Abstract
微流体装置的一个主要优点是操纵小样品体积，从而减少了浪费试剂和保护珍贵样品的能力。然而，为了实现鲁棒的样品操作，有必要解决设备集成与宏观环境。为了实现可重复的，敏感的颗粒分离与微流体装置，该协议提供了一个完整的自动化和集成的微流控平台，使采用微流体装置0.15-1.5毫升样品精密加工。该系统的重要方面包括模块化设备的布局，并导致可靠和灵活的全球芯片连接强大的固定装置，并完成闭环样品采集，系统清理和涂刷步骤，以确保可重复的操作完全自动化液体处理。不同的微流体装置可以互换使用这种架构。在这里，我们将一个acoustofluidic设备，详细阐述其characteriz通货膨胀，性能优化，并证明其用于大小分离的生物样品。通过在分离实验使用的实时反馈，样品采集进行了优化，节约和浓缩样品。尽管要求的多台设备的集成，这种结构的优点包括处理未知样品，没有额外的系统优化，便于装置的更换，和精确，鲁棒样加工的能力。
Introduction
样品分离和分级分离是应用微流体技术的最有前途的领域之一。这样的样品处理步骤是不可分割的有效的临床诊断，治疗的发展，生物监测工作，并在生命科学研究和技术进步。一个无数的微流体分离策略已经被证明为流体悬浮颗粒和胶体，以及化学和生物物种;一些评论提供的最新研究进展和发展概述在这些领域1 - 9。虽然许多这些微流体分离技术（以下简称为“芯设备”）已经被广泛表征，少数报告已经考虑在系统级样品分离问题。核心设备是典型的个人厘米尺度芯片，接口到含氟聚合物管，流体通过一位移或压力泵递送。然而，如果微流体的承诺 - 包括增加自动化，可靠性和减少样品体积 - 是成为现实，至少相当于必须努力致力于一个完全分离的系统到其中的核心设备是集成设计。
此外，对于微流体方法生物检测的一个主要挑战是在宏观到微观界面。这不仅是指一个微流体装置，宏观组件的物理“世界到芯片”连接，并以典型的临床或分析样品体积（〜0.1-10毫升）和微流控芯片的内部容积之间的失配（〜 0.01-10微升），而且还从桥接这些大小尺度所产生的统计抽样限制。这些问题有助于人们认为样品前处理和制剂是生物检测中的“薄弱环节”。10在这项工作た描述的平台对解决这些挑战KES主要步骤。
服用一个系统级视图，该协议细节精确计量的分析规模的体积（范围从0.15至1.5毫升）于〜10分钟的时间尺度的可靠的处理。这是一个“一键”操作：一旦包含样本和目的地小瓶馏分收集源小瓶放置到系统中，“运行”命令启动的程序，并且所有步骤都是计算机控制的。在一个运行结束时，收集瓶可以从系统的分离级分的下游分析去除。
在这个系统中的核心设备是一个acoustophoresis芯片，其提取哺乳动物细胞大小（5-20微米）的粒子从样品。 Acoustophoretic分离这里选择主要是因为它是高通量（高达μl/ min的100秒），无标记，和非接触，从而提供在分离存活维鲁优点SES从细胞中，很少有其他微流控技术无法比拟的。声粒子的物理学聚焦已被广泛描述，11 - 13，不是本协议的重点，但基本概念的简要概述如下理解应用到微流体分离，以帮助。
超声波的驻波谐振在流体填充微通道产生压力场，这引起力量驱动颗粒朝向低压的节点。的力的大小取决于粒子的体积上，并从相对密度和颗粒的压缩性衍生的声学造影因子和悬浮流体。14同样地，声学聚焦非常适合的细胞大小（〜7-15分离微米）的病毒大小（〜50〜200纳米）的粒子。较大的颗粒迁移向压力节点;然而，由于力量级是非常小的颗粒小于2-3微米，这些小颗粒或溶解的物质几乎不移动。我们的特异性声学分离实施，如前所述，15包括一个薄壁细分流体通道，并允许可调谐，聚焦位置的非对称安置。这增加了灵活性在设备的设计，和性能优势，包括增加的分离质量和速度，都充分别处描述。16,17
然而，在这项工作中所描述的系统级设计方法的一大优点是，它是适用于种类繁多的微流体核心设备。例如，大多数其它连续流分离模式，包括惯性，流场分馏，确定性横向位移（DLD），和各种类型的电动装置的可容易地并入，以适当调整的要算为改变入口/出口结构，流速和样本量。与各种类型的片场（电场，磁场）或梯度（热，化学）设备可能需要到芯片，或额外的硬件集成，该平台可容纳该附加的连接。
这个协议提供了设计的微流体分离装置，并通过深反应离子蚀刻来制造含硅玻璃芯片（DRIE，等离子蚀刻工艺，可以在许多微制造设施，它使用交流蚀刻和钝化的循环以获得深所需的步骤功能与垂直侧壁18）。接着，我们描述了acoustofluidic设备的表征，以确定分离的最佳运行参数，最后细节的完全集成的分离系统和用于处理生物样品的过程。典型的器件特性分析结果和样本处理数据，然后介绍和讨论，这Appro公司的主要优势ACH被突出显示，包括模块化，鲁棒性，精度和自动化。
Protocol
1. Acoustophoretic装置的设计和光掩膜布局
注：一般考虑和微细加工工艺设计和版图设计指导，可以在微细加工光掩膜文本的设计和教程中找到19 - 21。
- 铺陈面膜1时，流体层（前侧），使用适当的CAD软件。选择的几何形状允许样品注射和分离适合于期望的应用。
- 声学聚焦，设定流体通道宽度 w是提供一种共振频率F N 根据公式F N = NC /2瓦特，其中c是声音在有关流体的速度，n是驻波节点 （如数量，对900微米宽的通道大于1 MHz时，双节点共振有望在 f 2 = 1.65兆赫）。
注：粒子Ş占据附近的分离通道的末端独特的横向位置应该退出从不同的网点。在这个协议中，颗粒是通过大小分离，所以出口被指定SPO和LPO，对于小颗粒和大颗粒出口，分别如图1。 - 设置流体通道长度，以控制时间颗粒的长度在一个特定流速暴露于分离场。长片上的停留时间，颗粒由于分离力迁移，必须权衡危害较大的所需芯片的足迹。
注意：在我们的声学聚焦装置，所述流路，使三道次走在芯片为增加停留时间（图2a）。以200微升/分钟，粒子流过300×200微米的横截面，117毫米长的分离通道的典型总流速平均花费2.1秒中的声场。
- 声学聚焦，设定流体通道宽度 w是提供一种共振频率F N 根据公式F N = NC /2瓦特，其中c是声音在有关流体的速度，n是驻波节点 （如数量，对900微米宽的通道大于1 MHz时，双节点共振有望在 f 2 = 1.65兆赫）。
- 包括在掩模LAYO流体端口UT斯达康用于连接到设置在一个标准化电网（5毫米间距）标准管。包括制造和各个设备的切割过程中适合基准标记为掩模，以彼此的对准。
- 铺陈面膜2中，通过层（背面侧），其仅包括流体端口。包括基准标记对准掩盖1。
图1. Acoustofluidic设备。acoustophoretic装置结构示意图草图。 （ 一 ）顶视图，示出了整体的H-过滤器配置（不按比例）。 （b）该通道的横截面在标志是黑色的位置的原理图中虚线（a）中，示出了压力场（蓝色虚线），并且声初级辐射力（PRF）驱动颗粒朝向的感节面（红色箭头）。通道的横截面是900×200微米与壁大约10微米厚的分离主（300微米宽）和旁路通道。 （ 三）粒子分离的3D表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
微流控芯片的Acoustophoresis 2.洁净室制作
- 图案使用面膜2上的双面背面侧流体端口抛光0.5毫米厚，100毫米直径的<100>的硅晶片由标准正型抗蚀剂的光刻。蚀刻这种几何形状通过深反应离子蚀刻（DRIE）到350-400微米的深度。
- 转晶片上，并且使用掩模图案1的前侧流体通道的几何形状由标准正型抗蚀剂的光刻到硅的另一侧。然后，使用光致抗蚀剂贴装器件晶片到第二（空白硅）载体晶片。
- 蚀刻通道，也通过DRIE，到200μm的深度，通过蚀刻在所述端口位置（载体晶片保护DRIE工具表面）硅。通过浸泡在抗蚀剂剥离液的卸载从坯料Si晶片的器件晶片。
- 清洁器件晶片，并使用食人鱼溶液（硫酸和过氧化氢在3：1的比率）的特征的0.5毫米厚的硼硅酸盐玻璃晶片。
- 通过阳极键合使用下列参数的玻璃和硅晶片密封流体通道：在350℃室压力在3mTorr，活塞压力在1000 N，温度，和应用750伏，直到电流降至低于0.2毫安。
- 切独立的芯片除了与切割锯金刚石锯片。
3.最终器件大会
- 压电传感器附件
注：超声是在微流体芯片通过连接到硅侧的压电陶瓷换能器产生的。- 从ATWO组分低粘度环氧试剂盒，称出两种组分的推荐比例并彻底混合。
- 用移液管分配所述环氧树脂混合物和均匀地分布在整个一锆钛酸铅（PZT）的压电陶瓷以创建一个薄的，均匀的层（与37.5×10×0.5毫米尺寸的压电大约10微升环氧树脂混合物的）。
- 使用合适的夹具或固定装置，对齐压电陶瓷的环氧侧与微流体芯片，在一侧上用于随后导线连接（ 见图 2a）设一突出区，并把两个部件接触。夹紧组件在一个副，注意不要产生裂纹的任何组件，并且固化在推荐的环氧制造商的温度和持续时间。
- 之后环氧树脂固化后，附加细规格导线导致压电陶瓷的每一侧，通过用细尖烙铁焊接，使得与压电最短的可能的接触，以避免吨hermally去极化它。或者，使用导电性粘接剂粘合线到压电。
图2.流控面包板，芯片贴装，与世界到芯片接口。照片（一）声学微流控芯片（70×9×1毫米外尺寸）附带压电传感器引线，表现出分离的三关信道下来的芯片，（二）定制流体螺纹接头和机加工管部件为芯片到世界的接口，（三），其安装到使用夹紧装置，所述流体线路板的下侧的芯片，横跨在线路板中的开口，以允许风扇冷却，（d）该线路板与附加的管道连接和冷却风扇的顶视图， 和 （e）的螺纹接头的横截面示意图该接口的TUBI与安装的微流控芯片纳克。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 设备的安装和世界到芯片接口
- 该芯片连接到“流体试验板”（一盘的规则隔开的通孔螺纹一个网格）使用夹紧夹具。附加冷却风扇线路板，调节时声学实验的温度（ 参见图2）。
注：操作不受冷却风扇在典型的驱动电压升高，器件温度至70-80℃。这显著偏移的共振频率由于改变声速在流体，并可能正在处理的任何生物颗粒的可行性产生负面影响。 - 螺杆在芯片到世界的连接器，先前别处描述22和 图 2中所示。加入这些我覆盖整个院落管到附加管道的入口和出口使用标准¼“-28工会为1/16”管材。
- 该芯片连接到“流体试验板”（一盘的规则隔开的通孔螺纹一个网格）使用夹紧夹具。附加冷却风扇线路板，调节时声学实验的温度（ 参见图2）。
声聚焦性能的4表征
注：需要声聚焦表征系统组件组合在一起的材料清单。步骤4.1和4.2以下适用于借助这个平台使用的任何核心设备，而随后的步骤描述具体到本文所讨论的acoustofluidic设备操作。
- 系统配置
- 组装用的流体线路板世界到片外连接的微流体芯片，作为使用管道（如1/16“外径含氟聚合物管），以一个流体泵和收集瓶在第3节进行连接所述。安装在能够搭载了CCD相机荧光成像显微镜阶段的线路板组装。
- 连小内地径的长度R（ID）的管道（0.006“建议）的芯片（见图4），以作为限流器，该稳定系统和控制芯片出口之间的流分离后立即使用。使用较大的ID管，如0.01“或者0.03”，对于所有其他连接。
- 估计每个管件的长度L和使用等式R H内径 D = 128 微升/πD4，其中 μ是流体的动态粘度的流体动力流动电阻 R 小时。压降ΔP由于管道的在给定的流量 Q的每个长度是由ΔP = QRħ给出。
- 选择的限流器的长度的比率为所使用的分离方法，以出口之间的流分割为适当。最佳的分离与本协议中的声学芯片需要一个SPO：approxima的LPO流量比tely 65：35％。
- 选择的出口限流器的长度，使得它们的流体阻力比在系统（串联或并联适当求和）的其余部分的总电阻大至少3-4次。对于在这项工作中所使用的acoustophoresis装置，35管的长度和65厘米为LPO和SPO是合适的。
注意：仔细必须考虑到任何微流控核心设备的R H。对于我们的声聚焦的芯片在这项工作中，R h为低，由于其相对较大的通道尺寸，所以连接管阻力很容易超过它。对于具有较小的通道尺寸的设备，该芯片的电阻可以操纵系统管道的其余部分，在这种情况下，设计和芯片上的信道R H是控制这个协议的步骤1中的额外的考虑因素。详细设计的原则和指引可在文献中。23,24
- 系统验证
- 检查是否漏水，以验证微流体装置具有无缺陷，所有管路连接被密封。根据需要用注射器通过入口管分配水，并监视在主信道的任何流体泄漏。
- 分配通过芯片已知体积，并测量从出口收集的体积，以确保的流量比被预期。从预期体积比的偏差可以指示在插座或漏连接之一堵塞。
- 为了保持系统的清洁和防止堵塞冲洗整个系统（流体管道和芯片）与前和运行的任何实验后适当的清洗溶液（例如，漂白，乙醇，水）。
- 在堵塞或堵塞在出口中的一个时，冲洗系统，同时堵塞了明确的出口，以清除堵塞。如果不成功，冲洗期间反向的流动方向，任选施加反向流动的快速脉冲（使用手动致动注射器）。最后，如果堵塞仍然无法去除，更换管子或芯片，是必要的。
- 频率扫描设置的声聚焦
- 填旁通通道（ 见图 1）与流体例如去离子水，乙醇，或磷酸盐缓冲盐水（PBS）通过手动注射用注射器。请注意，此流体不接触到样品被处理。使用不同的旁路流体调节节点位置的细节别处16,17说明。简言之，如果节点需要更接近分隔壁，使用较低的密度旁路流体，如乙醇;为节点放置更靠近输入样本流，选择更致密流体，诸如甘油溶液。
- 使约0.01％的珠溶液（重量/体积）5-8微米的荧光聚合物珠粒悬浮在缓冲液如PBS中0.05％吐温-20和填充样品入口注射器与珠子溶液。填充缓冲区入口注射器用相同的缓冲液（这并不需要是相同的流体中的旁通流路）。请注意，在一般情况下，缓冲器被选择以适合应用（参见步骤5.1）。
- 用显微镜舞台上的流体线路板，只需用两个通道（分离和旁路）中的视场中的出口之前集中大约一半到通道的深度处的直通道区域。一个附加的倾斜角度的外部光源可能需要使通道壁可见，对于成功的后处理的图像数据。
- 自动频率扫描和图像捕获
- 使用屏蔽电缆（例如，RG-58配备BNC连接器），以与射频（RF）放大器的函数发生器来提供激励信号到压电换能器的电连接。可选，连接示波器为监视实际电压的函数发生器的输出施加到换能器。
- 开启冷却风扇，并设定功能发生器，使得RF放大器的到压电换能器的输出是在12-25的范围内伏峰-峰（V pp的）。
- 设置两个注射器之间50和200μl/ min的相同的流速。使用单一注射泵以相同的电机驱动两个注射器，建议以最小化扰动的流动。
- 通过指定的开始和结束频率，频率值之间的步长大小，和压电驱动电压使用实验室自动化工具如美国国家仪器公司的LabVIEW执行频率扫描过程。
- 在每一频率步进，施加电压15秒，以允许系统达到平衡，然后捕获10图像流经芯片用于随后的分析珠（曝光时间在10和100毫秒之间，建议）。
- Ë之间ACH施加频率步骤，关闭电压为约20秒，让珠子重新分布均匀地在整个信道和从先前施加频率步骤聚焦除去偏倚。
- 图像分析，以确定谐振频率和聚焦位置
- 运行图像分析脚本（比如提供与本议定书的AF_freqScanPlotter.m MATLAB脚本），并在提示输入所需的信息：请选择步骤4.4生成的图像文件的列表，进入扫描起始和终止频率和步长，全信道宽度，壁的位置，最后选择的图像区域来分析，包括分离和旁路通道。
- 观察分析脚本平均设定在每个频率步捕获的图像，并沿流动方向的平均强度值。这导致荧光强度的横截面线扫描。
注：对应于解释第1条的频率圣强度被定义为谐振频率（图3，中间行），并在那里发生的最高强度是聚焦位置 （图3，底行）的信道的位置。
图3代表性频率扫描。实施例的频率扫描数据以及耦合（A）和耦合不良（B）的压电和芯片。上排：珠荧光强度（红色代表高，而蓝色代表低强度）。中间一排：在每个频率最大强度。下排：最大强度，在这里，红色虚线表示预测聚焦位置的位置，和红色菱形表示如由最大强度确定谐振频率。G“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
5.自动分离
注意：所述的自动分离试验运行，从小颗粒大颗粒由于在微流体芯片施加的大小相关的声学聚焦力分开。所需要的系统的组件组合在一起的材料清单。
- 系统配置和样品制备
- 微流体芯片连接到注射泵，计算机控制的多端口选择阀，PC的接口流量计，和油管， 如图4，这种配置使得能够通过微流体分离芯片的自动化的样品处理，以及自动清洗实验的步骤，消除交叉污染和样品结转。
- 使用适合的细胞或颗粒的样品缓冲液被分离，或所要求的分析测定以分离后使用。如步骤4.3.2，回收缓冲液（但不一定是旁路流体）必须样品流体匹配。
注意：任何水性缓冲液通常与生物样品（例如，PBS）中具有类似于水的声学特性，并且不会明显改变声学装置的性能。的使用，用密度和粘度显著不同于水样流体，为可能的，但只推荐用于显著acoustophoresis经验运营商。
图4.声学系统配置用于自动分离试验。蓝线通过系统跟踪主流路。所有绿色和黑色线是0.03“内径（ID）油管，以及所有的蓝色和灰色色线是0.01”ID管，与电子xception的保持线圈，它们是0.03“ID，以及限流器，它是0.006”的ID。该注射器都充满了缓冲区，并且保持线圈有足够的体积（550微升），以防止任何样品或清洁剂进入注射器的摄取。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 分离过程
- 预运行状态。前运行的分离，确保清洗试剂容器（漂白，乙醇，缓冲液）中有足够的流体，废弃储层不充分，而流体管线都准备（即，填充有溶液）。如果后者条件是不确定的，或者如果系统被空转之后被首次运行时间 （例如，在第一时间在某一天），运行一个自动清洁过程（见下面的步骤5.3）。设置阀3和4在芯片插座流到浪费RESErvoirs开始。
- 开启冷却风扇，并设定功能发生器在谐振频率用于声音芯片被使用时，如在步骤4.5确定。调节电压设定点的函数发生器，以便在12和25 V pp的RF放大器的输出，以适合所希望的分离。
- 连接样例输入样品瓶，缓冲器输入样品瓶，并适当收集瓶到系统。只需连接样品输入小瓶其动作油管前，涡旋小瓶简单地重新暂停，可能已经解决任何颗粒。然后，将小瓶并启动分离程序刻不容缓。
注意：如果要处理的样品含有潜在感染剂，小瓶应该是一个螺旋盖式的，以保持密封的系统和防止样品气雾。此外，生物危险材料的工作时，处理所有小瓶和管而穿着必要的防护用品，并使用REQuired风险控制措施和程序的生物危险组和生物安全水平适当的物质。咨询机构的政策和方案的情况下，任何的不确定性。 - 使用程序在实验室自动化工具包，以控制阀，流量传感器和泵进行全自动分离程序。
注：程序切换阀，驱动注射泵撤出和输液，并监视流量传感器的数据进行正确的时序输出采样馏分收集。主要步骤在5.2.4.1总结如下通过5.2.4.3，仿佛手工进行。- 总理的皮卡管。从采样输入样品瓶撤回大约15微升完全填满它同时连接到阀1.管，素连接缓冲器输入到样品瓶阀2以类似的方式在管中，阀1素空气入口，以确保它不包含任何液体。最后，开关阀1和2驱逐浪费任何过量的流体或空气已进入负载线圈。
- 加载样品线圈， 如图5a所示。用于处理250微升样品的典型装载顺序是撤回25μl的空气，在50微升/分钟，然后加入250微升样品以200μl/分钟，接着以35微升主导缓冲液以200μl/分钟，最后另外的25微升的空气以50μl/分钟。
注：所有卷和流速是用户可选择的。请注意，此装载顺序是在如何流体插头将流过分离装置相反的顺序。 - 样品开始输液。设定注射器泵注入所装载的流体塞在所希望的速率（通常为100微升/分钟）。监测流率在SPO和LPO与流量传感器，以确保流动稳定并且在步骤4.1中确定的比率，而堵塞未发生。
- 收集分离的部分。当流量传感器检测流量激增，表明PA的第一空气间隙ssage，切换从废物的相应输出阀（其中，它开始在步骤5.2.1）至样品收集瓶中。
- 样品从芯片通过后，观察流量传感器检测所述第二空气间隙。此时，切换输出阀回浪费。之后从步骤5.2.4.2加载的全卷被分配，停止注射泵注入，并终止例行程序自动化当流量达到零。
- 分离实验完成后，断开SPO和LPO的样品收集瓶，并适当存储它们用于随后的分析。
- 自动清洁和去污
注：在处理每个样品，冲洗并用下面的自动化程序净化整个流体系统。- 固定SPO和LPO的收集瓶管，以及在空小瓶样品拾取管来收集将被刷新THROU过量的清洗液GH管。
- 启动自动系统清理程序。如同在步骤5.2的自动分离过程，程序应该控制阀和注射泵依次加载保持线圈与清洁试剂，并通过系统冲洗。
- 用10％的漂白剂冲洗，然后用70％乙醇，并与水或适当的缓冲盐水结束（例如，1×PBS或缓冲液用于样品处理）：执行以下清洗例程。使用以下冲洗量：450微升为漂白剂和乙醇，和1000微升的水/缓冲。
- 期间冲洗步骤，冲洗各试剂进SPO而LPO出口阀被设定为被阻止的端口，然后，反之亦然，以除去任何潜在的堵塞，在出口限流器。保持300-500微升/分钟的撤出和输注流速，以尽量减少产生气泡管中及背压累积时，无论是SPO或LPO被阻塞。
- DISCARD多余的冲洗解决方案，并在他们收集按照适当的程序处理生物或化学废物的小瓶。
Representative Results
该声微流体装置设计的主要特性在图1中被突出显示，并描述充分别处。15简言之，两种流体流侧由端在分离信道，由薄的硅壁从并行旁通通道分离。由于初级辐射力的大小可随着颗粒的体积，大颗粒迁移出来朝向位于相邻的回收流体流中的声压节点混合样品输入流，同时小颗粒停留在原来的流（图1B 中的C）。该细分双通道架构提高颗粒分离17，并允许调整节点的位置使用不同的旁路通道的流体。16流体线路板及固定装置提供了一个强大的平台，为世界芯片的连接，和模块化设计使流体芯片之间的快速变化（图2）。这个Configuration同样允许可逆流体连接，这密封高达1,000 psi的，也可以快速和可靠地（图2B 中的E）制成。
一个芯片的谐振频率 f RES可使用简单的一维分析计算来估计（参见步骤1.1.1）。从我们的设备的横截面，16的更完整的2D有限元模型为2节点谐振预期聚焦位置为225微米的壁和预期的频率为1.68兆赫。然而，实际的设备˚F 清晰度可以通过±100千赫变化，这取决于操作温度及纵向和横向的共振耦合。因此，装置组件以后中 ，f 水库必须凭经验证实在相 关流速和压电驱动电压，在协议中的步骤4中所述。 图3显示了以200μl/分钟取代表频率扫描，与水的主要和旁通通道，和20 V pp的供给到压电。当压电和微流体装置之间耦合良好，颗粒将紧紧聚焦在共振频率，从而在荧光强度和迁移到预期的聚焦位置（图3A）一个明确的峰。与此相反，当存在差耦合，颗粒将不会聚焦良好，频率扫描的结果将是类似于图3B。在这种装置中，压电换能器可能需要被重新安装，如果可逆粘合剂已被使用;否则，这种装置不适合时高质量聚焦或快流是用于需要的应用程序的关键。 图 3中的数据通知操作频率后续实验的选择，且电压和流可用于高效颗粒分离率范围。
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图5.自动化来样加工。样本中样品盘装载（ 一）示意图 。 （B）的一个成功的分离实验的代表性的流动剖面。从运行间隔期间，SPO出口堵塞在约220秒（ 三）流动剖面。 请点击此处查看该图的放大版本。
识别芯片，是有效的分离器之后，它们被结合在图4中所描绘的系统。系统总容积为最小通过使用管道用0.01“沿主流动通道的内径（蓝线）。 图5A示出的化妆通过系统输注的典型样品塞。需要少量的“龙头缓冲区”（〜35微升），以prece德样品中的流动，以消除流量波动，而样品通过分离芯片移动。 图5B示出了从一个成功的自动声学分离试验所得的数据流。一个成功运行的主要特点包括：（1）在流量都LPO和SPO瞬加压力建立和流体开始流过系统，（2）尖峰表示气泡的通道（中插图示出了单个气泡），它应达到LPO前SPO的放大剖面由于来自两个出口的不平等流，（3）通过两个气泡作为样本的移动之间两个出口通过系统稳定的流动，和（4）逐渐减少流量在两个出口的全部样品体积之后被输送到系统中。有问题的运行是从流动曲线类似于图5C，它出现了SPO 220余秒后成为阻塞立即显现出来。在THI案，一个类似于步骤5.3中描述的清洁程序应运行以疏通通道。
图6.设备可调性：粒度和电压的影响 。在过氧化脂质萃取聚苯乙烯微球的百分数取决于颗粒尺寸和电压供给到压电陶瓷。每一行对应于一个不同的工作电压在共振频率，通过该装置在步骤4中的总流量描述确定为200微升/分钟，用1.62和1.64兆赫之间施加的驱动频率。误差棒代表至少三个独立实验的标准偏差。转载和http://pubs.rsc.org / EN /内容/ ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j修改的化学皇家学会的许可。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图6示出了编译使用各种聚苯乙烯颗粒尺寸和压电驱动电压，演示所需有效分离的工作参数分离结果。在一般情况下，更高的电压（即，大于声学力）所需的提取更小的颗粒，如预期。驱动电压不能无限期但是增加，由于更大的散热及声流的增加的效果。13情节用作该显示显著不同的恢复在特定的驱动电压（例如，10-粒子间分离粒径一般的指导和2微米粒子在8.8 V峰峰值）将分开好。通常，颗粒种群具有大尺寸差，如病毒（〜100nm）的和细胞（〜10微米）能迅速且有效地分离，因为可以差异的细胞erent尺寸（例如，6-8微米盘状红细胞和8-15微米白细胞）。与其他细胞类型的工作所需的特定条件必须根据经验确定，如细胞形状，密度和可压缩性影响其声学造影，除了细胞大小。为此，在步骤4中的程序是用于确定可用分离条件为任何新的小区或颗粒型是有用的，而不仅用于评估特定acoustophoresis设备的质量。
细胞病毒加标样品图7的分离效率的影响。从（A）的Raji细胞掺入登革热病毒（DENV） 和 （B）Raji细胞和博阿肾细胞掺有金门病毒（纪源）分离的结果。收集的百分比被定义为病毒或细胞来自特定排出馏分出口相比总量离开芯片。误差线（A）的3个试验的标准差，而在（B）中的样品只进行了由于低量获得处理一次。的1×PBS用作样品缓冲液和回收液，用水在所有实验的旁通流路。芯片的工作频率1.60和1.64兆赫之间变化，在16〜20 V pp的驱动电压。 请点击此处查看该图的放大版本。
为了证明这一点平台生物粒子分离的实用性，我们首先用它来 处理充分表征生物样品：人类Raji细胞（10 5个细胞/ ml，平均粒径8-10微米25）掺有登革热病毒（DENV，10 5 PFU /毫升，直径约50纳米的26），图7A显示Raji细胞和DENV收集在两个SPO和LPO的百分比（定义为从与从芯片收集各颗粒的总量比较每个出口收集的每种颗粒类型的级分）。该实验重复三次，并用Coulter计数器Raji细胞进行定量，而DENV是使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR的）定量。
接着，该系统的性能在一个场景，是更现实的，用于处理的临床样品，在其中颗粒的确切物理特性可以是未知的进行了测试，并可用样品量较低。在这里，我们评估了标题最近金门病毒（纪源），蛇病原体感染蟒蛇肾细胞27的纪源病毒颗粒的尺寸分离尚未测定，但由于纪源属于沙粒病毒科 ，它很可能的相似的大小，在100至150纳米。28我们处理的样本与纪源尖刺（10 4 PFU / ml）的插入的Raji人细胞（未感染对象为病毒），和蟒肾细胞（感染目标纪源，近似尺寸10微米27），具有在10 4个细胞/ ml的两种类型的细胞。由于这些样品在低量可用，仅来自一个实验运行的分离结果列于这项工作。 图7B显示 Raji细胞，博阿细胞的百分比，和纪源从SPO和LPO收集。细胞进行定量在这些实验中通过计数上血细胞计数器和病毒用RT-qPCR定量。
Discussion
该协议提出了微流控设备的系统级集成，以宏观的设备进行自动化生物样品处理。这个平台的模块化允许它为适用于任何连续流动装置中，和，作为一个例子，所提出的协议的重点是表征和优化acoustofluidic粒子分离装置的性能。这个协议的三个主要优点突出：（ⅰ）模块化和芯片到世界的接口，（ⅱ）鲁棒表征设备的性能，以及精确计量样品体积为粒子分离（ⅲ）自动处理。
一世。模块化和芯片到世界的接口
如图2所示，微流体芯片被安装在一个自定义的实验板以很容易地装配到一台显微镜直接观察。线路板含有＃6-40 UNF螺纹在一个5毫米间距网格，ENA孔金光闪闪芯片被固定，并且被制成流体连接。流体连接PEEK管与机械加工的端面，该密封件对流体芯片用橡胶面密封垫圈和一个不锈钢的衣领。这个接口方案，可以方便片替换和快速装置的重新设计，需要很少或没有改变其他系统组件，提供芯片脚印符合网格格式。例如，我们已经使用该平台的微流控芯片为连续流动电泳，热裂解细胞，29快速试剂化学合成的混合，和单细胞捕获和询问。
二。设备性能强大的表征
为了优化任何微流体分离装置的性能，它的操作，必须首先充分表征。此处所描述的系统支持的快速和自动化协议来做到这一点的发展。对于具体examp声学聚焦设备中，聚焦质量，工作频率，并在微流体通道集中颗粒的位置的文件，必须进行测量为每个单独的设备。这些测量需要通过一系列的压电陶瓷驱动器的频率，电压和流速扫，以确定最佳参数的组合为高质量的分离。所提出的协议自动改变这些可调参数和捕捉相关数据- 即 ，颗粒中流动的信道进行后处理，以产生颗粒的聚焦质量，频率和位置 （图3）所需的测量的荧光图像。
的声学装置的性能全面表征要求重复步骤4.4和4.5在需要不同的实验条件下。例如，一个芯片的绝对聚焦位置被以相对低的流率和高的电压运行频率扫描发现s至确保完全迁移到节点位置。另外，这样的频率扫描可以评估装置组件（具有已知尺寸的聚苯乙烯珠上运行时）的质量，或者，以确定如何先前未知粒子类型将表现在系统（后一个芯片的特点与珠）。与来自压电陶瓷至微流体通道良好能量转移的芯片将导致紧聚焦在高流速（> 1毫升/分钟）和低电压（12〜15 V pp的），而那些与能量转移差不会集中连在低流速下（<100微升/分钟）和高电压（> 20 V峰）。我们已经发现，微流体芯片和压电陶瓷之间的紧密接触为有效的能量转移到流体临界。粘结微流体芯片和压电陶瓷将使可靠的生产的高性能设备的最佳方法的进一步调查。
最后，一个完整可以通过结合步骤4（ 和图3）与来自SPO和LPO作为相关操作参数的功能收集的颗粒数的基于图像的频率扫描测量来获得的acoustophoretic装置的操作的画面，从进行了微球分离实验如在步骤5中描述的。如图6所示，这样一系列自动化实验可以迅速表征单个设备的性能和可调谐性，通知最优参数空间的用户来操作设备，用于颗粒分离。
三。对于粒子分离自动化小样本处理
对于成功的和精确的微流控芯片基于样本的处理，这是至关重要的，以可靠地和精确地计，负载，提供和收集的流体的体积，因为他们通过。这个精度是特别重要的，当样本量小（〜0.1-1毫升），这是在临床或研究实验室环境常见。30精确样品处理是在采用样品手工撤回到注射器和输注到装置与样品时的无反馈的传统微流体实验有挑战性已被分离和当它应该被收集。所提出的协议采用自动化样品线圈装载和配药加上从流量传感器的实时反馈，以使小体积的样品重复分离。
图5示出了在SPO和LPO从一个典型的分离试验测得的气流文件。首先，为至少35微升导致缓冲器被加载，以确保稳定的流量之前样品达到声学芯片。样品体积小于100微升不推荐用于此系统的配置，因为样品稀释由于领先缓冲器变得过量。空气的插头使用在日的开始Ë注射龙头缓冲区之前向样品塞从以下，防止混合和稀释试样和作为一个指标的流量传感器的流体中分离出来。后的初始瞬变流体开始通过系统移动，在两个出口尖峰信号指示第一气泡的通过。这些瞬态之后是稳定的流动的一个长周期作为样品流过系统，那么当第二气泡穿过另一个尖峰，最后最终降低流速为零注射器泵停止之后。
通过流量传感器的空气塞的通道被用作触发点切换阀来启动和停止样品采集，从而由非样本流体体积最小丢失的样品和稀释。处理的样品体积的闭环计量无需重新编程这些值输入样值被改变每次实验开始之前。此功能尤其重要的，当样品量是有限的，例如在许多临床样品的情况下。实时流量监测还有助于排除故障;差的运行（例如，在出口中的一个的堵塞形成）是从所得到的气流文件立即明显的， 如在图5b中。
为了演示的灵活性和acoustofluidic分离的使用提出了系统架构的有效性，纯化登革病毒及纪源病毒的股票是通过微流控芯片掺入细胞储存和处理分开。 图7a显示，Raji细胞以及分离病毒，为97 ％Raji细胞离开所述芯片被发现是在过氧化脂质，从而留下DENV在SPO高度富集的样品。相比较而言，DENV分离的效率较低，与DENV的70％退出在SPO找到的芯片。这可以归因于轻微对流混合引起的separati的匝上信道，但更可能在一定DENV颗粒连同Raji细胞进入LPO迁移。细胞在整个流线横向迁移拖动一些流体与它们，即使在低雷诺数。通过这个机制，以及非特异性表面吸附，病毒颗粒转移到LPO。尽管如此，DENV在SPO的高度富集的样品是显著益处，例如当从头测序被用于检测和鉴定病毒。
图7b显示，在一次试验运行中，只有约70％的Boa细胞退出芯片中发现了过氧化脂质，有近100％的分离效率Raji细胞进行比较。相比，Raji细胞，因此导致更小的声学力，在两种细胞类型之间的分离性能上的差异可以归因于一个更小的平均尺寸或博阿细胞的密度较低。为了证实或驳斥这些推测，宝儿的大小，密度和形态细胞悬浮宝儿细胞（其正常生长贴壁）必须被准确测量，努力作进一步调查。在相同的实验中，类似于与DENV实验中，大部分的回收GGV从SPO退出，指示病毒级分的富集。
所提出的数据突出的工程技术广泛适用的平台所固有的挑战，处理各种生物样品。重要的是，生物相互作用可以开始玩同样大的作用，在物理和机械效应。然而，这些初步的实验也证明了权力和使用该系统的架构来样加工的临床和研究应用的承诺。作为一个强大的，良好的特点设计的系统，这个平台提供了寻求答案，新的科学问题的能力。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly | |||
| Double Sided Polished Silicon Wafer | Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA | 100 mm <100> prime wafer | 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished |
| Glass Wafer | Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA | 100 mmx0.5 mm Boro | |
| Photoresist, AZ 1518 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 1518 | Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching |
| Photoresist, AZ 4620 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 4620 | Photoresist to define fluidic and via mask patterns |
| DRIE plasma etcher | STPS, Newport, NP, United Kingdom | Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system | |
| Wafer Bonder | Electronic Visions Group, St.Florian am Inn, Austria | EVG 501 | |
| Dicing saw | Kulicke & Soffa Industries, Singapore | K&S 982 | |
| Epoxy kit | Epoxy Technology, Billerica, MA, USA | EPO-TEK 301 | Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip |
| PZT piezoceramic | Piezo Systems, Woburn, MA, USA | PSI-5A4E | 37.5 × 10 × 0.5 mm |
| 28 AWG Kynar-insulated solid wire | Squires Electronics, Cornelius, OR, USA | UL1422 | |
| 2-part silver epoxy | MG Chemicals, Surrey, BC, Canada | 8331 | Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT |
| L-edit | Tanner EDA, Monrovia, CA, USA | Ledit v15.1 64-bit | CAD software for mask layout |
| Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance | |||
| Dual Pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD ULTRA Series, 703007 | |
| 5 ml syringes | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 309646 | |
| Luer to Threaded port adapter | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-659 | Connects syringe to tubing |
| Union | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-623 | Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing. Can also use webbed |
| Ferrule 1/4-28 flat bottom | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-200 | Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware |
| Nut 1/4-28 flat bottom | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-202 | Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware |
| 1/16" OD Fluoropolymer tubing | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1912L | Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections. Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L). |
| Small ID fluoropolymer tubing | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1476-20 | Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP |
| PEEK tubing | Connects from chip to fluoropolymer tubing. | ||
| Cooling fan | Multicomp, Leeds, England | MC19663 | |
| Function Generator | Agilent, Santa Clara, CA, USA | 33220A | |
| RF amplifier | ENI, Rochester, NY | 325 LA | Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo. |
| CCD Camera | Photometrics, Tucscon, AZ, USA | CoolSnap HQ | |
| Inverted Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Axiovert S100 | |
| FITC filter set | Chroma Tech, VT, USA | SP101 | |
| Objective, 10X | Zeiss, Oberkochen, Germany | ACHROPLAN | |
| Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, OR, USA | TDS3014B | To monitor voltage output by RF amplifier |
| MatLab | Mathworks, Natick, MA, USA | R2014a | |
| Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW | R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA | SITK | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA | P9416 | |
| Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads | Bangs Laboratory, IN, USA | FS06F | |
| Additional materials required for Step 5: Automated Separation | |||
| Multiport valves | VICI, Houston, TX, USA | C25Z-3180EUHA | In the current configuration 4 valves are needed |
| Flow Sensors | Sensirion, Westlake Village, CA, USA | SLI-1000 | |
| Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1902L and 1912L | High purity PFA preferred |
| Nut | VICI, Houston, TX, USA | ZN1PK-10 | Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10 |
| Ferrule | VICI, Houston, TX, USA | ZGF1PK-10 | Used with nut to make connections between tubing and valves. |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX, USA | LabVIEW Professional Development system | Laboratory Automation Software |
| PBS | Teknova, Hollister, CA, USA | P0200 | |
| Raji Cells | ATTC, Manassas, VA, USA | CCL86 | |
| Boa Cells | Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF | ||
| GGV | Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF | ||
| DENV | Kindly provided by Jose Pena at LLNL | ||
| Coulter Counter Z2 | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Z2 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific, Waltman, MA, USA | 0267151B | |
References
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