Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

Published: November 23, 2015 doi: 10.3791/53051

Abstract

Ein großer Vorteil der mikrofluidischen Systemen ist die Fähigkeit, kleine Probenvolumina zu manipulieren, damit Reagenz Abfälle reduzieren und die Erhaltung wertvollen Probe. Allerdings ist eine robuste Probenmanipulation zu erzielen es notwendig, die Geräteintegration mit dem Makroumfeld anzugehen. Wiederholbare, sensible Partikelabscheidung mit mikrofluidischen Systemen zu realisieren, stellt dieses Protokoll eine komplette automatisierte und integrierte mikrofluidische Plattform, die präzise Verarbeitung von 0,15 bis 1,5 ml Proben unter Verwendung von mikrofluidischen Bauteilen ermöglicht. Wichtige Aspekte dieses Systems sind modulare Geräte Layout und robuste Vorrichtungen was zu zuverlässigen und flexiblen Welt, um Verbindungen Chip und vollautomatische Fluid Handling, die Closed-Loop-Probensammlung, System Reinigung und Grundierung Schritte zur wiederholbaren Betrieb zu gewährleisten erreicht. Unterschiedliche Mikrofluidvorrichtungen können austauschbar mit dieser Architektur verwendet werden. Hier übernehmen wir eine acoustofluidic Gerät, Detail ihrer dadurch gekenn¬ zeichnetation, Performance-Optimierung, und zeigen ihre Verwendung für Größe-Trennung von biologischen Proben. Durch die Verwendung von Echtzeit-Feedback während der Trennung Experimenten wird Probensammlung optimiert, um zu erhalten und zu konzentrieren Probe. Obwohl die Integration von mehreren Geräten erfordern, Vorteile dieser Architektur umfassen die Fähigkeit, unbekannte Proben ohne zusätzliche Systemoptimierung, einfache Geräteaustausch und exakte, robuste Probenverarbeitung verarbeiten.

Introduction

Probentrennung und Fraktionierung ist eine der vielversprechendsten Anwendungsgebiete für Mikrofluidtechnik. Eine solche Probenhandhabungsschritte sind integrale für effektive klinische Diagnose, Therapie Entwicklung, biosurveillance Bemühungen und Fortschritte in der Life-Science-Forschung und Technologie. Eine Myriade Mikrofluidik-Trenn Strategien für Fluid suspendierten Partikeln und Kolloiden, sowie für chemische und biologische Spezies nachgewiesen worden; mehr Bewertungen bieten Übersichten über die jüngsten Fortschritte und Entwicklungen in diesen Bereichen 1-9. Obwohl viele dieser mikrofluidische Trenntechnologien (im Folgenden als "Core-Geräte" genannt) wurden ausführlich charakterisiert, haben einige Berichte die Probentrennproblem auf Systemebene betrachtet. Die Core-Geräte sind in der Regel einzelne Zentimeter-Skala-Chips, eine Schnittstelle zu Fluorpolymer-Schläuche, mit durch eine Verschiebung oder Druckpumpe geförderten Flüssigkeit.Und doch, wenn das Versprechen der Mikrofluidik - einschließlich der erhöhten Automatisierung, Zuverlässigkeit und Verringerung der Probenmengen - ist, Wirklichkeit zu werden, zumindest eine gleichwertige Anstrengungen unternommen werden müssen, um das Design einer vollständigen Trennung System, in das die Kernvorrichtung integriert gewidmet werden .

Darüber hinaus ist eine große Herausforderung für die Mikrofluidik-Ansätze zur Lebenderkennung ist das Makro bis Mikro-Schnittstelle. Dies bezieht sich nicht nur auf die physische "Welt-to-chip" Verbindungen einer mikrofluidischen Vorrichtung zu makroskopischen Komponenten und der Fehlanpassung zwischen typischen klinischen oder analytischen Probenvolumina (~ 0,1-10 ml) und das Innenvolumen des Mikrofluidik-Chips (~ 0,01-10 & mgr; l), sondern auch auf die statistischen Stichprobenbegrenzungen aus Überbrückung dieser Größenskalen. Diese Probleme beitragen, die Wahrnehmung, dass die Probe vor der Verarbeitung und Zubereitung sind die "schwache Glied" der Biodetektion. 10 Die in dieser Arbeit beschriebenen ta-Plattformkes wichtige Schritte in Richtung der Bewältigung dieser Herausforderungen.

Einen Ansicht auf Systemebene, dieses Protokoll beschreibt die sichere Verarbeitung von genau dosierte analytischen Maßstab Volumina (Bereich von 0,15 bis 1,5 ml) auf ~ 10 min Zeitskalen. Dies ist eine "Ein-Knopf" Operation: Sobald die Quelle Fläschchen mit der Probe und Ziel-Fläschchen für Fraktionssammlung in das System gelegt, den Befehl "Ausführen" startet den Vorgang, und alle Schritte sind computergesteuert. Am Ende eines Durchlaufs können die Sammelfläschchen aus dem System für nachgeschaltete Analyse der getrennten Fraktionen entfernt werden.

Der Core-Gerät in diesem System ist ein acoustophoresis Chip, der Säugetierzellgroße (5-20 & mgr; m) Partikel aus der Probe extrahiert. Acoustophoretic Trennung wird hier gewählt, vor allem, weil es Hochdurchsatz (bis zu 100 s von & mgr; l / min), markierungsfreie und berührungslose und bietet damit Vorteile bei der Trennung von lebensfähigen Viruses von Zellen, die nur wenige andere mikrofluidische Techniken entsprechen. Die Physik der Schallpartikel Fokussierung wurden ausführlich beschrieben ist, 11 bis 13 und sind nicht der Schwerpunkt dieses Protokoll, sondern eine kurze Zusammenfassung der zugrunde liegenden Konzepte folgendermaßen vor, um das Verständnis der Anwendung auf Mikrofluidik-Trenn unterstützen.

Ultraschall-Stehwellen in Resonanz in flüssigkeitsgefüllten Mikrokanälen zu erzeugen Druckfelder, die zu Kräften, die Partikel in Richtung Knoten des Niederdruck-Antrieb zu geben. Die Kraftgröße ist abhängig von Volumen des Teilchens, und 14 als solche auf einem akustischen Kontrastfaktor von den relativen Dichten und Kompressibilität des Teilchens abgeleitet und der Suspensionsflüssigkeit., Akustische Fokussierung ist ideal gelegen, um die Trennung von Zell-Größe (~ 15.7 geeignet mgr; m) von Virus-Größe (~ 50-200 nm) Teilchen. Die größeren Partikel wandern zu einem Druck-Knoten; da jedoch die Kraftgröße sehr klein ist fürPartikel, die kleiner als 2-3 um, diese kleinen Teilchen oder gelösten Spezies kaum bewegen. Unsere spezielle Implementierung akustische Trennung, wie zuvor beschrieben, 15 enthält eine dünne Wand, um den Fluidkanal zu unterteilen und ermöglicht abstimmbaren asymmetrische Anordnung der Fokussierungsposition. Dies erhöht die Flexibilität im Gerätedesign und die Leistungsvorteile, einschließlich der erhöhten Trennqualität und Geschwindigkeit-vollständig an anderer Stelle beschrieben. 16,17

Allerdings ist ein großer Vorteil der in dieser Arbeit beschriebenen System-Level-Design-Ansatz, dass sie anpassungsfähig zu einer großen Vielfalt von Mikrofluid-Core-Geräte ist. Beispielsweise können die meisten anderen Durchfluß-Trennungen, einschließlich Trägheits- Strömungsfeld-Fraktionierung, deterministische seitliche Verschiebung (DLD), und verschiedene Arten von elektrokinetische Vorrichtungen ohne weiteres eingebaut werden, mit entsprechenden Anpassungen vorgenommen, um Änderungen der Einlass / Auslass-Konfigurationskonto , Fließraten,und Probenvolumina. Geräte mit verschiedenen Arten von On-Chip-Bereichen (elektrisch, magnetisch) oder Gradienten (thermische, chemische) können zusätzliche Verbindungen mit dem Chip oder die Integration zusätzlicher Hardware, die diese Plattform bietet Platz benötigen.

Dieses Protokoll sieht die erforderlich ist, um eine mikrofluidische Trenneinrichtung zu gestalten, und Silizium-Glas-Chips in vielen Mikrofertigungseinrichtungen herzustellen durch tiefe reaktive Ionenätzen (DRIE, ein Plasma-Ätzprozess zur Verfügung, die alternierenden Zyklen von Ätzen und Passivieren tief zu erreichen nutzt Schritte Funktionen mit vertikalen Seitenwänden 18). Als nächstes beschreiben wir die Charakterisierung der acoustofluidic Einrichtung, um die optimalen Betriebsparameter für die Trennung bestimmen, und schließlich Detail den vollintegrierten Trennsystem und das Verfahren für die Verarbeitung von biologischen Proben. Typische Bauteilcharakterisierung Ergebnisse und Probenverarbeitung Daten werden dann vorgestellt und diskutiert und die wichtigsten Vorteile dieser approach markiert sind, einschließlich Modularität, Robustheit, Präzision und Automation.

Protocol

1. Acoustophoretic Geräte Design- und Fotomaskenlayout

HINWEIS: Allgemeine Überlegungen und Leitlinien für Mikroprozessdesign und Maskenlayout in Texte auf Mikrofabrikation und Tutorials von Photomaskendesign gefunden werden 19-21.

  1. Layout-Maske 1, die Fluidic Layer (Vorderseite), unter Verwendung von geeigneten CAD-Software. Wählen Sie eine Geometrie, die Probeninjektion und Trennung für die gewünschte Anwendung geeignete erlaubt.
    1. Für akustische Fokussierung stellen Sie den fluidischen Kanalbreite w, um eine Resonanzfrequenz f n liefern größer als 1 MHz nach der Gleichung f n = nc / 2W, wobei c die Schallgeschwindigkeit in dem betreffenden Fluid und n die Anzahl von Stehwellen-Knoten (beispielsweise für ein 900 & mgr; m breiten Kanal, die zwei- Knoten Resonanz bei f 2 = 1,65 MHz) erwartet.
      HINWEIS: Particles einnimmt deutlichen seitlichen Positionen in der Nähe des Endes der Trennkanal vom unterschiedliche Auslässe verlassen. In diesem Protokoll werden die Partikel nach der Größe getrennt werden, so dass die Auslässe SPO LPO für kleinteilige und großteilige Steckdose bezeichnet, wie in Abbildung 1 dargestellt.
    2. Gesetzt den Fluidkanallänge zu steuern, die Länge der Zeit Partikel dem Trennbereich bei einer bestimmten Strömungsrate ausgesetzt. Mehr On-Chip-Verweilzeit für Partikel aufgrund Trennkräfte migrieren müssen auf die größere erforderliche Chip-Fußabdruck gehandelt werden.
      HINWEIS: In unserem akustische Fokussierungseinrichtungen, macht sich der Strömungskanal drei Durchgänge auf der Chip für eine erhöhte Verweilzeit (Abbildung 2a). Bei einer typischen Gesamtströmungsgeschwindigkeit von 200 ul / min, Teilchen durch die 300 x 200 um Querschnitt, 117 mm langen Trennkanal fließenden geben im Durchschnitt 2,1 s in dem Schallfeld.
  2. Fügen fluidischen Anschlüsse in der Maske layout für den Anschluss an Standard-Schläuche auf einem standardisierten Raster (5-mm-Raster) angeordnet ist. Umfassen geeignete Bezugsmarkierungen zum Ausrichten der Masken zueinander während der Herstellung und Vereinzelung von Einzelgeräten.
  3. Layout-Maske 2, die Via Layer (Rückseite), die nur enthält fluidischen Anschlüsse. Fügen Bezugsmarken zur Ausrichtung auf Maske 1.

Abbildung 1
Abbildung 1. Acoustofluidic Geräte. Schematische Skizzen acoustophoretic Gerätearchitektur. (A) Draufsicht, welche den Gesamt H-Filter-Konfiguration (nicht maßstabsgetreu). (B) Schematische Darstellung des Kanalquerschnitt an der Stelle, von der schwarz markierten gestrichelte Linie in (a), die die Druckfeld (blau gestrichelte Linien), und das Gefühl der akustischen Primärstrahlung Kräfte (PRF), die Partikel in Richtung fahren Knotenebenen (rote Pfeile). Der Kanalquerschnittist 900 × 200 & mgr; m mit einer Mauer etwa 10 & mgr; m dicken Trennhaupt (300 & mgr; m breit) und Bypass-Kanälen. (C) 3D-Darstellung der Partikelabscheidung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Reinraum-Fertigung von mikrofluidischen Chips für Acoustophoresis

  1. Muster der Rückseite Fluidanschlüsse mit Maske 2 auf einem doppelseitig poliert 0,5 mm Dicke, Durchmesser 100 mm <100> Silizium-Wafer durch Standard positive Resistphotolithographie. Ätzen dieser Geometrie durch tiefes reaktives Ionenätzen (DRIE) zu einer Tiefe von 350-400 um.
  2. Drehen Sie den Wafer über, und das Muster der Vorderseiten-Fluidkanal-Geometrie mit Maske 1 durch Standard positive Resistphotolithographie auf die andere Seite des Silizium. Dann montieren Sie den Device-Wafer mit einem zweiten (leeren Silizium) Träger-Wafer unter Verwendung von Photoresist.
  3. Ätzen der Kanäle auch durch DRIE, bis zu einer Tiefe von 200 um durch Ätzen des Siliziums in den Durchgangsöffnungsstellen (die Trägerscheibe schützt den DRIE Werkzeugoberfläche). De-Montage des Device-Wafer aus dem Rohling Si-Wafer durch Einweichen in Resist-Entfernungslösung.
  4. Reinigen Sie das Gerät Wafer und eine gesichts 0,5 mm dicken Borosilikatglas Wafer mit Piranha-Lösung (Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid in einem Verhältnis 3: 1).
  5. Verschließen Sie die Fluidkanäle durch anodisches Bonden der Glas und Silizium-Wafer mit den folgenden Parametern: Kammerdruck auf 3 mTorr, Kolbendruck bei 1.000 N, Temperatur bei 350 ° C, und anwenden 750 V, bis der Strom unter 0,2 mA.
  6. Schneiden Sie die einzelnen Chips heraus mit Diamantscheibe auf einer Trennsäge.

3. Schlussgerätemontage

  1. Piezo Transducer Befestigung
    HINWEIS: Ultraschall wird in der Mikrofluidik-Chip durch einen piezokeramischen Wandler zum Silicium Seite angebracht generiert.
    1. Von zuminWO-Komponente mit niedriger Viskosität Epoxy-Kit, wiegen das empfohlene Verhältnis der beiden Komponenten und mischen Sie sie gründlich.
    2. Verzichten die Epoxy-Mischung mit einer Pipette und gleichmäßig verteilt über eine Blei-Zirkonat-Titanat (PZT) Piezokeramik, eine dünne, gleichmäßige Schicht (etwa 10 & mgr; l von Epoxy-Mischung für eine piezo mit Abmessungen von 37,5 x 10 x 0,5 mm) zu erstellen.
    3. Unter Verwendung einer geeigneten Spannvorrichtung oder Befestigung, Ausrichtung des Epoxy Seite der Piezokeramik mit der Mikrofluid-Chip, wodurch eine überhängende Fläche auf der einen Seite für eine nachfolgende Drahtbefestigung (siehe Abbildung 2a) und bringt die beiden Bauteile in Kontakt. Klemmen Sie die Montage in einen Schraubstock, kümmert sich nicht um eine der Komponenten zu knacken, und Heilung bei der Temperatur und Dauer durch die Epoxy-Hersteller empfohlen wird.
    4. Nachdem das Epoxidharz ausgehärtet ist, befestigen Sie die Feindrahtstärke führt zu jeder Seite der Piezokeramik, durch Löten mit einem feinen Spitze Lötkolben, so dass die kürzesten möglichen Kontakt mit dem piezo zu t vermeidenhermally de-Polarisations es. Alternativ ist ein elektrisch leitender Klebstoff auf Drähte mit dem piezo kleben.

Figur 2
Abbildung 2. Fluidic Breadboard, Chip-Montage und World-zu-Chip-Schnittstelle. Fotos von (a) der akustischen Mikrofluid-Chip (Außenabmessungen von 70 × 9 × 1 mm) mit angeschlossener Piezowandler Drahtleitungen, zeigt drei Durchgängen der Trennung Kanal auf der Chip, (b) individuelle fluidischen Verschraubungen und bearbeitete Rohrkomponenten für die Chip-zu-Welt-Schnittstelle, (c) der Chip an der Unterseite des fluidischen Steckbrett mit Spannvorrichtungen befestigt und überspannt eine Öffnung in dem Steckbrett zu ermöglichen Lüfterkühlung, (d) eine Draufsicht auf das Steckbrett mit angeschlossener Schlauchverbindungen und Lüfter, und (e) eine schematische Querschnitts der Verschraubungen, die den tubi Schnittstelleng mit dem montierten Mikrofluid-Chip. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Gerätemontage und Welt-zu-Chip Interfacing
    1. Befestigen Sie den Chip mit dem "fluidischen Steckbrett" (einer Platte mit einem Gitter von regelmäßig beabstandeten Durchgangsbohrungen mit Gewinde) mit Spannvorrichtungen. Bringen Sie einen Lüfter mit dem Steckbrett zu Temperatur bei der akustischen Experimenten zu regeln (siehe Abbildung 2).
      ANMERKUNG: Betriebs ohne Lüfter bei typischen Antriebsspannungen stellt sich die Gerätetemperatur auf 70-80 ° C. Dadurch verschiebt sich deutlich die Resonanzfrequenz aufgrund der veränderten Schallgeschwindigkeit in der Flüssigkeit und kann sich negativ auf die Rentabilität einer biologischen Partikeln, die verarbeitet werden.
    2. Schrauben Sie in Span-zu-Welt-Anschlüsse, die zuvor an anderer Stelle beschrieben 22 und in Abbildung 2 dargestellt. Begleiten Sie diese interface Rohre, zusätzliche Schläuche an den Ein- und Ausgängen mit Standard ¼ "-28 Gewerkschaften für 1/16" Schlauch.

4. Charakterisierung von Acoustic Fokussierverhalten

HINWEIS: Systemkomponenten für akustische Fokussierung Charakterisierung erforderlich sind in der Materialliste zusammengefasst. Die Schritte 4.1 und 4.2 unten gelten für alle mit dieser Plattform verwendet Kernvorrichtung, während die nachfolgenden Schritte beschreiben, der spezifisch auf die acoustofluidic Gerät hier besprochenen Operationen.

  1. Systemkonfiguration
    1. Montieren Sie die Mikrofluidik-Chip mit Welt-zu-Chip-Verbindungen auf dem fluidischen Steckbrett, wie in Abschnitt 3 Make-Verbindungen mit Schlauch (wie 1/16 "Außendurchmesser Fluorpolymer-Schlauch), um eine Fluidpumpe und Sammelfläschchen beschrieben. Montage des Steckbrett Montage auf dem Objekttisch eines Mikroskops in der Lage ist Fluoreszenz-Bildgebung mit einer CCD-Kamera ausgestattet.
    2. Schließen Sie Längen von kleinen Innen diameter (ID) Schlauch (0,006 "wird empfohlen) unmittelbar nach dem Chip (siehe Abbildung 4), die als Durchflussbegrenzer, die das System zu stabilisieren und die Kontrolle der Stromteilung zwischen den Chipstellen dienen. Verwenden Sie größere ID Schläuche, wie zB 0,01 "oder 0,03", für alle anderen Verbindungen.
      1. Schätzung der hydrodynamischen Strömungswiderstand R h jedes Rohrstück mit einer Länge L und Innendurchmesser D unter Verwendung der Gleichung R h = 128 & mgr; l / & pgr; D 4, wobei μ ist die dynamische Viskosität des Fluids. Der Druckverlust Δ P durch jede Rohrlänge bei einer gegebenen Durchflussmenge Q durch Δ P = QR h angegeben.
      2. Wählen eines Verhältnisses von Drossellängen, um die Strömung zwischen den Auslässen gegebenenfalls aufgeteilt für das Trennverfahren verwendet werden. Optimale Trennung mit den akustischen Chips in diesem Protokoll benötigt eine SPO: LPO Stromverhältnis von approximadig 65: 35%.
      3. Wählen der Länge der Austritts Strömungsbegrenzer, so daß ihre Strömungswiderstand mindestens 3-4 mal größer ist als der Gesamtwiderstand in dem Rest des Systems (in geeigneter Weise in Serie oder parallel zusammengefaßt). Zur acoustophoresis Vorrichtung in dieser Arbeit verwendet werden, sind Schlauchlängen von 35 und 65 cm für den LPO und SPO geeignet.
        HINWEIS: Besondere Vorsicht ist bei R h jeglicher mikrofluidischen Kernvorrichtung gegeben werden. Für unsere akustische Fokussierung Chip an dieser Arbeit ist, R h niedriger aufgrund seiner relativ großen Kanalabmessungen, so dass die angeschlossene Rohrwiderstände leicht übertreffen. Bei Geräten mit kleineren Kanalabmessungen, kann Widerstand des Chips den Rest des Systems Schläuche, wobei Gestaltung und Steuerung von On-Chip-Kanal R h eine zusätzliche Gegenleistung in Schritt 1 dieses Protokolls zu dominieren. Detaillierte Konstruktionsprinzipien und Leitlinien sind in der Literatur zur Verfügung. 23,24
  2. System-Überprüfung
    1. Dichtheit prüfen, um zu überprüfen, dass der Mikrofluidik-Vorrichtung weist keine Defekte und alle Schlauchverbindungen versiegelt. Verzichten Wasser durch die Einlaßrohre, wie mit einer Spritze benötigt und Überwachung für jede austretende Flüssigkeit in den Hauptkanal.
    2. Ausgeben einer bekannten Volumen durch den Chip, und Messung der von den Auslässen gesammelten Volumina um sicherzustellen, dass das Strömungsverhältnis ist, wie erwartet. Abweichungen vom erwarteten Volumenverhältnis können Verstopfungen in einem der Auslässe oder undichten Verbindungen anzuzeigen.
      1. Um die Sauberkeit des Systems zu erhalten und zu verstopfen bündig das gesamte System (fluidische Schläuche und Chip) mit entsprechenden Reinigungslösungen (zB Bleichmittel, Ethanol, Wasser) vor und nach der Ausführung keine Experimente zu verhindern.
      2. Im Falle von Holzschuhen oder Blockierungen in einer der Verkaufsstellen, spülen Sie das System beim Einstecken des klaren Steckdose, um die Blockade zu löschen. Gelingt dies nicht, kehren Sie die Flussrichtung während der Spülung,gegebenenfalls Aufbringen schnellen Impulse des Rückstrom (unter Verwendung eines manuell betätigten Spritze). Schließlich, wenn die Blockade noch nicht entfernt werden kann, ersetzen Sie den Schlauch oder ein Chip, wie nötig.
  3. Frequency Scan-Setup für Akustik Fokussierung
    1. Füllen der Bypasskanal (siehe 1) mit Fluid, beispielsweise entionisiertes Wasser, Ethanol oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch manuelle Injektion mit einer Spritze. Man beachte, daß diese Flüssigkeit nicht in Kontakt kommen, wobei die Probe verarbeitet. Die Einzelheiten der Einstellung Knotenposition unter Verwendung unterschiedlicher Bypass Flüssigkeiten werden an anderer Stelle beschrieben, 16,17. Kurz gesagt, wenn der Knoten näher an der Trennwand zu sein braucht, eine niedrigere Dichte Bypass-Fluid, beispielsweise Ethanol; für Knotenplatzierung näher an der Eingangsprobenstrom, wählen Sie eine dichtere Fluid, wie etwa einer Glycerinlösung.
    2. Einen Bead-Lösung von etwa 0,01% (w / v) 5-8 & mgr; m fluoreszierenden Polymerkügelchen in einem Puffer wie PBS mit0,05% Tween-20 und füllt die Probeneinlass Spritze mit der Bead-Lösung. Auffüllen des Puffereinlass Spritze mit dem gleichen Puffer (dieses muss nicht die gleiche Flüssigkeit wie in den Bypass-Kanal sein). Man beachte, dass im Allgemeinen der Puffer wird gewählt, um die Anwendung (siehe Schritt 5.1) entsprechen.
    3. Mit der fluidischen Steckbrett auf dem Mikroskoptisch, den Schwerpunkt etwa zur Hälfte in die Tiefe des Kanals an einer geraden Kanalbereich unmittelbar vor dem Austritt mit beiden Kanälen (Trennung und Bypass) in dem Sichtfeld. Eine zusätzliche Schrägwinkel externen Lichtquelle kann sich die Kanalwände sichtbar ist, für eine erfolgreiche Nachverarbeitung von Bilddaten zu machen.
  4. Automatisierte Frequenz Scannen und Bilderfassung
    1. Die elektrischen Anschlüsse mit geschirmten Kabeln (zB RG-58 mit BNC-Anschlüssen ausgestattet) zu einem Funktionsgenerator mit Hochfrequenz (HF) Verstärker, um das Anregungssignal an das Piezowandler zu liefern. Optional schließen Sie ein Oszilloskopder Ausgang des Funktionsgenerators zum Überwachen der tatsächlichen Spannung an den Wandler angelegt.
    2. Einschalten des Kühlgebläses und den Funktionsgenerator, so dass der Ausgang des HF-Verstärkers mit dem Piezo-Wandler im Bereich von 12-25 Volt Spitze-Spitze (V pp).
    3. Gesetzt beide Spritzen an der gleichen Flussrate zwischen 50 und 200 & mgr; l / min. Die Verwendung einer einzigen Spritzenpumpe, beide Spritzen mit der gleichen Motorantrieb wird empfohlen, die Störungen auf das Fluss minimieren.
    4. Führen Sie eine Frequenz Scan-Vorgang, indem Sie die Start- und End-Frequenzen, die Schrittweite zwischen den Frequenzwerten, und der Piezo-Treiberspannung mit einer Laborautomation Toolkit wie LabVIEW von National Instruments.
    5. In jeder Frequenzstufe, gelten die Spannung für 15 Sekunden, damit das System ins Gleichgewicht kommen, dann erfassen 10 Bilder von Kügelchen durch den Chip für die spätere Analyse fließt (Belichtungszeiten zwischen 10 und 100 ms werden empfohlen).
    6. Zwischen each angewendet Frequenzschritt, schalten Sie die Spannung für ca. 20 sec zu lassen, die Perlen zu verteilen gleichmäßig über den Kanal und entfernen Bias in der Fokussierung von der zuvor angewendeten Frequenzschritt.
  5. Bildanalyse, um Resonanzfrequenz und Fokusposition ermitteln
    1. Führen Sie einen Bildanalyse-Skript (wie die AF_freqScanPlotter.m MATLAB-Skript mit diesem Protokoll vorgesehenen) und geben Sie die erforderlichen Informationen zu den Eingabeaufforderungen: Wählen Sie die Liste von Bilddateien in Schritt 4.4 erzeugt wird, geben Sie die Scan-Start- und Stoppfrequenz und Schrittweite, die volle Kanalbreite, der Wandlage, und schließlich den Bildbereich auszuwählen, zu analysieren, einschließlich der Trennung und Bypasskanäle.
    2. Beachten Sie die Analyse-Skript die durchschnittliche Menge von Bildern in jedem Frequenzschritt erfasst und der Mittelwert der Intensitätswerte entlang der Strömungsrichtung. Dies führt zu einer Querschnitts-Zeilen der Fluoreszenzintensität.
      HINWEIS: Die Frequenz entsprechend der highe st Intensität als die Resonanzfrequenz (Abbildung 3, mittlere Reihe) und der Position in dem Kanal, wo die höchste Intensität auftritt, ist die Fokussierungsposition (Figur 3, untere Reihe) definiert.

Figur 3
Abbildung 3. Repräsentative Frequency Scan. Beispiel der Frequenz-Scan-Daten für gut verbunden (A) und schlecht verbunden (B) und Piezo-Chip. Obere Reihe: Fluoreszenzintensität von Kugeln (rot steht für hohe und Blau steht für niedrige Intensität). Mittlere Reihe: maximale Intensität bei jeder Frequenz. Untere Reihe: Ort der maximalen Intensität, wo die rote gestrichelte Linie vorausgesagt Fokussierposition und roten Diamanten zeigen, Resonanzfrequenz, wie durch die maximale Intensität bestimmt.g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Automatische Trennung

HINWEIS: Der automatisierte Trennung Experiment wird ausgeführt, um große Partikel aus kleinen Teilchen aufgrund der in der mikrofluidischen Chip aufgebracht größenabhängigen akustischen Fokussiervorrichtung Kräfte trennen. Die erforderlichen Systemkomponenten werden in der Materialliste zusammengefasst.

  1. Systemkonfiguration und Probenvorbereitung
    1. Verbinden des mikrofluidischen Chips, die Spritzenpumpe, computergesteuerten Multiport-Auswahlventile, PC-Schnittstelle Durchflussmesser, und Schläuche, wie in Abbildung 4 dargestellt. Diese Konfiguration ermöglicht eine automatisierte Verarbeitung von Proben durch die Mikrofluidik-Trenn Chip, sowie automatisierte Reinigungsschritte zwischen den Experimenten Kreuzkontamination und Probenverschleppung zu entfernen.
    2. Verwenden einen Probenpuffer für die Zellen oder Partikel zu trennen, oder, wie durch die Analyse Assay erforderlichenach der Trennung verwendet werden. Wie in Schritt 4.3.2 muss das Wiederherstellungspuffer (aber nicht unbedingt die Bypass-Fluid) der Probenflüssigkeit entspricht.
      Hinweis: alle wäßrigen Puffer typischerweise bei biologischen Proben (zB PBS) verwendeten wasserähnlichen akustischen Eigenschaften und nicht merklich die Leistung der akustischen Vorrichtung zu ändern. Die Verwendung von Probenflüssigkeiten mit Dichte und Viskosität signifikant von Wasser möglich, sondern nur für die Betreiber mit beträchtlicher Erfahrung acoustophoresis empfohlen.


Figur 4
Abbildung 4. Acoustic System-Konfiguration für die automatische Trennung Experimente. Die blauen Linien zeichnen die Hauptströmungspfad durch das System. Alle grünen und schwarzen Linien sind 0,03 "Innendurchmesser (ID) Schläuche und alle blau und grau-farbige Linien sind 0,01" ID Schlauch, mit dem exception der Haltespulen, die 0,03 sind "ID und den Durchflussbegrenzer, die 0.006 sind" ID. Die Spritzen werden mit Puffer gefüllt ist, und die Haltespulen ausreichendes Volumen (550 ul), um die Aufnahme aller Proben oder Reinigungs Reagenzien in die Spritzen zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Trennverfahren
    1. Pre-Laufzustand. Vor dem Ausführen der Trennung, sicherzustellen, dass die Reinigungsreagenziengefäßen (Bleichmittel, Ethanol, Puffer) ausreichend Flüssigkeit, sind die Abfallreservoirs nicht voll, und die Fluidleitungen sind grundiert (dh mit Lösung gefüllt). Wenn die letztgenannte Bedingung ist ungewiss, oder wenn das System zum ersten Mal nach Leerlauf laufen (zum Beispiel das erste Mal an einem bestimmten Tag), führen Sie eine automatisierte Reinigungsverfahren (siehe Schritt 5.3 unten). Stellen Ventile 3 und 4 an den Chip-Outlets zu fließen, um rese verschwendenrvoirs zunächst.
    2. Schalten Sie den Lüfter, und stellen Sie den Funktionsgenerator mit der Resonanzfrequenz für die akustische Chip verwendet wird, wie in Schritt 4.5 festgelegt. Stellen Sie die Spannungssollwert auf den Funktionsgenerator so dass die HF-Verstärkerausgänge zwischen 12 und 25 V pp, wie für die gewünschte Trennung geeignet.
    3. Schließen Sie die Probeneingangs Vial, Puffereingangs Vial und geeignete Sammelfläschchen auf das System. Kurz vor dem Anbringen der Probeneingangs Vial seinen Pickup Tubing, Wirbel das Fläschchen kurz, um erneut zu suspendieren, die keine Partikel abgelagert haben. Befestigen Sie dann die Durchstechflasche und die Trennung Routine zu initiieren, ohne Verzögerung.
      ACHTUNG: Wenn die Probe zu verarbeitenden enthält potenziell infektiöse Agenzien, sollten die Durchstechflaschen mit einer Schraube-Top-Typ sein, um einen abgedichteten System aufrecht zu erhalten und zu verhindern, Proben Vernebelung. Darüber hinaus bei der Arbeit mit biologischen Gefahrenstoffen, behandeln alle Fläschchen und Schlauch beim Tragen der erforderlichen Schutzausrüstung und unter Verwendung des erfuired Gefahren Kontrollen und Verfahren für das biologische Risikogruppe und der biologischen Sicherheitsstufe angemessen, das Material. Wenden institutionellen Richtlinien und Protokolle im Falle von Unsicherheit.
    4. Verwenden Sie ein Programm in einer Laborautomation Toolkit, um die Ventile zu steuern, Durchflusssensoren und Pumpe für die Durchführung der vollautomatische Trennung Routine.
      HINWEIS: Die Routine schaltet die Ventile betätigt Spritzenpumpe Entnahme und Infusion, und überwacht fließen Sensordaten für die korrekte Timing der Sammlung von Ausgangsprobenfraktionen. Die wichtigsten Schritte sind nachstehend in 5.2.4.1 bis 5.2.4.3 zusammengefasst, als von Hand.
      1. Prime das Aufnahmerohr. Zurückzuziehen etwa 15 & mgr; l aus dem Probeneingang Vial, um das Rohr zu Ventil 1. Verbinden sie ihn gleichzeitig vollständig zu füllen, Prime Der Verbindungsschlauch Puffereingangs Vial zum Ventil 2. In ähnlicher Weise, prime der Lufteinlass des Ventils 1, um sicherzustellen, dass es enthält keine Flüssigkeit. Schließlich Schaltventile 1 und 2 zu vertreiben, um alle Abfälleüberschüssige Flüssigkeit oder Luft, die die Ladespule eingegeben wurde.
      2. Laden Sie die Probenspule, wie in 5a gezeigt. Eine typische Ladesequenz für die Verarbeitung eines 250-ul-Probe ist bis 25 & mgr; l Luft bei 50 ul / min, dann wurden 250 ul der Probe bei 200 & mgr; l / min, gefolgt von 35 ul zu führen Puffer bei 200 ul / min und schließlich zurückzuziehen Weitere 25 & mgr; l Luft bei 50 ul / min.
        HINWEIS: Alle Volumina und Durchflussmengen sind frei wählbar. Beachten Sie, dass diese Ladesequenz in umgekehrter Reihenfolge wie die Fluidstecker wird durch die Trennvorrichtung zu strömen.
      3. Beginnen Probe Infusion. Stellen Sie die Spritzenpumpen, um die geladenen Fluidstecker mit der gewünschten Geschwindigkeit (typischerweise 100 & mgr; l / min) ziehen lassen. Überwachung der Strömungsgeschwindigkeiten im SPO LPO mit Durchflusssensoren, um sicherzustellen, dass der Fluss stabil und mit der in Schritt 4.1 bestimmten Verhältnis, und das Verstopfen nicht aufgetreten ist.
      4. Sammeln Sie einzelne Fraktionen. Wenn die Durchflusssensoren erkennen eine Spitze in der Durchflussrate, was darauf hinweist paTe le gram m des ersten Luftspalt, schalten Sie den entsprechenden Ausgangsventil aus Abfällen zu einer Probensammelgefäß (wo es in Schritt 5.2.1 gestartet).
      5. Nach dem Durchgang der Probe aus dem Chip, beachten Sie bitte die Durchflusssensor erfassen den zweiten Luftspalt. An diesem Punkt, fallen die Ausgangsventile zurück zu verschwenden. Nachdem das volle Volumen aus Schritt 5.2.4.2 geladen abgegeben wird, stoppen Sie die Spritzenpumpe Infusion und beenden Sie die Automation-Routine, wenn die Durchflussrate Null erreicht.
    5. Nach der Trennung Experiment abgeschlossen ist, trennen Sie die SPO und LPO Probensammelfläschchen und speichern sie in geeigneter Weise für die spätere Analyse.
  2. Maschinelle Reinigung und Dekontamination
    HINWEIS: Vor der Verarbeitung jeder Probe, spülen und dekontaminieren die gesamte Fluidsystems unter Verwendung des folgenden automatisierten Routine.
    1. Sichern Sie die SPO und LPO Sammelgefäß Rohre sowie die Probenaufnahmeröhre in leere Phiolen, um überschüssige Reinigungslösungen, die throu gespült werden sammelngh der Rohre.
    2. Starten Sie das automatisierte System Reinigung Routine. Wie bei der automatisierten Trennverfahren in der Stufe 5.2, das Programm sollte die Ventile und Spritzenpumpe zu steuern, um nacheinander laden Sie die Haltespule mit Reinigungs Reagenzien und spülen Sie diese durch das System.
    3. Führen Sie das folgende Reinigungsablauf: bündig mit 10% Bleichmittel, dann mit 70% Ethanol, und am Ende mit Wasser oder einem geeigneten Salzpuffer (zB 1x PBS oder Puffer zur Probenverarbeitung verwendet werden). Verwenden Sie die folgenden Spülmengen: 450 & mgr; l für Bleichmittel und Ethanol und 1,000 & mgr; l für Wasser / Puffer.
    4. Beim Spülen Schritte, spülen Sie jedes Reagenz in die SPO während die LPO Auslassventil zu einem Hafen, der blockiert ist gesetzt, so wird umgekehrt, um mögliche Verstopfungen in den Austritts Durchflussbegrenzer zu entfernen. Pflegen Rückzug und Infusionsdurchflussraten von 300 bis 500 & mgr; l / min, um Blasenbildung in der Rohrleitung und Gegendruckaufbau zu minimieren, wenn entweder der SPO oder der LPO blockiert.
    5. DiscaRd Die überschüssige Spülung Lösungen und die Fläschchen in dem sie durch folgende geeignete Verfahren für den Umgang mit biologischen oder chemischen Abfällen gesammelt.

Representative Results

Schlüsselmerkmale des akustischen mikrofluidischen Vorrichtungskonstruktion sind in Abbildung 1 15 markiert ist, und an anderer Stelle beschrieben ist. Kurz gesagt, zwei Fluidströme Strömungsseite-an-Seite in einen Trennkanal, von einem parallelen Bypasskanal von einer dünnen Siliziumwand getrennt. Da die primäre Strahlungskraft Magnitudenskalen mit Partikelvolumen wandern große Partikel aus der Mischprobe Eingangsstroms in Richtung auf die Schalldruckknoten in den benachbarten Rückgewinnungsfluidstrom entfernt, während die kleinen Teilchen in der Ausgangsstrom (1B, C) ​​zu bleiben. Die unterteilten Zweikanal-Architektur verbessert Partikeltrennung 17 und ermöglicht die Einstellung der Knotenposition durch die Verwendung unterschiedlicher Bypasskanal Flüssigkeiten. 16 Die fluidischen Steckbrett und Armaturen bietet eine robuste Plattform für die Welt, um Verbindungen Chip und der modulare Aufbau ermöglicht einen schnellen Wechsel zwischen fluidischen Chips (Abbildung 2). Dies cONFIGURATION ermöglicht ebenfalls reversible Fluidverbindungen, die Dichtung bis zu 1000 psi, um schnell und zuverlässig (2B, E) hergestellt werden.

Die Resonanzfrequenz f res eines Chips mit einfachen 1D analytischen Berechnungen geschätzt werden (siehe Schritt 1.1.1). Aus einer vollständigeren 2D Finite-Elemente-Modells der Vorrichtung im Querschnitt, 16 die erwartete Brennpunktposition für 2-Knoten-Resonanz 225 um von der Wand und der erwarteten Frequenz 1,68 MHz. Jedoch kann f res reale Geräte von ± 100 kHz variieren, abhängig von der Betriebstemperatur und Kopplung der Längs- und Querresonanzen. Deshalb wird nach Gerätemontage, f res muss empirisch relevanten Flussraten und Piezo-Antriebsspannungen überprüft werden, wie in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. 3 zeigt repräsentative Frequenz-Scans bei 200 & mgr; l / min aufgenommen, mit Wasser in den Haupt- und Bypasskanäle und 20 V pp zugeführt, um das piezo. Beim Koppeln zwischen dem piezo und Mikrofluidik-Vorrichtung gut ist, wird Partikel dicht bei der Resonanzfrequenz zu konzentrieren, was zu einem klaren Peak in der Fluoreszenzintensität und Migration auf die erwartete Brennpunktposition (3A). Im Gegensatz dazu, wenn es schlechte Kopplung Teilchen nicht gut konzentrieren, und die Frequenz-Scan-Ergebnisse ähnlich auf 3B werden. Bei derartigen Vorrichtungen muss der Piezo-Wandler erneut montiert werden kann, wenn eine reversible Klebstoff verwendet wurde; Ansonsten ist diese Vorrichtung ungeeignet, wenn hochwertige Fokussierung oder schnelle Strömung kritisch für die gewünschte Anwendung geeignet sind. Die Daten in Abbildung 3 informiert die Wahl der Betriebsfrequenz für nachfolgende Experimente und die Spannungs- und Strombereich für eine effiziente Partikel Trennung zur Verfügung.

Dateien / ftp_upload / 53.051 / 53051fig5.jpg "/>
Abbildung 5. Automatisierte Probenverarbeitung. (A) Schematische Darstellung der Probe in der Probenspule geladen. (B) Repräsentative Strömungsprofil für eine erfolgreiche Trennung Experiment. (C) Durchflussprofil von einer Trennung führen, während der der SPO Auslass an etwa 220 sec verstopft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nach dem Identifizieren Chips, die wirksam Separatoren sind, werden sie in der in Figur 4 dargestellten Systems integriert. Gesamtsystem Hubvolumen durch Verwendung Rohr mit 0,01 "Innendurchmesser entlang der Hauptströmungspfad minimiert (blaue Linie). 5A zeigt das Make-up einer typischen Probe Stecker durch das System infundiert. Eine kleine Menge von "führende Puffer" (~ 35 & mgr; l) ist erforderlich, um Precede die Probe in dem Fluss zu Stromschwankungen zu beseitigen, während die Probe durch die Trenn Chip bewegt. 5B zeigt Flussdaten von einer erfolgreichen automatischen akustische Trennung Experiment ergibt. Hauptmerkmale einer erfolgreichen Lauf umfassen: (1) ein vorübergehender Anstieg der Strömungsgeschwindigkeit sowohl in der LPO und SPO als Druck aufbaut und Flüssigkeit beginnt, durch das System fließen, (2) eine scharfe Spitze, die den Durchgang einer Luftblase (die Einschub zeigt ein erweitertes Profil einer einzelnen Blase), die die SPÖ vor dem LPO erreichen sollte aufgrund der ungleichen Fluss aus den beiden Auslässen, (3) stabile Strömung durch beide Auslässe zwischen den beiden Luftblasen wie die Probe bewegt sich durch das System, und (4) eine stufenweise Verringerung der Fließgeschwindigkeit in beiden Auslässen, nachdem die volle Probenvolumen wird dem System zugeführt. Problematisch Läufe von Strömungsprofilen ähnlich 5C, wo es scheint, dass die SPO wurde nach etwa 220 Sekunden verstopft Abbildung sofort ersichtlich. In thi s Fall wird ein Reinigungsverfahren ähnlich wie in Schritt 5.3 beschrieben ausgeführt werden soll, um den Kanal zu reinigen.

Figur 6
Abbildung 6. Vorrichtung Abstimmbarkeit: Teilchengröße und Spannungseffekte. Prozent Polystyrol-Mikrokügelchen in der LPO extrahiert, hängt von der Partikelgröße und Spannung an das piezokeramische geliefert. Jede Zeile entspricht einer anderen Betriebsspannung bei der Resonanzfrequenz, bestimmt, wie in Schritt 4. Gesamtdurchsatz durch die Vorrichtung beschrieben wird, ist 200 & mgr; l / min, mit der angelegten Antriebs Frequenzen zwischen 1,62 und 1,64 MHz. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von mindestens drei getrennten Experimenten. Reproduziert und mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry aus http://pubs.rsc.org / en / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j modifiziert.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6 zeigt die zusammenTrennErgebnisse unter Verwendung verschiedener Polystyrolpartikelgrößen und Piezotreiberspannungen, die die Betriebsparameter für eine wirksame Trennung notwendig zu demonstrieren. Im allgemeinen werden höhere Spannungen (dh mehr akustische Kräfte) erforderlich, um kleinere Teilchen zu extrahieren, wie erwartet. Antriebsspannungen kann nicht unbegrenzt erhöht werden, jedoch aufgrund der größeren Wärmeableitung und zunehmender Wirkung von akustischen Streaming. 13 Das Grundstück dient als allgemeine Richtlinie zur Partikelabscheidung-Partikelgrößen, die deutlich unterschiedliche Recovery zu einem bestimmten Steuerspannung (zB 10- zeigen und 2-um-Teilchen bei 8,8 V pp) wird gut trennen. Allgemeiner Partikelpopulationen mit einem großen Grßenunterschied wie Viren (~ 100 nm) und Zellen (~ 10 & mgr; m) kann schnell und wirksam getrennt werden, wie auch Zellen diffErent Größen (beispielsweise 6-8 & mgr; m scheibenförmigen Erythrozyten und 8-15 & mgr; m Leukozyten). Die erforderlich ist, um mit anderen Zelltypen funktionieren spezifischen Bedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Zellform, Dichte und Kompressibilität auswirken seiner akustischen Kontrast zusätzlich zu Zellgröße. Zu diesem Zweck sind die Verfahren in Schritt 4 zur Bestimmung verwendbaren Trennbedingungen für jede neue Zelle oder Partikeltyp und nicht nur für die Beurteilung der Qualität einer bestimmten acoustophoresis Gerät.

Figur 7
Abbildung 7. Trennleistung der Handy-Virus dotierter Proben. Die Trennung resultiert aus (A) Raji-Zellen mit Dengue-Virus (DENV) und (B) Raji-Zellen und Boa Nierenzellen mit Golden Gate Virus (GGV) versetzt versetzt. Prozentsätze werden gesammelt als die Fraktion von Viren oder Zellen zum Beenden eines bestimmten definiertenAuslass im Vergleich zu der Gesamtmenge Verlassen des Chips. Die Fehlerbalken für (A) sind die Standardabweichung von 3 Versuchen, während die Proben (B) wurden nur einmal wegen der geringen Mengen verarbeitet. 1x PBS wurde als Probenpuffer und Wiederherstellungsflüssigkeit in den Bypass-Kanal für alle Experimente verwendet wird, mit Wasser. Chip-Betriebsfrequenzen lagen zwischen 1,60 und 1,64 MHz, mit Antriebsspannungen zwischen 16 und 20 V pp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Um die Nützlichkeit dieser Plattform für biologische Partikeltrennung zu demonstrieren, haben wir zum ersten Mal verwendet es, um gut charakterisierte biologische Proben zu verarbeiten: menschliche Raji-Zellen (10 5 Zellen / ml, mittlerer Durchmesser 8-10 & mgr; m 25), versetzt mit Dengue-Virus (DENV, 10 5 pfu / ml, ungefähren Durchmesser 50 nm 26). Abbildung 7A zeigt den Prozentsatz an Raji Zellen und DENV sowohl im SPO LPO gesammelt (definiert als Anteil der jede Teilchenart aus jedem Auslass im Vergleich zu der Gesamtmenge von jedem von dem Chip gesammelt Teilchen gesammelt). Das Experiment wurde dreifach wiederholt, und Raji-Zellen wurden unter Verwendung eines Coulter-Zählers quantifiziert, während DENV wurde unter Verwendung einer Umkehrtranskriptions quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) quantifiziert.

Als nächstes wurde die Leistungsfähigkeit des Systems in einem Szenario, die realistischer für die Verarbeitung von klinischen Proben, in denen die exakte physikalische Eigenschaften der Partikel kann unbekannt sein wird geprüft, und die verfügbaren Probenmengen geringer sind. Hier untersuchten wir die Trennung des kürzlich identifizierten golden gate-Virus (GGV), eine Schlange Erreger infizieren Boa constrictor Nierenzellen. 27 Die Größe der GGV Viruspartikel noch nicht gemessen worden, aber da GGV gehört zur Familie Arenaviridae, es wahrscheinlich von einemähnlicher Größe zwischen 100 und 150 nm. 28. Wir verarbeiteten Proben mit GGV in Raji menschlichen Zellen (keine Infektion Ziel für das virus) und boa Nierenzellen (Infektion Ziel GGV ungefähren Größe 10 Spike (10 4 pfu / ml) & mgr; m 27), wobei beide Zellarten bei 10 4 Zellen / ml. Da diese Proben in geringen Mengen waren, sind Trennergebnisse aus nur einer Versuchsreihe in dieser Arbeit berichtet. 7B zeigt den Prozentsatz der Raji-Zellen, Boa Zellen und GGV von der SPO und LPO gesammelt. Zellen wurden in diesen Experimenten durch Zählen auf einem Hämozytometer quantifiziert und Viren wurden durch RT-qPCR quantifiziert.

Discussion

Dieses Protokoll stellt die System-Level-Integration von mikrofluidischen Vorrichtungen zur Makroskala Ausrüstung, automatisierte biologische Probe Verarbeitung durchzuführen. Die Modularität dieser Plattform ermöglicht es, anpassungsfähig an jede Durchflussvorrichtung sein, und als Beispiel wird der Fokus der dargestellten Protokoll auf die Charakterisierung und Optimierung der Leistung einer acoustofluidic Partikeltrennvorrichtung. Drei wesentliche Vorteile dieses Protokolls werden hervorgehoben: (i) Modularität und Span-zu-Welt Anbindung, (ii) robuste Charakterisierung der Geräteleistung, und (iii) die automatisierte Verarbeitung von genau dosierten Probenvolumina zur Partikelabscheidung.

ich. Modularität und Span-zu-Welt Schnittstelle

Wie in Abbildung 2 dargestellt, ist der Mikrofluid-Chip auf einem kundenspezifischen Steckbrett, leicht auf einen Mikroskoptisch für die direkte Beobachtung passen montiert. Das Steckbrett enthält # 6-40 UNF Gewindebohrungen auf einem 5 mm-Pitch-Gitter, enabling der Chip befestigt ist, und Fluidverbindungen vorgenommen werden. Die Fluidanschlüsse sind Rohre mit bearbeiteten Enden, PEEK, die Abdichtung gegen die Fluidik-Chip mit einem Gummi-Gesicht-Dichtung und einem Edelstahl-Halsband. Diese Schnittstelle Schema sorgt für eine einfache und schnelle Chip-Ersatzgerät Redesign, erfordern einige oder gar keine Änderungen an anderen Systemkomponenten, sofern Chip Fußabdrücke an das Netz-Format entsprechen. Beispielsweise haben wir diese Plattform mit mikrofluidischen Chips für Durchfluss-Elektrophorese thermische Zelllyse 29 schnellen Vermischung der Reagenzien für die chemische Synthese, und Einzelzellen-Abscheidung und die Abfrage benutzt.

ich ich. Robuste Charakterisierung der Leistung der Vorrichtung

Um die Leistung jeder Mikrofluidik-Trennvorrichtung zu optimieren, müssen ihren Betrieb zunächst gründlich charakterisiert werden. Das hier beschriebene System unterstützt die Entwicklung von schnellen und automatisierten Protokollen, dies zu tun. Zum spezifischen Blutzuckerwerle der akustischen Fokussierungseinrichtungen, der Fokussierungsqualität, Betriebsfrequenz, und die Position der fokussierten Teilchen in dem mikrofluidischen Kanal muss für jede einzelne Vorrichtung bestimmt werden. Diese Messungen erfordern fegt durch eine Reihe von piezokeramischen Antriebsfrequenzen, Spannungen und Durchflussraten, um die optimalen Parameterkombinationen für hochwertige Trennung zu identifizieren. Die dargestellte Protokoll automatisch variiert diese abstimmbare Parameter und nimmt den entsprechenden Daten- dh Fluoreszenzbilder von Teilchen in den Kanal strömt, die nachbearbeitet, um die erforderlichen Messungen der Partikelfokussierungsqualität, Frequenz und Position (3) zu erzeugen.

Vollständige Charakterisierung der akustischen Leistung der Vorrichtung erfordert Wiederholung der Schritte 4.4 und 4.5, wie unter verschiedenen Versuchsbedingungen notwendig. Zum Beispiel ist der absolute Fokusposition eines Chips, indem Sie den Frequenz-Scan bei relativ niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten und hohe Spannung gefundens, um die vollständige Migration auf die Knotenstandort zu gewährleisten. Zusätzlich kann eine solche Frequenzabtastungen die Qualität der Vorrichtungsanordnung (bei Verwendung mit Polystyrolkügelchen bekannter Größe ausgeführt wird) zu beurteilen oder zu bestimmen, wie eine zuvor unbekannte Teilchensorte im System verhalten (nachdem ein Chip mit Perlen untersucht). Ein Chip mit einer guten Energietransfer von der Piezokeramik an den mikrofluidischen Kanal wird in engen Fokussierung bei hohen Flussraten (> 1 ml / min) und Niederspannung (12-15 V pp) zur Folge haben, während diejenigen mit schlechten Energieübertragung werden nicht einmal zu konzentrieren bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten (<100 & mgr; l / min) und hohen Spannungen (> 20 V pp). Wir haben gefunden, dass ein enger Kontakt zwischen der Mikrofluid-Chip und der Piezokeramik ist kritisch für eine effiziente Energieübertragung in die Flüssigkeit. Weitere Untersuchungen der optimalen Verfahren zum Verbinden der Mikrofluid-Chip und der Piezokeramik wird zuverlässige Produktion von High-Performance-Geräte ermöglichen.

Schließlich eine vollständigeBild der Betrieb eines acoustophoretic Gerätes kann durch die Kombination der bildbasierten Frequenz-Scan Messungen der Stufe 4 (und Abbildung 3) mit Partikelzählungen von der SPO und LPO als Funktionen der relevanten Betriebsparameter gesammelt, erhalten werden kann, von mit Mikrokügelchen durchgeführt Trennversuche wird, wie in Schritt 5. Wie in Figur 6 gezeigt ist, beschrieben, kann eine solche Reihe von automatisierten Experimente schnellen Charakterisierung Leistung und Abstimmbarkeit eines einzelnen Gerätes, Informieren des Benutzers über die optimale Parameterraum, die Vorrichtung zur Partikelabscheidung zu betreiben.

iii. Automatisiertes Kleinprobenaufbereitung zur Partikelabscheidung

Für eine erfolgreiche und genaue Mikrofluid-Chip-basierte Probenverarbeitung, ist es wichtig, sicher und präzise meter, Last, zu liefern, zu sammeln und die Volumina der Flüssigkeit, während sie passieren. Diese Genauigkeit ist besonders wichtig, wenn das Probenvolumen klein ist(~ 0,1-1 ml), die in der klinischen oder Forschungslabor Einstellungen gemeinsam ist. 30 Präzise Probenhandling ist eine Herausforderung in traditionellen mikrofluidischen Experimente, die manuelle Rücknahme der Probe in einer Spritze und Infusion in einem Gerät ohne Feedback der bei der Probe zu beschäftigen wurde abgetrennt und, wenn es gesammelt werden sollten. Das vorgestellte Protokoll beschäftigt automatisierte Probenspule Laden und Abgeben gekoppelt mit Echtzeit-Feedback von Durchflusssensoren, um reproduzierbare Trennungen von kleinen Probenvolumina zu ermöglichen.

Abbildung 5 zeigt die Strömungsprofile, gemessen an der SPO und LPO aus einer typischen Trenn Experiment. Zuerst führt Puffer von mindestens 35 & mgr; l geladen, um eine stabile Strömung zu gewährleisten, bevor die Probe das akustische Chip erreicht. Probenvolumina von weniger als 100 & mgr; l werden für diese Systemkonfiguration zu empfehlen, da die Probenverdünnung aufgrund der führenden Puffer zu groß wird. Ein Stecker der Luft zu Beginn des th verwendete Injektion vor der Vorderpuffer, um die Probe Stecker aus der folgenden Beschreibung wird verhindert Vermischung und Verdünnung der Probe und als Indikator für die Durchflusssensoren dienen Flüssigkeit zu trennen. Nach einer ersten transienten als Flüssigkeit beginnt, durch das System bewegen, scharf spitze Signale in beiden Filialen zeigen den Durchgang der ersten Luftblase. Diese Transienten werden durch einen langen Zeitraum stabile Strömung folgen, während die Probe fließt durch das System dann eine andere Spitze, wenn die zweite Luftblase durchläuft und schließlich eine eventuelle Verringerung der Strömungsrate auf Null, nachdem die Spritzenpumpe stoppt.

Der Durchgang der Luft-Stecker durch die Durchflusssensoren wird als Triggerpunkte verwendet werden, um die Ventile zu schalten zum Starten und Stoppen Probensammlung und minimiert so verlorenen Probe und Verdünnung durch nicht-Probenflüssigkeitsvolumina. Closed-Loop-Dosierung von Probenvolumina verarbeitet beseitigt die Notwendigkeit, vor dem Beginn des Experiments jedesmal, wenn die Eingangsabtastung geändert umprogrammieren diese Werte. Diese Funktion istbesonders wichtig, wenn Probenvolumen ist begrenzt, beispielsweise im Fall von vielen klinischen Proben. Echtzeit-Durchflussüberwachung hilft auch bei der Fehlersuche; eine schlechte Lauf (beispielsweise eine Verstopfung bildet in einem der Ausgänge) ist unmittelbar ersichtlich aus den resultierenden Strömungsprofile, wie in 5b.

Um die Flexibilität und Effizienz der acoustofluidic Trennung unter Verwendung des dargestellten Systemarchitektur gereinigt DENV und GGV Virusstämme zu demonstrieren, wurden in Zellvorräte durch den mikrofluidischen Chip versetzt, und durch die Verarbeitung getrennt. 7a zeigt, daß Raji-Zellen wurden gut getrennt von Viren, wie 97 % der Raji-Zellen Verlassen des Chips wurde gefunden, dass in der LPO werden, wodurch eine hoch angereicherte Probe DENV im SPO verlassen. Im Vergleich dazu war die Effizienz der DENV Trennung unteren, mit 70% der DENV Verlassen der Chip in der SPO gefunden. Dies kann zu einer leichten Konvektionsmischung durch die Windungen des separati induzierte zurückzuführenauf dem Kanal, aber eher zu einigen DENV Partikel migrieren mit den Raji-Zellen in das LPO. Zellen seitlich Migration über Stromlinien ziehen etwas Flüssigkeit mit ihnen, auch bei niedrigen Reynolds-Zahl. Durch diesen Mechanismus sowie unspezifische Oberflächenadsorption übertragen Viruspartikeln in das LPO. Dennoch ist das hoch angereicherte Probe DENV im SPO ein bedeutender Vorteil, beispielsweise wenn die de novo-Sequenzierung wird verwendet, um zu erkennen und zu identifizieren Viren.

7B zeigt, daß in einer Testreihe werden nur etwa 70% der Zellen Boa Verlassen des Chips wurden passgenau in der LPO gefunden, verglichen mit fast 100% Abscheidegrad für Raji-Zellen. Der Unterschied in der Trennleistung zwischen den beiden Zelltypen die auf eine kleinere mittlere Größe oder eine geringere Dichte an Boa Zellen im Vergleich zu Raji-Zellen, was daher zu kleineren akustische Kräfte. Um zu bestätigen oder zu widerlegen diese Vermutungen, die Größe, Dichte und Morphologie der BoaZellen in Suspension (das normalerweise wachsen haft) Boa Zellen muß genau gemessen werden, ein Aufwand für weitere Untersuchungen. In den gleichen Experimenten, ähnlich wie bei den Versuchen mit DENV, der Hauptteil der gewonnenen GGV verlassen vom SPO, was eine Anreicherung der Virusfraktion.

Die dargestellten Daten unterstreichen die inhärenten Herausforderungen der Technik breit anwendbar Plattformen für die Verarbeitung einer Vielzahl von biologischen Proben. Wichtig ist, dass die biologischen Interaktionen beginnen, eine ebenso große Rolle wie die physikalischen und mechanischen Effekte spielen. Allerdings sind diese Vorversuche auch die Kraft und die Verheißung der Verwendung dieser Systemarchitektur für die Probenverarbeitung in der klinischen und Forschungsanwendungen zu demonstrieren. Als robust, gut charakterisiertes System entwickelt, bietet diese Plattform die Möglichkeit, Antworten auf neue wissenschaftliche Fragen zu suchen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39 (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17 (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14 (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35 (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14 (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21 (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10 (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85 (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86 (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139 (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. , 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15 (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. , 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36 (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. , CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4 (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5 (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12 (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89 (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3 (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3 (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15 (1), 31-37 (2004).

Tags

Bioengineering Heft 105 Mikrofluidik Lab on a Chip Zelltrennung acoustophoresis Laborautomation Mikrofabrikation MEMS LabVIEW
Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton,More

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., Metz, T. R., Shusteff, M. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter