية، لم نعثر على أي أثر على بقاء الخلايا العصبية عند المقارنة بين خلايا وهمية أو غير المعالجة وعربة المعالجة (التطبيق الخلايا الإيجابية 20-25٪ النفق بعد 1 + 4 ساعات من العلاج، حزب المحافظين 4.4 -4.6). وبالتالي، نحن اختبار الأجسام المضادة عربة بوساطة مكوكية في الثقافات العصبية. التالي نظام التطبيق نفسه، وشوهدت gtαgpAlexa568 تجمعات الأجسام المضادة لمتفاوتة تمتد في حوالي 83٪ من الخلايا، حيث وقعت في somata وكذلك النوى (الشكل 5A). ويدعم هذه الملاحظات أبعد بيا تحليل ثلاثي الأبعاد (الشكل 5B) وبشكل وثيق إعادة تجميع الصورة ينظر في الخلايا HEK293، جنبا إلى جنب مما يدل على أن تقنية عربة يمكن أن تستخدم بنجاح ل transfect نأت الخلايا العصبية قرن آمون الأولية كذلك.
تم الكشف عن الشكل 1. FLAG-Simiate التي كتبها Simiate الاجسام المضادة المحددة مكوكية إلى خلايا HEK293 باستخدام عربة كاشف للحصول على تجارب تدخل الأجسام المضادة، وبرسمبل الأجسام المضادة rbSimiate-gtrbAlexa568 قبل تشكيل معقد عربة-الأجسام المضادة. أ) HEK293 الخلايا معربا عن الموسومة FLAG Simiate. تجمعات الأجسام المضادة Simiate تدخل سوما فضلا عن نواة التالية التطبيق، حيث colocalize تحديدا مع العلم Simiate. نقاط الجولة: تجمعات عربة-rbSimiate-gtrbAlexa568 (الأسهم الحمراء). ب) والتكبير الطاقة العالية في المنطقة محاصرفي الفقرة (أ) يدل على colocalization من FLAG-Simiate وعربة بوساطة إشارة Simiate (الأسهم الصفراء). يرجى ملاحظة وجود الأجسام المضادة تجمع عربة في النواة (السهم الأحمر). شريط الحجم: 10 ميكرون.
الرقم الأجسام المضادة 2. Simiate محددة مكوكية إلى خلايا HEK293 تتداخل مع وظائف الخلوية الذاتية Simiate. A، B) HEK293 الخلايا تعامل مع عربة-gtrbAlexa568 (1 ميكروغرام) بمثابة السيطرة. باللون الأحمر، يظهر الذاتية Simiate في اللون كاذبة، في حين لا يتم عرض تجمعات عربة-gtrbAlexa568. وصفت بقع النووية باستخدام SC35 البروتين علامة (باللون الأخضر)، في حين تم تحديد الخلايا أفكارك التي كتبها النفق فحص (باللون الأزرق). ب) إعادة بناء بقع النووية من المنطقة محاصر في A. C) إعادة بناء المنطقة نفسها توضح كميات البقع والمناطق السطحيةبطريقة ونا مميزا. D، E) HEK293 الخلايا بعد العلاج عربة-rbSimiate (0.5 ميكروغرام). وتظهر الذاتية Simiate وكذلك عربة-rbSimiate-gtrbAlexa568 تجمعات باللون الأحمر، في حين يتم عرض بقع النووية والخلايا أفكارك وفقا لألف وباء E) البقع النووية بناؤها من المنطقة محاصر في D. F) ويظهر نفس المنطقة كما المبين للC. يرجى ملاحظة ظهور نصف القطر وتجميع النقط (جميع عمليات إعادة البناء: برنامج Imaris). شريط النطاق في C، F: 2 ميكرون. جميع الحانات على نطاق والأخرى: 10 ميكرون. 1) لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وتستخدم الخلايا فقط غير أفكارك.
الشكل 3. جرعات عالية من عربة-rbSimiate-gtrbAlexa568 لحث على موت الخلايا واسعة النطاق. وعولج HEK293 الخلايا مع 2 ميكروغرام من عربة-gtrbAlexa568 أو عربة-rbSimiate-gtrbAlexa568، على التوالي (سواء شركات LEXES يظهر باللون الأخضر والمشار إليها السهام وكذلك تكبير). تم تطبيق النفق وضع العلامات (باللون الأزرق) لتحديد الخلايا أفكارك. شريط الحجم: 10 ميكرون.
الشكل 4. عربة ليست سامة للخلايا العصبية الحصين الابتدائية. AB) DIV كانت 7 الخلايا العصبية إما وهمية المعالجة (المتوسطة، A) أو يتعرضون لكاشف عربة (ب) على النحو المبين في بروتوكول لجسم مكوكية (1 + 4 ساعات، حزب المحافظين. 4،4-4،6). في حين SC-35، وهو بروتين علامة للحصول على بقع النووية، وخدم لتسمية ماكينات النسخ والربط، تم تطبيق النفق تلطيخ لتحديد الخلايا أفكارك (الأسهم الخضراء). C) غير المعالجة وعربة تعامل DIV 16/17 الخلايا العصبية. تم تطبيق MAP2 تلطيخ لتصور أشجار شجيري. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.
pload / 53049 / 53049fig5highres.jpg "العرض =" 700 "/>
الرقم 5. عربة بوساطة ترنسفكأيشن متوافق مع الثقافات العصبية. أ) ممثل الخلايا العصبية الحصين الابتدائية من شعبة 5. يظهر في الصورة-توقعات ض من مداخن التي يتم التقاطها باستخدام مجهر المسح بالليزر (ليزر المسح مجهر 710، زايس). شريط الحجم: 10 ميكرون. يرجى ملاحظة حدوث المجمعات عربة-gtgpAlexa568 (الحمراء) في النواة وسوما من الخلية. يشار ب) إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد (البرمجيات Imaris) من نواة وكذلك تجمعات gtgpAlexa568 هو مبين في A. سوما والتشعبات من الخلايا العصبية التي كتبها النقاط الرمادية، والتي المقطر من وسم الذاتية Simiate. شريط الحجم: 10 ميكرون. كمية الأجسام المضادة transfected: 0.25 ميكروغرام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نقدم بروتوكول لدراسة أهمية مستويات بروتين تعبير في السيطرة على الوظائف الخلوية بطريقة جرعة مدفوعة. بروتوكول صفها يسمح للتلاعب ضبطها غرامة التعبير البروتين في مختلف أنواع خلايا الثدييات، بما في ذلك الخلايا العصبية قرن آمون، وبالتالي تسهيل الدراسات التفصيلية وظيفة البروتين على المستوى الخلوي.
على الرغم من أن تدخل الحمض النووي الريبي يمثل استراتيجية معروفة إلى تنظيم أسفل النقاط المهمة، فقد لعيوب (حزب المحافظين 14). ليس فقط تحديد تسلسل محدد للغاية وفعالة يمكن أن يكون مكلفا ويستغرق وقتا طويلا، ولكن أيضا نشوء حيوي نص داخل الخلية قد يسبب نتائج غير متوقعة منذ تراكم يبني RNA السامة، الزائد للجهاز الصادرات النووية فضلا عن التشبع من رني الذاتية أنظمة المعالجة قد يؤدي إلى آثار بعيدا عن الهدف أو عدم الكفاءة. أيضا، على كميات عالية من ناقلات رني الخارجية قد تدفع تلزم جانب الصمتآثار pecific كذلك، والتشويش على توازن الخلية.
الأجسام المضادة، من ناحية أخرى، لا تحتاج إلى مزيد من المعالجة من قبل الأجهزة الذاتية بمجرد أن دخلت الخلية، وتكون فعالة على الفور، وبالتالي دعم ليس فقط التجريب لتوفير الوقت، ولكن أيضا التحقيق في العمليات الخلوية فورية. على الرغم من أنها قد تكون غير محددة الآثار بعيدا عن الهدف، أيضا، تزايد عدد الأجسام المضادة تتميز جيدا ومحددة للغاية المتاحة يجعل هذا البديل يستحق التفكير. منذ تسليم المجمعات الجزيئات في الخلايا يمثل عقبة رئيسية، وقد تم تطوير تقنيات ترنسفكأيشن مختلفة خلال السنوات الأخيرة، بما في ذلك الببتيدات R8 وazoR8 18 وكذلك microsphere 19 بوساطة مكوكية. في حين أشار R8 وazoR8 أن تتصرف على نحو مماثل لعربة 18، تم العثور على المجهرية بحاجة إلى 24 ساعة لامتصاص 19، وهي فترة أطول بكثير من ذاكرة عربة بوساطةمقاطع الغشاء وقد يسبب صعوبات عند دراسة أسرع وجرعة الاستجابات الخلوية التابعة.
بشكل ملحوظ، وتحولت تقنية عربة إلى أن تكون قابلة للتطبيق على الثقافات الحصين الابتدائية، التي تعتبر حساسة جدا للعلاجات وصعبة ل transfect. حتى الآن، وقد استخدمت حاملات عربة لتحليل وظيفة البروتين في الثقافات العظمية الأولية 20 وكذلك في خط الخلية العصبية-الورم NG108-15 21، الفرخ الجذرية الظهرية الثقافات العقد 21، أو في الخلايا PC12 22، والتي تنبع من العصبية هي قمة، ولكن لم ترد تقارير عن أي تطبيق في مزارع الخلايا المشتقة من الجهاز العصبي المركزي تتوفر بعد. منذ الكواشف ترنسفكأيشن التقليدية مثل Lipofectamine غير فعالة في هذه الخلايا وتعداء الفيروسي معقدة، عربة قد تمثل بديلا للاهتمام.
والجدير بالذكر أن لوحظ عربة نفسها في توطين إلى النواة 15، وربمابسبب إشارة PKKKRKV توطين النووي (حزب المحافظين 23). وتماشيا مع هذه الملاحظات، وجدنا أن عربة ترنسفكأيشن بوساطة الجزيئات rbαSimiate-gtαrbAlexa568 أسفرت عن وضع العلامات واضحة من المقصورات النووية مثل بقع النووية. في الواقع، تم الكشف عن الأجسام المضادة للمراقبة مثل gtαgpAlexa568 أيضا في النواة على حد سواء، HEK293 وخلايا قرن آمون الأولية. منذ الأجسام المضادة، ولا سيما في التجمعات، هي أبعد ما تكون كبيرة جدا للشروع النواة عن طريق الانتشار ومنذ Simiate نفسه لا يحتوي على أي إشارة توطين النووية المعروفة، وإنما يدخل نواة عبر نشر، فمن المرجح أن إشارة عربة تشارك في توطين النووية من الأجسام المضادة. بدلا من ذلك، نقل في تجمعات البروتين أكبر ويمكن أيضا أن يكون ممكنا، على الرغم من أن هذا لا يفسر وجود gtαgpAlexa568 في نواة الخلايا العصبية الحصين مثقف من الفئران، حيث لا يوجد هدف لهذه الأجسام المضادة في هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، الاشتراكيةتم العثور على الامتحانات التنافسية الوطنية عربة لعدم التدخل في توطين الطبيعي من الببتيدات والبروتينات 15 مكوكية، هذه الملاحظات تشير إلى أن الأجسام المضادة تتصرف بشكل مختلف.
في الواقع، عندما يتنقل مجمعات الأجسام المضادة مثل عربة-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (الشكل 1) أو عربة-gtαgpAlexa568 (الشكل 5) عبر الأغشية الخلوية، فإنها تظهر في مجموعات، والتي تذوب فقط، عندما البروتينات المستهدفة المناسبة مثل Simiate الذاتية أو FLAG-Simiate هي موجودة (فقط في الشكل 1). باستخدام عربة مجمعات الأجسام المضادة في بانيات، لاحظ سليم والكليات نفس تأثير 20. وبالنظر إلى أن عربة وقد تجلى عدم التدخل في توطين الببتيدات والبروتينات 15، وتشير هذه الملاحظات أن عربة تجميعها الأجسام المضادة تفكيك فقط في حالة وجود الآلية الجزيئية مثل تفاعل الأجسام المضادة الهدف، أن يتغلب على إنتر مسعورالإجراءات بين عربة والبضائع الأجسام المضادة لها، وبالتالي يشجع التفكيك. لأن الأجسام المضادة هي أشد من الببتيدات أو معظم البروتينات، ولهم، بسبب شكلها، على سطح كبير، فإنها قد ربط مع ارتفاع أعداد الجزيئات عربة و / أو التفاعل أكثر حزما مع الببتيدات عربة، التي من شأنها أن بالتالي تعزيز المزيد عربة يحركها سلوك الأجسام المضادة. ومن ثم فإن عدم وجود آلية التفكيك يؤدي إلى ظهور متفاوت المسافات وتوطين النووية من البضائع الأجسام المضادة (الشكل 5).
مجتمعة، تشير البيانات إلى أن عربة بشكل خاص مناسبة تماما لمعالجة وظيفة البروتينات المقيمين في النواة، وأنها قابلة للتطبيق في مجموعة متنوعة من أنواع خلايا الثدييات بما في ذلك الخلايا العصبية الحصين الابتدائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد العمل المقدم في أجزاء بتمويل من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة / مؤسسة أبحاث الهشة العاشر من برنامج الشراكة كندا إلى RD، مؤسسة جيروم لوجون إلى RD، وInterdisziplinäres Zentrum يقع FÜR klinische Forschung من جامعة إيرلانغن نورمبرغ الى RD و من الألمانية للبحوث إلى RD والطاقة المتجددة. الكتاب أود أن أشكر انغريد زنجر للمساعدة التقنية مع صيانة زراعة الخلايا وكذلك الأستاذ محمد اجنر لصنع ناقلات pCMV5-FLAG المتاحة. يرغب البلاغ كذلك أن أشكر بشكل خاص ناديا شرودر للدعم مفيدة في تصوير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20 °C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37 °C before using |
| 1x B27 | Life technologies | 17504044 | store at -20 °C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20 °C |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | store at -20 °C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
References
- Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
- Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
- Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
- Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
- Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
- Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
- Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
- Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
- Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
- Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
- DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
- Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
- Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
- Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
- Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
- Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
- Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
- Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
- Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
- Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).
