Abstract
Eine strenge Verwaltung der Proteinexpression ist nicht nur wichtig für jeden Organismus am Leben, sondern auch eine wichtige Strategie Proteinfunktionen in Zellmodellen zu untersuchen. Daher erfunden neuere Forschung verschiedene Werkzeuge Proteinexpression in Säugetierzelllinien oder Tiermodellen, einschließlich RNA und Antikörper Interferenz abzuzielen. Während die erste Strategie viel Aufmerksamkeit in den letzten zwei Jahrzehnten gesammelt hat, Peptide, die eine Translokation von Antikörper Cargos durch Zellmembranen und in Zellen vermitteln, erhalten viel weniger Interesse. In dieser Publikation stellen wir ein detailliertes Protokoll, wie ein Peptidträger namens Chariot in humanen embryonalen Nierenzellen sowie in primären Neuronen im Hippocampus zu nutzen, um Antikörper Interferenzexperimente durchführen und weiter die Anwendung von dreidimensionalen Rekonstruktionen bei der Analyse von Protein-Funktion veranschaulichen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Chariot ist, wahrscheinlich aufgrund seiner Kernlokalisationssignal, particularly gut geeignet Proteine im soma und den Kern mit Wohnsitz Ziel. Bemerkenswert ist, wenn Chariot zu primären Hippokampus-Kulturen anwenden, wandte sich das Reagenz überraschend gut aus von dissoziierten Neuronen in Kauf genommen werden.
Introduction
Eine strenge Kontrolle der Proteinexpression ist für jeden lebenden Organismus seine eigene Entwicklung als auch zu befehlen, als auf Umweltsignale zu reagieren. Daher wurde eine Vielzahl von Mechanismen erfunden während der Evolution genau das Expressionsniveau jedes von dem App kodierten Proteins regulieren. 20.000 Gene in jeder eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt ihres Lebens existiert. Es findet in den verschiedenen Phasen der Proteinproduktion reichen die Regulationsmechanismen aus dem Management der Chromatinstruktur, Transkription und RNA auf die Richtung der posttranslationalen Proteinmodifikationen Handhabung, Transport und Abbau.
Es ist daher nicht verwunderlich, dass Störungen in der zugrunde liegenden molekularen Maschinerien und veränderten Proteinexpressionsniveaus haben mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs oder geistiger Behinderung in Verbindung gebracht worden. Tatsächlich an der herausragenden Komplexität der neuronalen Entwicklung und Säugetier-Gehirn-Funktion suchen, die Sensivität dieser hochentwickelten Systemen zu Veränderungen in der Proteinexpression manifestiert sich in einer Reihe von bekannten intellektuellen Defiziten einschließlich Alzheimer und Parkinson-Krankheit (AD und PD) sowie Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) wie das Fragile-X-Syndrom (FXS). Letztere Krankheit wird durch eine umfangreiche misexpression einer Vielzahl von Proteinen aus, die auf den Verlust eines einzelnen Übersetzungsregel Protein, FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) 1-4 zurückzuführen ist. Darüber hinaus X - chromosomale Protein A Chromosomenaberrationen , die Variable Ladung zu beeinflussen (VCXA), ein Protein, das mRNA durch Modifizierung der mRNA - Stabilität und Translation verwaltet 5 Capping, haben vor kurzem mit geistigen Defiziten in Verbindung gebracht worden, während Punktmutationen bei Patienten mit kognitiven Behinderungen wurden nicht identifiziert ab sofort 6, 7, was darauf hindeutet , dass die beobachteten psychischen Beeinträchtigungen von veränderten VCXA Ausdruck und dysregulated Ausdruck seiner Ziel Prote stammenins. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen einer Studie untersucht , ob De - novo - Kopienzahl Variationen von Genen , die mit ASD verbunden sind , festgestellt , dass neuartige Genduplikationen und Streichungen sind ein bedeutender Risikofaktor für ASD 8, also die Idee unterstützen , dass eine erhöhte oder verminderte Proteinexpressionsniveaus führen kann intellektuelle Defizite.
Neuere Forschungen weiterer Beweis bereitgestellt bemerkenswert, dass das Expressionsniveau eines gegebenen Proteins genau seine Aggregation als Folge der hohen Proteinmengen nahezu ohne Sicherheitsabstände eingestellt 9 zu verhindern. Es wurde daher vorgeschlagen , dass auch kleine Inkremente ausreichen 9 Krankheiten wie AD und PD zu induzieren. Obwohl die Vielzahl von molekularen Maschinen zur Proteinexpressionskontrolle beiträgt eine komplexe Regelung schlägt Schema in Anbetracht dieser Feststellungen wurde eine Studie zur Untersuchung der Expression von mehr als 5.000 Säugetiergenen 10 Untersuchung gezeigt , dassNatur bevorzugt , ein sparsameres Schema: Die zelluläre Fülle von Proteinen wurde überwiegend auf der Ebene der 10 Übersetzung geregelt gezeigt werden, was zeigt , dass das Management von RNA Verfügbarkeit dient in erster Linie der Proteinexpression zur Feinabstimmung.
Untersuchung der Dosis von Proteinen von Interesse (POI), ist daher nicht nur wichtig für das Verständnis der endogene Funktionen eines Proteins, sondern auch auf die Untersuchung vieler Krankheiten und der Entwicklung von Therapien. So haben im vergangenen Jahrzehnten den Fortschritt von mehreren Strategien gesehen RNA-Interferenz mit POI Dosierung zu manipulieren. Obwohl RNA - Interferenz stark Proteinfunktion zu untersuchen verwendet wird und auch in klinischen Studien angewandt wird Krebs oder Augenerkrankungen sowie zu verfolgen antivirale Therapien bei Patienten 11-13, einige Schwierigkeiten auftreten können , zu behandeln , die die Strategie unmöglich machen könnten. Beispielsweise die Samen-Sequenz, die den Zuschlags durch Homologie antreibt, ist comparakurze ble, damit die Förderung der Off-Target-Effekte. Da hocheffiziente Sequenzen selten und müssen unter Tausenden von Optionen ( beschrieben in 14), die Identifizierung der richtigen Reihenfolge gefunden werden kann zeitraubend und kostspielig sein, führt aber immer noch enttäuschend sein kann.
Eine alternative Strategie ist, um direkt die POI durch Antikörper zielen. Hier zeigen wir die Verwendung des Proteinträger Chariot (hergestellt von Active Motif) zelluläre Protein Verfügbarkeit zu reduzieren, und der Einsatz von dreidimensionalen Rekonstruktionen folgende Proteinfunktion knock-down zu studieren.
Das aktive Motiv des Chariot, selbst ein 2,8 kDa Peptid, wird Shuttle Peptide, Proteine und Antikörper durch Membranen von Säugetierzellen 15 verwendet. Die Peptid assoziiert mit POIs durch Bildung nicht-kovalent gekoppelt makromolekularer Komplexe verwendet hydrophobe Wechselwirkungen, woraufhin Chariot-POI-Komplexe werden in Zellen in einer Endosomen-ind internalisiertependent Weise. Beeinflussen weder die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen pendelte wichtiger ist , wurde Chariot zu deutet, noch zytotoxischen Wirkungen auszuüben oder die biologische Aktivität von seiner Ladung 15 zu beeinflussen.
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Protocol
1. Stammlösungen
- Resuspendieren des lyophilisierten aktiven Motiv Pulver in sterilem H 2 O auf eine Endkonzentration von 2 ug / ul. Tippen Sie vorsichtig zum Mischen.
- Bereiten Sie kleine Teilmengen ( zum Beispiel 12 & mgr; l jeweils 2 ul pro Reaktion benötigt werden) und speichern sie bei -20 ° C.
2. Herstellung von Zellen
- Seed Säugerzellen wie HEK293-Zellen oder primären Neuronen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen in 500 & mgr; l Wachstumsmedium mit Antibiotika.
HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, die Zellen bei geringer Dichte Saatgut und verwenden Sie nur die beiden mittleren Reihen der 24-Well-Platte. Jede Vertiefung wird also ein leeres Gegenstück, das Medium während der Inkubation (Schritt 4.2) zu beherbergen. Wenn Neuronen Handhabung, immer darauf achten, dass die Zellen nicht außerhalb des Inkubators gehalten länger als ein paar Minuten. - Kultur die Zellen bei geeigneten Bedingungen (befeuchteten, 5% CO 2 und 37 ° C) , bis die Zellen app sind. 50%konfluent.
HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, Kultur die Zellen, bis die gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist und App ändern. 25-50% des Mediums zweimal pro Woche. Medium: Neurobasal Medium (enthaltend 1x B27, 5 mM L-Glutamin und 1x Penicillin und Streptomycin; Vergleichen mit ref 16).
3. Chariot Komplexbildung
- Pro Reaktion, 0,1-2 ug des POI oder den entsprechenden Antikörper sowie das Kontrollprotein oder Kontrollantikörper, die jeweils in 50 ul PBS verdünnen.
HINWEIS: Die Technik arbeitet auch mit makromolekularen Komplexen , bestehend aus Vor-gebundenen primären und sekundären Antikörpern (cp 'Repräsentative Ergebnisse', Fig . 1). Mix und Spin. - Für jede Probe verdünnen 2 ul Chariot Stammlösung in 50 ul PBS mit getrennten Röhren, um die Selbstassoziation von Chariot zu vermeiden. Mix und Spin.
- Übertragen Sie die verdünnte POI oder Antikörper (Schritt 3.1) an die Chariot Verdünnung durch pipettierenting. Mix und Spin.
- Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur (Chariot-POI-Komplexe bilden).
4. Transfektion von Zellen
- Verdünnen Sie die Chariot-Komplexe (Schritt 3.4) in 100 & mgr; l vorgewärmten Wachstumsmedium (37 ° C, ohne Zusätze). Entfernen Sie das Medium und waschen Sie einmal die Zellen vorgewärmt 1x PBS.
HINWEIS: Wenn Neuronen verwenden, sollten Sie das Medium nicht zu verwerfen, wird es wieder verwendet werden. Halten Sie es bei 37 ° C. Zum Waschen verwenden PBS , das 0,5 mM MgCl 2 und CaCl 2.
Vorschlag: halten das Medium in leeren Brunnen, während die Platte Inkubation (Schritt 4.5). - Tragen Sie die Chariot-Komplex-Lösung (Schritt 4.1) zu den Zellen und die Zellen schaukeln sanft eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu gewährleisten. Wachsen die Zellen unter Standardbedingungen (Schritt 2.2) für 1 Stunde. Hinzufügen Serum bis zu einer Endkonzentration von 10%. Wenn Neuronen verwenden, fügen Sie das Medium aus Schritt 4.1. Wachsen die Zellen für 1 bis 2 weitere Stunden.
Beachten Sie dasZeit optimale Inkubationszeit hängt von der Größe und den Eigenschaften der Ladung und müssen empirisch eingestellt werden. Die folgenden Vorschläge können als Richtlinie dienen: Für Peptide, 1 h in der Regel ausreichend ist, die für Proteine 1-2 Stunden empfohlen werden, für Antikörper 2 h und für die Transfektion von Neuronen mit Antikörpern 4 Stunden. - Prozess Zellen für die Analyse wie üblich. Bitte beachten Sie: die Technik, mit Experimenten ist kompatibel mit Fixierung Protokolle sowie Live-Bildgebung.
5. Imaging
- Mit Hilfe eines Laser-Scanning-Mikroskop, nehmen Sie z-Stapeln von Zellen und / oder Zellräumen von Interesse etwa 0,25-0,5 & mgr; m Abstand verwenden. Die genaue Schichtabstand hängt von der Größe der Struktur rekonstruiert werden und muss individuell bestimmt werden.
6. Wiederaufbau
- In den folgenden Schritten, verwenden Sie die Esc Boden mehrere Objekte zwischen Auswahl und Navigation, Cntr zu wechseln auswählen, indem Sie on sie und Shift-Taste zu schneiden Objekte (vgl. Schritt 6.10).
- Öffnen Sie die LSM-Datei in Imaris.
- Mit der Display-Einstellung für jeden Kanal, Kontrast das Bild, bis die hellsten Strukturen Sättigung erreichen. Bitte beachten Sie, dass diese Einstellung die Oberflächenkonstruktion nicht beeinflussen, ist es nur der Experimentator zu unterstützen dient das Bild in Schwellwertbildung.
- Klicken Sie auf das Hinzufügen neuer Oberflächen-Symbol. Ein Assistent wird geöffnet.
- Wählen Sie: Segment nur eine Region of Interest. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt.
- Passen Sie die Ränder der Auswahlbox Ihr Objekt von Interesse zu passen. Bitte beachten Sie, dass das Bild 3 Dimensionen hat und dass die Auswahl muss auch in der z-Ebene eingestellt werden. Wenn die rechteckige Form der Auswahlbox nicht das Objekt von Interesse richtig passen sollte, schalten Sie das Objekt und / oder das Feld vergrößern, bis alle erforderlichen Strukturen eingebettet sind. Unerwünschte Objekte können später entfernt werden (vgl. Schritt 6.10). Vorgehen.
- Wählen Sie die entsprechende channel. Die Fläche Detailebene oder Kugeldurchmesser sollten die Strukturen werden rekonstruiert übereinstimmen eingestellt werden. In Abhängigkeit von den Signaleigenschaften, entweder absolute Intensität oder Local Contrast verwendet werden. Im Allgemeinen arbeitet Lokaler Kontrast besser für diffuse Signale. In jedem Fall müssen die Einstellungen für jedes Signal oder interessierende Struktur separat eingestellt werden, respectively.
- Mit dem Thresholding Werkzeug, rekonstruieren die Struktur von Interesse.
- Füllen Sie die Rekonstruktion, indem Sie auf den grünen Pfeil unten klicken.
- Stellen Sie das Objekt weiter von dem Stift-Werkzeug Oberflächen zu schneiden und zu entfernen, wie erforderlich. Es ist nur möglich, in Nord-Süd-Richtung zu schneiden, also kippen das Bild, um das gewünschte Objekt zu schneiden.
- Erhalten Messungen von Volumen, Fläche und Intensitäten für jede Fläche durch die Auswahl Statistiken, detaillierten Statistiken und Durchschnittswerte.
- (Optional Schritt) farbcodierte Statistiken zu beobachten (vgl. Abbildung 2E F), wählen Sie die Registerkarte Farbe der entsprechenden Oberfläche und markieren Sie "Statistik Coded" anstelle von "Base". Mehrere Optionen werden angezeigt.
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Representative Results
In den folgenden Abschnitten wird eine funktionale Zuschlags eines POI exemplarische Ergebnisse (Simiate, für weitere Details siehe bitte 16, 17) darstellt , unter Verwendung von Chariot Reagenz und Antikörper Interferenz präsentiert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass verminderte Expression von Simiate Transkriptionsaktivität beeinträchtigt, und in einer dosisabhängige Weise, induziert Apoptose, die ihren Höhepunkt in Mortalitätsraten von über 99%, wenn höhere Antikörper-Mengen (> 1 & mgr; g Antikörper) angewendet werden (diese Entdeckungen wurden bisher veröffentlicht in 16). Hier präsentieren wir nun die Techniken und Protokolle im Detail beschäftigt und darüber hinaus zeigen, wie Chariot Reagenz verwendet werden kann, um dissoziierte Neuronen im Hippocampus in Primärkulturen transfizieren.
Um zu untersuchen, ob Chariot Peptide für einen effizienten Shuttling von Antikörpern und insbesondere zu ermöglichen, wenn diese Antikörper während des Verfahrens funktionsfähig bleiben, ausgedrückt wir FLAG-Simiate Für 24 Stunden in HEK293 - Zellen und transfizierte anschließend die Verwendung von Zellen Chariot gekoppelt rbαSimiate-gtαrbAlexa568 Makromoleküle (Abbildung 1). Das FLAG-Simiate Konstrukt wird gut von HEK293 - Zellen exprimiert und lokalisiert auf die somata sowie die Kerne dieser Zellen (1A). Hier FLAG-Simiate Cluster signifikant (1B), wobei die Spiegelungs gesprenkelt Verteilung endogener Simiate in den Kern.
Die Antikörper - Komplexe auf der Zellmembran pendelte erscheinen in Einheiten (1A, in rot, rote Pfeile), aber die freigesetzten Antikörper erkennen spezifisch FLAG-Simiate wie durch eine tiefe Kolokalisation von FLAG-Simiate und rbαSimiate-gtαrbAlexa568 Macromolekules (1B gezeigt , in gelb, gelber Pfeil). Ab Note zeigt das Experiment nicht nur, dass die Antikörper während eines Chariot-vermittelte funktionsfähig bleibenMembrandurchgang, sondern dass sie auch in der Lage den Kern zu gelangen. Da ihre Größe Antikörper aus verfolgen, den Kern durch Diffusion ausschließt, ist es wahrscheinlich, dass die Kern in Chariot vorhanden Lokalisationssignal selbst die Translokation von rbαSimiate-gtαrbAlexa568 Makromoleküle in den Kern erleichtert. Tatsächlich sind Antikörper Assemblagen auch an oder in beobachtete jeweils die Kernkammer (1B, rote Pfeile).
Mit rbαSimiate-Chariot Komplexe funktionell endogene Simiate in HEK293 - Zellen (Abbildung 2) führen, fanden wir , dass wir in der Lage waren Ziel von bis zu 80% der rbαSimiate Bindungsstellen, unter Verwendung von 2,0 ug Antikörper 16. Interessant ist , während Antikörper allein in HEK 293 - Zellen gtαrbAlexa568 pendelt über das Auftreten von Kern Speckles (2A-C) keine offensichtliche Wirkung hatte, Verlust der funktionellen Simiate Radius Kern Speckles (2D-F </ strong>, vgl. 16) , wie durch dreidimensionale Rekonstruktionen (Abbildung 2B, C vs. E, F) und, in einer dosisabhängigen Weise induziert Apoptose (Abbildung 3, vgl. 16) veranschaulicht.
Da die neuronalen Zellen zu toxischen Effekten sehr empfindlich sind, verwendeten wir auch die Technik , die in primären hippocampalen Kulturen (Figur 4). Mit TUNEL-Assay und MAP2 Färbung Zellintegrität zu analysieren, fanden wir keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Neuronen bei einem Vergleich mock oder unbehandeltem und Chariot behandelten Zellen (ca. 20-25% TUNEL-positiven Zellen nach 1 + 4 Stunden nach der Behandlung, vgl. 4.4 -4,6). Daher testeten wir Chariot vermittelte Antikörper in neuronalen Kulturen pendelt. Nach dem gleichen Anwendungsschema wurden gtαgpAlexa568 Antikörper Assemblagen gesehen unterschiedlich in etwa 83% der Zellen erstreckt, wo sie in somata aufgetreten sowie Kerne (5A). Diese Beobachtungen werden weiter unterstützt bya dreidimensionale Analyse (5B) und genau das Bild in HEK293 - Zellen gesehen wieder zusammenbauen, zusammen so darstellt , dass die Chariot Technik erfolgreich als auch primäre Neuronen im Hippocampus transfizieren distanzierte verwendet werden kann.
Abbildung 1. FLAG-Simiate wird durch Simiate spezifische Antikörper pendelte in HEK293 - Zellen unter Verwendung von Chariot Reagenz nachgewiesen. Für Antikörper Interferenzexperimente, rbSimiate-gtrbAlexa568 Antikörper wurden vormontiert vor Chariot-Antikörper - Komplexbildung. A) HEK293 Zellen FLAG-markierten Simiate Ausdruck zu bringen. Simiate Antikörper Assemblagen geben Sie die soma sowie den Kern nach der Anwendung, wo sie speziell mit FLAG-Simiate colokalisieren. Runde Punkte: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 Assemblagen (rote Pfeile). B) Eine hohe Leistung Vergrößerung des boxed Regionin (A), um die Co-Lokalisation von FLAG-Simiate und Chariot vermittelte Simiate Signal (gelbe Pfeile) veranschaulicht. Bitte beachten Sie die Anwesenheit eines Chariot Antikörper Assemblage im Kern (roter Pfeil). Maßstabsbalken: 10 & mgr; m.
Abbildung 2. Simiate-spezifische Antikörper in HEK293 - Zellen pendelte stören zelluläre Funktionen von endogenem Simiate. A, B) HEK293 behandelten Zellen mit Chariot-gtrbAlexa568 (1 ug) dienen als Kontrolle. In rot ist die endogene Simiate in Falschfarben dargestellt, während Chariot-gtrbAlexa568 Assemblagen nicht angezeigt werden. Nuclear Speckles wurden mit dem Markerprotein SC35 (grün) markiert, während apoptotischen Zellen durch TUNEL-Assay (in blau) identifiziert wurden. B) Die Rekonstruktion der Nuclear Speckles aus der boxed Region in A. C) Rekonstruktion der Region darstellt Speckle Volumina und Oberflächenin einer farbcodierten Weise. D, E) HEK293-Zellen nach Chariot-rbSimiate Behandlung (0,5 ug). Endogene Simiate sowie Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 Assemblagen sind rot dargestellt, während Nuclear Speckles und apoptotischen Zellen angezeigt werden nach A und B. E) Nuclear aus der boxed Region rekonstruiert Sprenkel in D. F) Die Region wird gezeigt, wie Bitte beachten Sie die abgerundete Erscheinungsbild und Aggregation von Speckles für C. skizziert (alle Rekonstruktionen: Imaris Software). Maßstabsbalken in C, F: 2 um. Alle anderen Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. 1) Für die dreidimensionale Rekonstruktion, nur nicht-apoptotischen Zellen wurden verwendet.
Abbildung 3. Hohe Dosen von Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 massiven Zelltod induzieren. HEK293 - Zellen mit 2 ug Chariot-gtrbAlexa568 oder Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 behandelt wurden, bzw. (beide comp Lexes in grün dargestellt und die durch Pfeile sowie Vergrößerungen). TUNEL Kennzeichnung (in blau) wurde apoptotischen Zellen zu identifizieren, angewendet. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m.
Abbildung 4. Chariot ist nicht toxisch primären hippocampalen Neuronen. AB) DIV 7 Neuronen wurden entweder mock behandelt (Medium, A) oder zogen Chariot Reagens (B) , wie in dem Protokoll für Antikörper umrissenen pendelt (1 + 4 Stunden cp. 4,4-4,6). Während SC-35, ein Markerprotein für Nuclear Speckles, diente dazu, die Transkription und Spleißmaschinerie zu beschriften, wurde TUNEL-Färbung apoptotischen Zellen (grüne Pfeile) zu identifizieren, angewendet. C) Unbehandelte und Chariot behandelt DIV 16/17 Neuronen. MAP2-Färbung wurde die dendritischen Bäume zu visualisieren angewendet. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m.
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Abbildung 5. Chariot vermittelte Transfektion ist kompatibel mit neuronalen Kulturen. A) Ein Vertreter primären Hippocampus von div 5. Das Bild zeigt z-Projektionen von Stapeln mit Hilfe eines Laser - Scanning - Mikroskop (Laser Scanning Mikroskop 710, Zeiss). Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Bitte beachten Sie das Auftreten von Chariot-gtgpAlexa568 Komplexe (rot) in den Zellkern und die soma der Zelle. B) Dreidimensionale Rekonstruktion (Imaris Software) des Kerns sowie gtgpAlexa568 Assemblagen in A. Soma und Dendriten der Neuronen gezeigt werden durch graue Punkte angedeutet, die von der Kennzeichnung von endogenem Simiate destilliert werden. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Antikörper Menge transfiziert: 0,25 ug.
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Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll die Bedeutung von Protein-Expressionsniveaus in Kontrolle zellulärer Funktionen in einer Dosis angetrieben Weise zu studieren. Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine Feinabstimmung Manipulation der Proteinexpression in verschiedenen Säugetierzelltypen, einschließlich Hippocampusneuronen, damit detaillierte Studien der Proteinfunktion auf zellulärer Ebene zu erleichtern.
Obwohl die RNA - Interferenz eine bekannte Strategie POIs repräsentiert herunterregulieren, es hat seine Nachteile (vgl. 14). Nicht nur die Identifikation eines hochspezifische und effiziente Folge kann teuer und zeitaufwendig sein, sondern auch transcript Biogenese innerhalb der Zelle unvorhersehbare Ergebnisse, da die Anhäufung von toxischen RNA Konstrukten führen kann, eine Überlastung des Kernexportmaschinerie sowie eine Sättigungs der endogenen RNAi Verarbeitungssysteme in off-Target-Effekte oder Ineffizienz führen kann. Auch hohe Mengen an exogenen RNAi-Vektoren können induzieren unspecific Effekte als gut, und Zell-Homöostase stören.
Antikörper, andererseits erfordern keine weitere Verarbeitung durch endogene Maschinerien, sobald sie in die Zelle eingetreten sind, und sind ab sofort wirksam, wodurch nicht nur zeitsparende Experimente unterstützen, sondern auch Untersuchungen der unmittelbaren zellulären Prozessen. Obwohl sie unspezifische Nebeneffekte haben können auch die steigende Anzahl von gut charakterisierten und hochspezifische Antikörper zur Verfügung stellt, diese Alternative eine Überlegung wert. Da die Abgabe von makromolekularen Komplexen in Zellen ein großes Hindernis darstellt, wurden verschiedene Transfektionstechniken wurden in den letzten Jahren entwickelt, einschließlich der Peptide , R8 und azoR8 18 sowie Mikrokügelchen 19 vermittelte shuttling. Während R8 und azoR8 ähnlich 18 bis Chariot verhalten angegeben wurden, wurden Mikrokügelchen gefunden 24 Stunden für die Aufnahme 19, zu verlangen , die als Chariot-vermittelte mem wesentlich längerbran Passagen und kann zu Schwierigkeiten führen, wenn schneller und dosisabhängige zelluläre Reaktionen zu studieren.
Bemerkenswert ist, wandte sich der Chariot Technik für primäre Hippokampus-Kulturen erwiesen, die Behandlungen und schwer sind sehr empfindlich zu transfizieren. Bisher haben Chariot Träger verwendet worden Proteinfunktion in primären Osteoblastenkulturen 20 sowie in der Neuroblastom-Gliom - Zelllinie NG108-15 21, chick dorsal root ganglia Kulturen 21 oder in PC12 - Zellen 22, zu analysieren , die von dem neuronalen stammen kamm, aber keine Berichte über jede Anwendung in Zellkulturen aus dem zentralen Nervensystem abgeleitet sind, vorhanden. Da herkömmliche Transfektionsreagenzien wie Lipofectamin verwickelten in diesen Zellen und virale Transfektionen ineffizient sind, Chariot könnte eine interessante Alternative darstellen.
Bemerkenswert ist , Chariot selbst wurde zum Kern 15 zu lokalisieren beobachtet, wahrscheinlichaufgrund seiner Kernlokalisationssignal PKKKRKV (vgl. 23). Im Einklang mit diesen Beobachtungen fanden wir, dass Chariot vermittelte Transfektion von rbαSimiate-gtαrbAlexa568 Makromolekülen in einer klaren Kennzeichnung von Kernfächern wie Nuclear Speckles geführt. Tatsächlich Kontrollantikörper wie gtαgpAlexa568 wurden auch in den Zellkern von beiden, HEK293 und primäre hippocampale Zellen nachgewiesen. Da Antikörper, insbesondere in Assemblagen, sind viel zu groß, den Kern durch Diffusion zu beginnen, und da Simiate selbst keine bekannten Kernlokalisationssignal enthält, sondern tritt der Kern durch Diffusion, ist es wahrscheinlich, dass das Chariot Signal in der beteiligt ist Kernlokalisation von Antikörpern. Alternativ könnte ein Transport in größeren Proteins Assemblagen auch möglich sein, obwohl dies nicht das Vorhandensein von gtαgpAlexa568 im Kern der kultivierten hippocampalen Neuronen von Ratten erklären würde, da kein Ziel für diesen Antikörper in diesen Zellen ist. Ferner since Chariot gefunden wurde nicht mit der natürlichen Lokalisierung von pendelte Peptide und Proteine , 15, diese Beobachtungen stören lassen vermuten , dass Antikörper anders verhalten.
Tatsächlich, als Antikörper - Komplexe wie Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (Abbildung 1) oder Wagen gtαgpAlexa568 (Abbildung 5) durch Zellmembranen pendelt, erscheinen sie in Cluster, die nur auflösen, wenn geeignete Zielproteine wie endogene Simiate oder FLAG-Simiate vorhanden sind (nur in Abbildung 1). Mit Chariot Antikörper - Komplexe in Osteoblasten, Selim und Hochschulen beobachtet die gleiche Wirkung 20. Da Chariot nachgewiesen wurde nicht mit der Lokalisierung von Peptiden und Proteinen 15, diese Beobachtungen zu interferieren anzuzeigen , dass Chariot montiert Antikörper zerlegen nur , wenn es einen molekularen Mechanismus, wie ein Antikörper-Target - Wechselwirkung ist, die die hydrophobe InterwindetAktionen zwischen Chariot und seinen Antikörper Ladung und somit ermutigt Demontage. Weil Antikörper sind schwerer als Peptide oder die meisten anderen Proteine und haben aufgrund ihrer Form, eine große Oberfläche, so können sie mit einer höheren Anzahl von Chariot Molekülen assoziieren und / oder fester mit Chariot Peptide interagieren, was somit zu fördern wäre ein Chariot getriebenen Verhalten von Antikörpern. Ein Mangel an einer Demontage - Mechanismus würde daher in einer gruppierten Aussehen und eine Kernlokalisierungs des Antikörpers Ladung (Abbildung 5).
Zusammengenommen zeigen die Daten, dass Chariot ist besonders gut geeignet, um die Funktion von Proteinen in den Zellkern Wohnsitz zu adressieren, und daß sie anwendbar ist in einer Vielzahl von Säugetierzelltypen, einschließlich primären hippocampalen Neuronen.
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Acknowledgments
Die vorliegende Arbeit wurde in Teilen unterstützt durch von den Canadian Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation of Canada Partnerschaftsprogramm zu RD Finanzierung der Jerome Lejeune Stiftung RD, dem Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der Universität Erlangen-Nürnberg auf RD und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft zu RD und RE. Die Autoren möchten Ingrid Zenger für die technische Unterstützung bei der Zellkultur Wartung sowie Prof. M. Wegner zur Herstellung eines pCMV5-FLAG-Vektor zur Verfügung zu danken. Die Autoren wollen weiter besonders Nadja Schroeder für die hilfreiche Unterstützung bei der Videoaufnahmen danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20 °C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37 °C before using |
| 1x B27 | Life technologies | 17504044 | store at -20 °C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20 °C |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | store at -20 °C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
References
- Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
- Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
- Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
- Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
- Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
- Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
- Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
- Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
- Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
- Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
- DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
- Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
- Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
- Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
- Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
- Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
- Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
- Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
- Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
- Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).
