Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций

Published: April 21, 2016 doi: 10.3791/53049
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1
1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg

Abstract

Строгое управление экспрессии белка не только важное значение для любого организма в живых, но и является важной стратегией для исследования функции белка в клеточных моделях. Таким образом, недавние исследования изобрели различные инструменты для целевой экспрессии белка в линии клеток млекопитающих или даже животных моделей, в том числе и РНК интерференции антител. В то время как первая стратегия собралось много внимания в течение последних двух десятилетий, пептиды, опосредующие транслокации антител через грузов клеточных мембран и в клетки, полученные гораздо меньший интерес. В этой публикации, мы предоставляем подробный протокол, как использовать пептидный носитель под названием Chariot в эмбриональных клетках почек человека, а также в первичных нейронов гиппокампа проводить эксперименты интерференции антитела и дополнительно иллюстрируют применение трехмерных реконструкций при анализе функции белка. Наши результаты показывают, что колесница, вероятно, из-за его сигнала ядерной локализации, particulaRly хорошо подходит для белков-мишеней, проживающих в сомы и ядра. Примечательно, что при применении колесницы первичных гиппокампа культур, реагент оказалось на удивление хорошо принят диссоциированных нейронов.

Introduction

Жесткий контроль экспрессии белка имеет важное значение для каждого живого организма командовать свое развитие, а также реагировать на внешние сигналы. Следовательно, множество механизмов, было изобретено в процессе эволюции, чтобы точно регулировать уровень экспрессии каждого белка, кодируемого приложением. существующие в любой эукариотической клетке в любой момент времени ее жизни 20000 генов. Происходящие на разных этапах производства белка, регулирующие механизмы варьируются от управления структуры хроматина, транскрипции и РНК обработки в направлении посттрансляционных модификаций белка, транспорта и деградации.

Поэтому не удивительно, что сбои в основной молекулярные механизмы и уровни экспрессии белка измененное были связаны с различными заболеваниями, такими как рак или с ограниченными умственными. Действительно, глядя на выдающуюся сложность развития нейронов и функции мозга у млекопитающих, в Sensiствительность этих сложных систем к изменениям в экспрессии белка проявляется в нескольких известных интеллектуальных дефицитов, включая болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (AD и PD), а также расстройствами аутистического спектра (ASD), как хрупкая синдром Х (FXS). Последнее заболевание характеризуется обширным неправильная экспрессия множества белков, которое происходит из - за потери одного перевода регуляции белка, FMRP (Хрупкие Х умственная отсталость белковом) 1-4. Кроме того, хромосомные перестройки , влияющие на Variable заряд х связанный белок А (VCXA), белок, который управляет стабильность мРНК и трансляцию путем модификации мРНК укупорки 5, в последнее время были связаны с интеллектуальным дефицитом, в то время как точечные мутации не были выявлены у пациентов с когнитивными расстройствами как сейчас 6, 7, предполагая , что наблюдаемые психические нарушения происходят из измененной экспрессии VCXA и дизрегуляции выражение своей целевой защдюймы В соответствии с этими выводами, исследования следственным Novo копии вариации числа генов , которые связаны с ASD установлено ли де что новые дупликации генов и делеции являются существенным фактором риска для ASD 8, тем самым поддерживая идею , что повышенные или уменьшенные уровни экспрессии белка может привести к интеллектуальные дефициты.

Примечательно, что недавние исследования также при условии доказательства того, что уровень экспрессии данного белка четко настроена , чтобы предотвратить его агрегации , как следствие больших количеств белка с почти полным отсутствием запаса безопасности 9. Поэтому было предложено , чтобы даже небольшие приросты достаточно , чтобы вызвать такие заболевания, как AD и PD 9. Хотя разнообразие молекулярных механизмов , способствующих регуляции экспрессии белка предполагает сложную схему регулирования в свете этих выводов, исследование исследования уровня экспрессии более чем 5000 генов млекопитающих 10 показано , чтоприрода предпочитает более экономной схеме: было показано Клеточный обилие белков , предназначенных преимущественно регулируется на уровне трансляции 10, тем самым иллюстрируя , что руководство наличия РНК в основном служит для тонкой настройки экспрессии белка.

Изучение дозы интерес белков (ИКП), следовательно, не только важно для понимания эндогенных функций белка, но также и к исследованию многих заболеваний и разработки методов лечения. Таким образом, в последние десятилетия наблюдается продвижение нескольких стратегий с использованием РНК-интерференции для манипулирования дозы POI. Хотя РНК - интерференции широко используется для изучения функции белка и даже применяется в клинических испытаниях для лечения рака или глазные заболевания, а также проводить противовирусные терапии у пациентов 11-13, некоторые трудности могут возникнуть , которые могли бы сделать стратегию невозможно. Например, последовательность семян, которая приводит в действие нокдаун по гомологии является сравнительдаемых Короче говоря, тем самым содействуя вне целевых эффектов. Так как очень эффективные последовательности являются редкими и должны быть найдены среди тысяч вариантов (обзор в 14), определение правильной последовательности может быть длительным и дорогостоящим, но результаты все еще ​​может быть разочарование.

Альтернативной стратегией является непосредственно целевой POI антителами. Здесь мы проиллюстрируем использование белковый носитель Chariot (производства активной Motif), чтобы уменьшить клеточное наличие белка, а также применение трехмерных реконструкций для изучения функции белка следующие нокдауна.

Активный мотив Chariot, непосредственно 2,8 кДа пептид, используют пептиды , челнок, белков и антител через мембраны клеток млекопитающих 15. Пептидные ассоциируется с POIs путем формирования нековалентно связаны высокомолекулярные комплексы, использующие гидрофобные взаимодействия, после чего Chariot-ТОИ комплексов усваиваются в клетки в эндосомы-INDependent образом. Важно отметить, что Chariot было указано ни то, чтобы влиять на внутриклеточную локализацию белков челноке, и не оказывать цитотоксическое действие или повлиять на биологическую активность его груза 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Исходные растворы

  1. Ресуспендируют лиофилизированный порошок активного мотив в стерильной H 2 O до конечной концентрации 2 мкг / мкл. Нажмите тщательно для смешивания.
  2. Подготовка небольших аликвот (например, 12 мкл каждого, 2 мкл необходимого для каждой реакции) и хранить их при температуре -20 ° С.

2. Получение клеток

  1. Семенной клетки млекопитающих, такие как клетки НЕК293, или первичных нейронов на 24-луночный планшет в 500 мкл среды на рост в том числе антибиотиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нейронов, семян клеток при низкой плотности и использовать только два средних ряда на 24-луночного планшета. Каждая скважина будет таким образом иметь пустой аналог укрывать среды во время инкубации (стадия 4.2). При работе нейронов, всегда убедитесь, что клетки не удерживаются вне инкубатора для более чем на несколько минут.
  2. Культуры клеток в соответствующих условиях (увлажняется, 5% CO 2 и 37 ° С) до тех пор , пока клетки не являются приложения. 50%вырожденная.
    Примечание: При использовании нейронов, культивирования клеток до желаемой стадии развития достигается и изменить приложение. 25-50% среды два раза в неделю. Среда: Neurobasal среда (содержащий 1x B27, 5 мМ L-глютамин и 1x пенициллина и стрептомицина, сравните с реф 16).

3. Chariot Комплексообразование

  1. На реакцию, разбавить 0,1-2 мкг POI или соответствующим антителом, а также в качестве контрольного белка, или контрольного антитела, соответственно, в 50 мкл PBS.
    Примечание: Этот метод также работает с макромолекулярных комплексов , состоящих из предварительно связаны первичными и вторичными антителами (Cp 'Представитель Результаты', Рисунок 1.). Смешать и отжим.
  2. Для каждого образца, разбавить 2 мкл Chariot исходного раствора в 50 мкл PBS с использованием отдельных труб, чтобы избежать самоассоциация Chariot. Смешать и отжим.
  3. Перенесите разбавленный POI или антитела (шаг 3.1) к размыванию Chariot по пипеткойтин. Смешать и отжим.
  4. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре (Chariot-POI комплексов сформирует).

4. Трансфекция клеток

  1. Развести меркава комплексы (этап 3.4) в 100 мкл предварительно нагретом ростовую среду (37 ° C, без добавок). Удалите среду и промыть клетки один раз с использованием предварительно подогретый 1x PBS.
    Примечание: При использовании нейронов, не отбрасывать среду, то он будет использован повторно. Хранить при 37 ° С. Для промывания используют PBS , содержащем 0,5 мМ MgCl 2 и CaCl 2.
    Предложение: сохранить среду в пустых лунок во время инкубации пластины (шаг 4.5).
  2. Применить комплексное решение Chariot (шаг 4.1) к клеткам и рок-клетки осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение раствора. Растут клетки в стандартных условиях (шаг 2,2) в течение 1 ч. Добавить сыворотки до конечной концентрации 10%. При использовании нейронов, добавить среду, начиная с шага 4.1. Растут клетки в течение от 1 до 2 часов более.
    Обратите вниманиеОптимальное время инкубации зависит от размера и свойств груза и, возможно, потребуется скорректировать опытным путем. Следующие предложения могут служить в качестве руководства: Для получения пептидов, 1 час, обычно достаточно, белки 1-2 ч рекомендуется, на наличие антител 2 ч, а для трансфекции нейронов с антителами 4 ч.
  3. Технологические ячейки для анализа, как обычно. Обратите внимание: метод совместим с экспериментами с использованием протоколов фиксации, а также живого изображения.

5. обработки изображений

  1. С помощью лазерного сканирующего микроскопа, возьмите Z-стеки клеток и / или клеточных отсеков, представляющих интерес использованием около 0,25-0,5 мкм расстояние. Расстояние точный слой зависит от размера структуры реконструируемых и должна быть определена индивидуально.

6. Реконструкция

  1. В следующих шагах, используйте нижнюю Esc для переключения между кнопками перемещения, Cntr выбрать несколько объектов, нажав Oп их и смена ключа для вырезания объектов (ср. шаг 6.10).
  2. Откройте LSM-файл в Imaris.
  3. Использование дисплея Настройка для каждого канала, контрастность изображения до тех пор яркие структуры не достигают насыщения. Обратите внимание, что эта корректировка не будет влиять на конструкцию поверхности, она служит только для оказания помощи экспериментатора в пороговой изображения.
  4. Нажмите на иконку Добавить новые поверхности. Мастер откроется.
  5. Выберите: Сегмент только интересующей области. Перейдите к следующему шагу.
  6. Отрегулируйте допустимые пределы поля выбора, чтобы соответствовать ваш объект интереса. Пожалуйста, имейте в виду, что изображение имеет 3-х измерениях, и что выбор должен быть отрегулирован на плоскости г, а также. Если прямоугольная форма коробки отбора не должен совпадать с объектом интереса должным образом, повернуть объект и / или увеличить окно, пока все необходимые структуры, не встроены. Нежелательные объекты могут быть удалены позже (ср. Шаг 6.10). Продолжить.
  7. Выберите подходящий чAnnel. Уровень детализации Площадь поверхности или диаметр сферы должны быть установлены в соответствии структуры реконструируется. В зависимости от характеристик сигнала, может быть использован как абсолютная интенсивность или Локальный контраст. Как правило, Локальный контраст работает лучше для диффузных сигналов. В любом случае, параметры должны быть отрегулированы отдельно для каждого сигнала или интересующей структуры, соответственно.
  8. С помощью инструмента выбора порога реконструировать интересующую структуру.
  9. Завершить реконструкцию, нажав на зеленой стрелкой внизу на.
  10. Отрегулируйте объект дальше, используя инструмент карандаш, чтобы вырезать и удалить поверхности по мере необходимости. Это возможно только сократить в направлении север-юг, поэтому, наклонить изображение для того, чтобы вырезать нужный объект.
  11. Получите измерения объема, площади и интенсивности для каждой поверхности, выбрав статистики, детальной статистике, и средние значения.
  12. (Необязательный шаг) Для наблюдения цветные статистики (ср. Рис 2E F), выберите вкладку цвета соответствующей поверхности и отметьте 'закодированы статистики' вместо 'Base'. будет отображаться несколько вариантов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В следующих параграфах, в качестве примера результаты , иллюстрирующие функциональную нокдаун в POI (Simiate, для получения более подробной информации см 16, 17) с помощью Chariot реагента и интерференция антитела представлены. Полученные результаты показывают, что уменьшенная экспрессия Simiate снижает транскрипционную активность, и, в дозированной зависимым образом, индуцирует апоптоз, что привело показатели смертности более чем на 99%, если применяются более высокие количества антител (> 1 мкг антитела) (эти открытия были опубликованы ранее в 16). Здесь мы изложим методы и протоколы, используемые в деталях и, кроме того, показано, как Колесница реагент может быть использован для трансфекции диссоциированных нейронов гиппокампа в первичных культурах.

Для того чтобы исследовать ли разрешить Chariot пептиды для эффективного челночного антител и, в частности, если эти антитела остаются функциональными во время процедуры, мы выразили FLAG-Simiate В течение 24 часов в НЕК293 клетках, а затем трансфицируют клетки , использующие Chariot в сочетании rbαSimiate-gtαrbAlexa568 макромолекулами (рисунок 1). Флагу-Simiate конструкция хорошо выражена НЕК293 и локализуется в somata, а также ядрах этих клеток (Фигура 1А). Здесь FLAG-Simiate кластеры значительно (рис 1б), таким образом , зеркальное отображение Пестрая распределение эндогенных Simiate в ядре.

Комплексы антител курсировал через клеточную мембрану появляются в сборках (рис 1А, в красном, красные стрелки), но освобожденные антитела обнаружить FLAG-Simiate конкретно , как показано глубоким колокализации FLAG-Simiate и макромолекул rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (рис 1B , в желтой, желтой стрелкой). Как отметить, эксперимент не только показывает, что антитела остаются функциональными в течение колеснице-опосредованнойчерез мембрану, но они также способны проникать в ядро. Так как их размер исключает антитела от перехода ядро ​​путем диффузии, вполне вероятно, что локализация сигнала ядерный присутствует в самой Chariot облегчает транслокацию rbαSimiate-gtαrbAlexa568 макромолекул в ядро. Действительно, комплексы антител наблюдаются при или в, соответственно, ядерный отсек (рис 1B, красные стрелки).

Использование rbαSimiate-Chariot комплексы функционально истощению эндогенного Simiate в клетках HEK293 (рисунок 2), мы обнаружили , что мы были в состоянии предназначаться до 80% rbαSimiate сайтов связывания, с использованием 2,0 мкг антител 16. Интересно, что в то время как челночные gtαrbAlexa568 антитела в одиночку в клетках НЕК 293 не имели никакого очевидного влияния на появление ядерных крапинками (рис 2A-C), потеря функционального Simiate скруглены ядерных крапинки (рис 2D-F </ сильный>, ф. 16) , как показано на трехмерных реконструкций (рис 2B, C по сравнению с E, F) и, в зависимости от дозы, индуцированного апоптоза (рис 3, ср. 16).

Учитывая , что нервные клетки очень чувствительны к токсическому воздействию, мы также применили технику в первичных гиппокампа культур (рисунок 4). Используя TUNEL анализа и map2 окрашивания для анализа целостности клеток, мы не нашли никакого влияния на жизнеспособность нейронов при сравнении имитировали или необработанных и обработанных клеток Chariot (приложение. 20-25% TUNEL-положительных клеток после того, как 1 + 4 часа лечения, ср. 4.4 -4,6). Таким образом, мы тестировали Chariot опосредованного антитела челночного в нейрональных культурах. По той же схеме приложения, комплексы антител gtαgpAlexa568 были замечены в той или иной простирается примерно 83% клеток, где они произошли в somata, а также ядер (рис 5А). Эти наблюдения дополнительно поддерживаются бя трехмерный анализ (рис 5B) и внимательно собрать картину видел в клетках НЕК293 вместе , таким образом , иллюстрирующий , что техника Chariot может быть успешно использован для трансфекции диссоциированных первичные нейроны гиппокампа , а также.

Рисунок 1
Рисунок 1. FLAG-Simiate обнаруживается Simiate специфических антител курсировали в клетки HEK293 с использованием реагента Chariot. Для экспериментов интерференции антител, rbSimiate-gtrbAlexa568 антитела были предварительно смонтированные до Chariot-антитела образования комплекса. А) HEK293 клетки, экспрессирующие FLAG-меченый Simiate. Simiate комплексы антител входят сому, а также ядро ​​следующие приложения, где они локализуются именно с FLAG-Simiate. Круглые точки: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 сборки (красные стрелки). Б) высокой мощности увеличения в штучной упаковке регионав (А), иллюстрирующего колокализации FLAG-Simiate и Chariot опосредованной Simiate сигнала (желтые стрелки). Пожалуйста, обратите внимание на наличие антител сборки Chariot в ядре (красная стрелка). Шкала бар: 10 мкм.

фигура 2
Рисунок 2. Simiate-специфические антитела челноке в клетки HEK293 мешают клеточных функций эндогенного Simiate. A, B) HEK293 клетки , обработанные Chariot-gtrbAlexa568 (1 мкг) служат в качестве контроля. В красном, эндогенная Simiate показан в ложном цвете, в то время как Колесница-gtrbAlexa568 сборки не отображаются. Ядерные спеклы метили с помощью маркера белка SC35 (зеленый цвет), тогда как в апоптозе клетки были идентифицированы с помощью TUNEL анализа (синим цветом). Б) Реконструкция ядерных крапинками из коробочного региона в А. С) Реконструкция и того же региона, иллюстрирующих объемов спекл и площади поверхностив цветовой кодировкой манере. D, Е) HEK293 клетки после обработки Chariot-rbSimiate (0,5 мкг). Эндогенный Simiate, а также Колесница-rbSimiate-gtrbAlexa568 сборки показаны красным цветом, в то время как ядерные крапинки и апоптотических клеток отображаются в соответствии с А и В. Е) Ядерные крапинки реконструированные из коробочного области в D. F) Та же область показана как Намечены C. Обратите внимание радиусной внешний вид и агрегацию крапинками (все реконструкций: Imaris программное обеспечение). Шкала бар в C, F: 2 мкм. Все остальные масштабные линейки: 10 мкм. 1) Для получения трехмерной реконструкции, использовались только не апоптотических клеток.

Рисунок 3
Рисунок 3. Высокие дозы Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 вызвать массовую гибель клеток. НЕК293 клетки обрабатывали 2 мкг Chariot-gtrbAlexa568 или Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 соответственно (как комп lexes показаны зеленым цветом и обозначенные стрелками, а также увеличениях). TUNEL маркировка (синим цветом) был применен для идентификации апоптотических клеток. Шкала бар: 10 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4. Chariot не является токсичным для первичных нейронов гиппокампа. AB) ДИВ 7 нейроны были либо издеваться лечение (средний, А) или подвергают Chariot реагент (В) , как указано в протоколе для антитела челночного (1 + 4 часа, ср. 4,4-4,6). В то время как SC-35, белок маркером для ядерных крапинками, служил для обозначения транскрипции и сплайсинга машины, TUNEL окрашивание применяется для идентификации апоптотических клеток (зеленые стрелки). C) Необработанные и Chariot обрабатывали ДИВ 16/17 нейроны. МАР2 окрашивания применялся для визуализации дендритных деревьев. Шкала баров: 10 мкм.

pload / 53049 / 53049fig5highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 5. Chariot опосредованной трансфекции совместим с нейронными культур. А) Представитель первичной гиппокампа нейрон из DIV 5. На рисунке показаны Z-проекции стеков , сделанных с использованием лазерного сканирующего микроскопа (лазерный сканирующий микроскоп 710, Цейсс). Шкала бар: 10 мкм. Обратите внимание на появление Chariot-gtgpAlexa568 комплексов (красный) в ядре и сому клетки. Б) Трехмерная реконструкция (программное обеспечение Imaris) ядра, а также gtgpAlexa568 сборках, показанной на А. сомы и дендритов нейрона обозначены серыми точками, которые дистиллированный из маркировки эндогенного Simiate. Шкала бар: 10 мкм. количество антител, трансфицированные: 0,25 мкг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы приводим протокол для изучения значимости уровней экспрессии белка в контроле клеточных функций в дозе ориентировкой. Протокол, описанный позволяет отлаженная манипуляции экспрессии белков в различных типах клеток млекопитающих, в том числе нейронов гиппокампа, следовательно, облегчая детальные исследования функции белка на клеточном уровне.

Хотя РНК - интерференция представляет собой хорошо известную стратегию вниз регламентировать объектов POI, он имеет свои недостатки (ср. 14). Не только идентификация высокоспецифичным и эффективной последовательности может быть дорогостоящим и требует много времени, но и транскрипт биогенез внутри клетки может привести к непредсказуемым результатам, так как накопление токсичных конструктов РНК, перегрузки экспортного механизма ядерной, а также насыщению эндогенного RNAi системы обработки может привести к вне целевых эффектов или неэффективности. Кроме того, большие количества экзогенных векторов RNAi могут вызывать UNSpecific эффекты, а также, и возмущают гомеостаза клетки.

Антитела, с другой стороны, не требуют дальнейшей обработки эндогенных механизмов, как только они вошли в камеру, и вступают в силу немедленно, поддерживая тем самым не только экономить время экспериментов, но и исследования непосредственных клеточных процессов. Хотя они могут иметь неспецифические вне целевых эффектов, также, все большее число хорошо охарактеризованных и высоко специфических антител доступны делает эту альтернативу стоит мысль. Так как поставка макромолекулярных комплексов в клетки представляет собой серьезное препятствие, различные способы трансфекции были разработаны в последние годы, в том числе пептидов R8 и azoR8 18, а также микросферы 19 , опосредованного челночного. В то время как R8 и azoR8 указывались вести себя так же , как Chariot 18, были обнаружены микросферы требует 24 часов для захвата 19, что значительно больше , чем Chariot-опосредованной MEMбранные проходы и может вызвать трудности при изучении быстрее и дозозависимым клеточные ответы.

Примечательно, что техника Chariot оказалась применима к первичным гиппокампа культур, которые очень чувствительны к лечению и трудно трансфекцию. До сих пор Chariot носители были использованы для анализа функции белка в первичных культурах остеобластов 20, а также в клеточной линии нейробластомы-глиомы NG108-15 21, нут спинальных ганглиях культур 21 или в клетках PC12 22, которые возникают из нервной гребень, но никаких сообщений о любых приложений в клеточных культурах, полученных из центральной нервной системы доступны еще. Поскольку традиционные трансфекции реагенты, такие как Липофектамином неэффективны в этих клетках и вирусных трансфекциях запутанными, Chariot может представлять собой интересную альтернативу.

Следует отметить, что само по себе Chariot наблюдалось для локализации в ядре 15, вероятно ,из - за его PKKKRKV сигнал ядерной локализации (ср. 23). В соответствии с этими наблюдениями, мы обнаружили, что Chariot опосредованная трансфекция rbαSimiate-gtαrbAlexa568 макромолекул приводит к четкой классификации ядерных отсеков, таких как ядерные крапинками. В самом деле, контрольные антитела, такие как gtαgpAlexa568 были также обнаружены в ядре обоих, HEK293 и первичных клеток гиппокампа. Так как антитела, в частности, в сборках, являются слишком большими, чтобы начать ядро ​​путем диффузии и так как сама Simiate не содержит каких-либо известный сигнал ядерной локализации, а скорее попадает в ядро ​​с помощью диффузии, вполне вероятно, что сигнал Chariot участвует в ядерной локализации антител. В качестве альтернативы, транспорт в больших белковых комплексов может быть также возможно, хотя это и не было бы объяснить присутствие gtαgpAlexa568 в ядре культивированных нейронов гиппокампа у крыс, так как нет мишенью для этого антитела в этих клетках. Кроме того, систь Chariot было обнаружено , что не мешает естественной локализации челноке пептидов и белков 15, эти наблюдения указывают на то, что антитела ведут себя по- разному.

Действительно, когда челночного комплексы антител , такие как Колесница-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (рисунок 1) или Chariot-gtαgpAlexa568 (рисунок 5) через клеточные мембраны, они появляются в кластерах, которые лишь растворяются, когда соответствующие целевые белки , такие как эндогенного Simiate или FLAG-Simiate присутствуют (только на рисунке 1). Использование Chariot комплексов антител в остеобласты, Селим и колледжей наблюдается тот же эффект 20. Учитывая , что Chariot было продемонстрировано , чтобы не мешать локализации пептидов и белков 15, эти наблюдения указывают на то, что Chariot собранные антитела разбирать только , если есть молекулярный механизм , такой как антитело-мишени взаимодействия, который преодолевает гидрофобные Интеромдействия между Chariot и его антитела груза и, таким образом, способствует разборки. Поскольку антитела являются более тяжелыми, чем пептиды, или большинство других белков и имеют, из-за их формы, на большой поверхности, они могут ассоциироваться с более высоким числом молекул Chariot и / или взаимодействовать более твердым с Chariot пептидами, которая, таким образом, способствовать более Chariot приводом поведение антител. Поэтому отсутствие разборки механизма приведет к кластерной внешнему виду и ядерной локализации груза антитела (рисунок 5).

Взятые вместе, эти данные показывают, что Chariot особенно хорошо подходит для решения функции белков, находящихся в ядре и что он применим в различных типах клеток млекопитающих, включая первичные нейронов гиппокампа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Представленная работа была поддержана в части за счет финансирования из Канадского института исследований в области здравоохранения / Fragile X Исследовательский фонд Канады программы партнерства к РД, Джерома Лежен Фонд РД, в Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung из университета Эрланген-Нюрнберг RD и от Deutsche Forschungsgemeinschaft до RD и RE. Авторы выражают благодарность Ингрид Зенгера за техническую помощь с поддержанием клеточной культуры, а также профессором М. Вегнер для создания вектора pCMV5-FLAG доступны. Авторы также хотели бы выразить особую благодарность Nadja Шредера за полезную поддержку в видеосъемке.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Tags

Биоинженерия выпуск 110 экспрессия белка интерференция антитела первичные гиппокампа культуры активный мотив трехмерных реконструкций ядерные белки
Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Derlig, K., Gießl, A.,… More

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter