Summary
מנגנון אישית מעוצב MRI תואם מבוסס לייזר חימום פותח כדי לספק חימום מקומי של גידולים תת עורית כדי להפעיל שחרורו של סוכנים מיפוזומים thermosensitive במיוחד באזור הגידול.
Abstract
ליפוזומים כבר מועסקים כמערכות אספקת הסמים למקד גידולים מוצקים באמצעות ניצול של החדירות המשופרות והשפעת ההחזקה (EPR) וכתוצאה מכך ירידה משמעותית ברעילות מערכתית. עם זאת, שחרור מספק של תרופה במארז מיפוזומים מוגבל היעילות הקלינית שלהם. ליפוזומים טמפרטורה רגישה שתוכננו כדי לספק שחרור אתר ספציפי של תרופה על מנת להתגבר על הבעיה של זמינות ביולוגית תרופת גידול מוגבל. המעבדה שלנו עיצבה ופיתחה נוסחא המופעל חום thermosensitive liposome של ציספלטין (CDDP), הידוע בשם HTLC, לספק שחרור מאולץ של CDDP בגידולים מוצקים. משלוח מופעל חום in vivo הושג במודלים עכברי באמצעות מנגנון חימום מבוסס לייזר שהותקן שמספק תבנית חימום קונפורמי באתר הגידול כפי שאושר על ידי thermometry MR (MRT). מכשיר ניטור טמפרטורת סיבים אופטי שימש למדידת הטמפרטורה בזמן אמתבמהלך כל תקופת החימום עם התאמה מקוונת של משלוח חום לסירוגין כוח הלייזר. משלוח סמים היה מותאם בתהודה מגנטית הדרכת תמונה (MR) על ידי שיתוף אנקפסולציה סוכן MR ניגוד (כלומר, gadoteridol) יחד עם CDDP של ליפוזומים thermosensitive כאמצעי כדי לאמת את פרוטוקול החימום ולהעריך הצטברות גידול. פרוטוקול החימום מורכב מתקופת חימום מוקדם של 5 דקות לפני הממשל של HTLC ולאחר הזרקת חימום 20 דקות. פרוטוקול חימום זה הביא לשחרור יעיל של הסוכנים במארז עם שינוי אות MR הגבוה ביותר נצפה בגידול המחומם בהשוואה לגידול והשרירים מוסקים. מחקר זה הוכיח את היישום המוצלח של המנגנון מבוסס לייזר החימום לפיתוח liposome thermosensitive פרה-קליני ואת החשיבות של אימות מודרכת-MR של פרוטוקול החימום לאופטימיזציה של אספקת סמים.
Introduction
הפתופיזיולוגיה של תוצאות גידולים מוצקות בחדירות המשופרות ושימור (EPR) של מערכות ננו. זה הוביל לפיתוח של מערכות אספקת סמים רבות המנצלות את האפקט הזה כדי למקד את רקמת הגידול, תוך מזעור תופעות לוואי מערכתי 1. טכנולוגיות משלוח liposomal נחקרו באופן נרחב לבדיקות סמים או הדמיה 2. למרות יפוזומים צמצמו באופן משמעותי את הרעילות המערכתית בהשוואה לכימותרפיה קונבנציונלית, היו מעט שיפורים ב3,4 יעילות הקליני. מחקרים הראו כי היעילות המוגבלת בשל מחסור בשחרור תרופה מהספק 4,5. כתוצאה מכך, פיתוח יפוזומים שמופעלים כדי לשחרר את התרופה במארז בתגובה לגירויים חיצוניים משך תשומת לב רבה. היפרתרמיה הועסקה במשך עשרות שנים כשיטת טיפול בטוחה יחסית לחולי סרטן 6. לכן לפתחment של יפוזומים thermosensitive עם חום כטריגר חיצוני היה שילוב הגיוני עם פוטנציאל משמעותי לתרגום קליני. ואכן, הניסוח המכיל lysolipid thermosensitive liposome של דוקסורוביצין, הידוע בשם LTSL-DOX, הגיע עכשיו הערכה קלינית 7.
נתונים קליניים אחרונים עם LTSL-DOX הוכיחו כי הפרוטוקול למסירת חום הוא גורם קריטי שיכולה להשפיע במידה רבה את תוצאות מטופל 8. בבני אדם, מתמרים בתדר רדיו, מיקרוגל, לייזר ואולטרסאונד משמשים ליישם היפרתרמיה מקומית באתרי גידול 9. במחקרים פרה-קליניים הדורשים חימום של גידולים תת עורית, צנתרים חימום 10,11 ואמבטיות מים 12,13 מועסקים לרוב. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה חדשה לחימום גידולים תת עורית באמצעות התקנה מותאמת אישית שנועדה מבוסס לייזר חימום, המאפשרת חימום קונפורמי יותר של נפח הגידול. באמצעות ma התואם MRterials, ההתקנה היא קטנה מספיק כדי להתאים בתוך נשא של תרמי MR בעלי החיים קטן, המאפשר ניטור בזמן אמת של שינויים בטמפרטורת רקמות במהלך חימום הלייזר.
חומר ניגוד MR, gadoteridol (ה '-HP-DO3A), היה שותף במארז עם CDDP לניסוח liposome thermosensitive של CDDP (HTLC), הידוע בשם-HTLC, בזמן אמת MR דימוי מודרך ניטור והערכה של חום שחרור -activated סמים ואימות של פרוטוקול החימום. התוצאות שלנו מראות כי מנגנון החימום מבוסס הלייזר ביעילות הפעיל את שחרורם של סוכנים במארז מניסוח הקב"ה-HTLC בעוד במעקב באמצעות ההדמיה MR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Liposome
- ממיסים את השומנים 1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-stearoyl-2-הידרוקסי SN -glycero-3-phosphatidylcholine (MSPC או S-lyso-PC) ו- N - (carbonyl- methoxypolyethyleneglycol 2000) -1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine (-DSPE MPEG 2000) בכלורופורם. לדוגמא, להכנת 10 מיליליטר של HTLC, לשקול את 314.4 מ"ג DPPC, 39.4 MSPC מ"ג, ו83.9 מ"ג MPEG 2,000 -DSPE לבקבוקון זכוכית ענבר. לאחר מכן, לפזר את השומנים ב2 מיליליטר של כלורופורם ולחמם את הבקבוקון למשך 30 שניות באמבט מים C ° 60.
- הסר את כלורופורם באמצעות מאייד סיבובי. מניחים את סרט שומנים וכתוצאה מכך תחת O ואקום בלחץ גבוה / N.
- במשך 10 מיליליטר של HTLC, מימה סרט שומנים עם 5 מיליליטר חיץ 0.1N טריס (pH 7.4) במשך שעה 1. במקביל, שוקל את 162.4 מ"ג 1,2-dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphoglycerol שומנים (DPPG) ו- 100 מ"ג אבקת CDDP ומימה wה- i 5 0.1N מיליליטר חיץ טריס המכיל 30% אתנול (pH 7.4) במשך שעה 1.
- לגיבוש הקב"ה-HTLC, שוקל את אותה כמות של שומנים DPPG ואבקת CDDP 10 מ"ג, אז מימה עם 2.5 מיליליטר פתרון הקב"ה-HP-DO3A (279.3 מ"ג / מיליליטר) בתוספת 2.5 חיץ טריס מיליליטר 0.1N המכיל 30% אתנול ( pH 7.4) במשך שעה 1. במהלך לחות, התערובות חייבת להישמר בבקבוקוני ענבר והניחו על פלטה חמה על 70 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמיד וvortexing כל 10 דקות.
- מערבבים את תערובת השומנים ותערובת הסמים שומנים בדם, ומימה שוב לשעה 1. וורטקס כל דקות 15-20.
- להרכיב את מכבש 10 מ"ל עם שתי ערימות של 200 מסנני פוליקרבונט ננומטר. חבר את thermobarrel של המכבש לאמבט מים במחזור על 70 מעלות צלזיוס, ולחבר את המכבש למכל חנקן דחוס.
- מייד לאחר הוספת מים, להעביר את התערובת לתוך תא המכבש. פתח את זרימת חנקן (לחץ מוגדר 200 psi) כדי למתוח יפוזומים באמצעות ממברנות. לאסוף את liposomes בשפופרת 50 מיליליטר. שמור את הצינור באמבט מים חם (70 מעלות צלזיוס) בכל העת בתהליך שיחול. חזור על תהליך זה 5 פעמים.
- לפרק את המכבש ולשנות לשתי ערימות של 100 מסנני פוליקרבונט ננומטר. להרכיב מחדש את המכבש ולהגדיר את הלחץ עד 400 psi. חזור על שלב 5, מלבד extrude יפוזומים 10 פעמים. לאסוף את הדגימה מהחול הסופי לתוך צינור 15 מיליליטר.
- להתקרר ליפוזומים לRT, ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 3 דקות כדי לזרז CDDP מסיס.
- Dialyze יפוזומים O / N נגד מלוח 0.9% בצינורות דיאליזה עם הפסקת 15,000 מולקולרי משקל (MWCO) בתנאים סטריליים.
- לדלל 10 μl של יפוזומים ב990 μl מים מזוקקים. השתמש בפיזור אור דינאמי למדוד את התפלגות הגודל של HTLC והקב"ה-HTLC. בצע 3 מדידות עם 10 ריצות כל אחד.
- לדלל 40 μl של יפוזומים בμl 3960 מים מזוקקים. הפוך 5-6 פתרונות סטנדרטיים של פלטינה וגדוליניוםבטווח הריכוז של 0.1-20 מיקרוגרם / מיליליטר. מדוד את ריכוזי הפלטינה וגדוליניום באמצעות ספקטרומטר פליטת פלזמה אטומית בשילוב אינדוקטיבי (ICP-AES) בשעה 3 באורכי גל שונים. בצע 3 מדידות בכל אורך גל לתוצאה ממוצעת.
- לקבוע את הג'ל לטמפרטורת נוזל שלב גבישי מעבר (T מ ') של ניסוח liposome HTLC באמצעות קלורימטר סריקת ההפרש (DSC). עומס 5-10 מ"ג של HTLC לתוך מחבת DSC ולהשתמש במחבת ריקה כנקודת התייחסות. השתמש בקצב סריקה של 5 מעלות צלזיוס / דקות כבש את הטמפרטורה בין 0 ° C עד 60 ° C.
- לעטוף ליפוזומים בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה וחנות אור על 4 מעלות צלזיוס.
2. בהודעת מבחנה מיפוזומים
- הכן עמודות ספין.
- דגירה 50 חרוזים סינון ג'ל גרם מלח 400 מיליליטר 0.9% ב RT במשך 3-4 שעות. להפשיל פיסת צמר זכוכית, רטובה עם מי מלח 0.9% ולמקם אותו לתוך הקצה של מזרק 1 מיליליטר. לחץ על צמר הזכוכית למלא כ 0.05-0.1 מיליליטר של המזרק. השתמש פיפטה זכוכית להוסיף בהדרגה על 1 מיליליטר תקשורת סינון ג'ל לתוך המזרק.
- מניחים את המזרק לתוך צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 3 דקות. הסר את טור הספין ולמקם אותו לתוך צינור 15 מיליליטר.
- מדגם 400 μl של HTLC או הקב"ה-HTLC ל8 בקבוקוני זכוכית 1-DRAM ודגירה באמבט מים בטמפרטורה מבוקר באו 37 ° C או 42 מעלות צלזיוס. קח את בקבוקון אחד בכל נקודת זמן (כלומר, 5, 15, 30 ו -60 דקות) ולמקם אותו באופן מיידי על קרח.
- להוסיף מלח של 0.9% 100 μl לעמודת הספין מוכן, ואז מוסיף של HTLC או הקב"ה-HTLC 100 μl לפני דגירה (שליטה) או לאחר הדגירה באמבט המים לעמודת הספין. צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות. הסר את המזרק מהצינור ולדלל את הפתרון בצינור לניתוח ICP-AES.
3. השרשה של תת עורי xenograft של צוואר הרחםגידול
- כל המחקרים בבעלי החיים שנערכו על פי פרוטוקולי שימוש בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של רשת הבריאות באוניברסיטה (המתפתל).
- לבצע את כל המחקרים בבעלי החיים בקבינט בטיחות ביולוגית (BSC). החיטוי כל הכלים כירורגיים לפני כל ניתוח. לאחר כל ניתוח, לנגב את הכלים כירורגיים עם 70% אתנול ולעקר שוב באמצעות מעקר חרוז חם.
- להמתת חסד, למקם את החיה בCO 2 תא מבודד, ולאחר מכן לבצע נקע בצוואר הרחם.
- להרדמה כללית באמצעות 100% חמצן, להשתמש 5 isofluorane% לזירוז ו -2% לתחזוקה. כדי להבטיח את עומק ההרדמה, להפעיל לחץ עם מלקחיים למשטח כף יד של שודד הדרכים להתבונן תגובת בעלי חיים. החל סיכה עין כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- לבעלי חיים שעברו ניתוח, למקם את החיה בכלוב נקי בלי החברה של בעלי חיים אחרים. צג עד התודעה מספיק הוא חזר.
- תַרְבּוּתME-180 התאים במדיום חיוני אלפא-מינימאלי (α-ממ) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה.
- קציר התאים ולשמור על התאים בתקשורת מלאה לפני החיסון. ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
- לחסן כל עכבר תורם לשאת תוך שרירית (IM) ME-180 גידול (תאי סרטן צוואר רחם אנושיים).
הערה: צמיחה באתר im נבחרה כדי להבטיח את התפתחותם של גידולים גם כלי דם. עכברי רכישה נקבת SCID (גילאים 6-8 שבועות, כ -20 גר ') ממתקן גידול בבית.- הרדימי עכבר SCID נשי ולהזריק 1 x 10 6 ME-180 תאים לתוך שריר הגסטרוקנמיוס של הגפיים האחורי באמצעות מחט 27 G.
- למדוד את גודל גידול באמצעות קליפר עד הגידולים הגיעו 9-12 מ"מ בממד הארוך ביותר שלהם. לסיים את המחקר אם הגידול חרג 12 מ"מ, או אם מסת הגידול פוגעת צריכת התנהגות, ניידות, מזון ומים רגיל.
- חתיכות שתל גידול מעכברי תורם לעכברים נמען.
- הרדימי עכבר תורם באמצעות isofluorane 5%. להרדים את העכבר באמצעות נקע בצוואר הרחם בהרדמה. הסרת הגידול התורם מעכבר התורם. חותך את הגידול לרסיסים מעוקב של 2-3 מ"מ 3.
- הרדימי עכבר נמען באמצעות isofluorane 5%. להזריק 100 μl של 0.5 מ"ג / מיליליטר meloxicam תת עורי לפני הניתוח. החל פתרון יוד כירורגית לשפשף, אז 70% אתנול, ותמיסת יוד לבסוף לעור המגולח. לגלח את הגפיים אחוריות השמאלי של עכבר הנמען. עושה חתך ברמה של עור. הכנס תת עורי חתיכת גידול תורם אחד דרך החתך. סגירת החתך באמצעות קליפ 1-2 פצע (ים).
- הסר את קטעי 3-5 ימים לאחר השתלה. גידול תת עורי נדרש לשימוש בהתקנת החימום מבוסס הלייזר.
- לאפשר גידולים לגדול במשך 2-3 שבועות לפני טיפול חימום.
4. עיצוב, עאסםכיול בליי ושל קונפורמי לייזר משלוח הפנס לin vivo חימום
- להשיג חימום רקמות באמצעות לייזר דיודה 763 ננומטר מצמידים את הפנס קונפורמי באמצעות סיב אופטי.
- הפנס מספק תאורת לייזר שטחית אחידה של גידול xenograft. הוא מורכב מבלוק 30 מ"מ x 20 x 17 חומר מהורהר מאוד המכיל שלושה אור צמוד שילוב התחומים קאמריים עם תא אחד באמצע (16 מ"מ קוטר) ו- 2 תאים קטנים בכל צד (16 מ"מ אורך ו 5 מ"מ קוטר) (איור 1).
- על מנת שאור לעבור מתא אחד לתוך השני, שני חורים בקוטר 5 מ"מ קטנים נחתכו בין התאים חיצוניים הקטנים וקאמרי אמצע הגדול יותר. אור מועבר מהליזר לתאים החיצוניים באמצעות סיבים לחתוך סוף 400 מיקרומטר מחוברים לליזר שהוא עבר לחדר דרך חור 600 מיקרומטר קוטר.
- בשל האופי של int האורeraction עם תא הקירות, אור מועבר לאחד מתאי הקטנים הוא מרחבית הומוגני אז עובר דרך נמלי פנים לתוך התא הגדול יותר שבה הוא עוד יותר במרחב הומוגני. אור אז יוצא היציאה בקוטר 10 מ"מ בתא האמצעי.
- כייל את משלוח אור הפנס ביחס להגדרת כוח הלייזר באמצעות NIST מכויל 50 מ"מ שילוב כדור כדי למדוד את הכח נמסר.
- לחשב את חלוקת האור בגידול באמצעות סימולציות מונטה קרלו מבוססות על גיאומטריה פשוטה של הגידול. ליצור את קוד מונטה קרלו באלגוריתם מותאם אישית בכתב עם חבילה מסחרית חישובית תוכנה ובסיס על הקוד הסטנדרטי של דוגמנות מונטה קרלו תחבורת אור ברקמות רבת שכבתי של et al ז'אק. 14.
- מודל הגידול כחצי כדור שוכבים על קו עור שטוח בקוטר ממד גידול הממוצע של 7 מ"מ התאמה על פני השטח ועורוight של 5 מ"מ. תאורת דגם אחידה של פני השטח על ידי באופן אקראי שיגור פוטונים בכל חצי הכדור והישיר נחשף במרכז הכדור.
- השתמש בתכונות אופטיות כוללים קליטה, μ פיזור = 0.025 מ"מ -1,, μ s = 10 מ"מ -1, גורם אנאיזוטרופיה, G = 0.9 ושבירה, n = 1.4. השתמש במיליון פוטונים בחישוב.
- לבצע מדידות אלה לפני ניסויי כל חימום in vivo ללא שינויים נוספים לאחר כיול ראשוני.
5. קונפורמי חימום של גידול באמצעות התקנת לייזר הלשכה מותאמת אישית מעוצבת
- חבר קצה אחד של סיבי לייזר למכשיר הלייזר ואת הקצה השני לנורה.
- להרדים את החיה באמצעות isofluorane 5%. הכנס קטטר הזרקת G 27 לוריד הזנב לרוחב של העכבר. הכנס קטטר G 22 למרכז הגידול. הנח יחסי ציבור טמפרטורת סיבים אופטייםOBE לקטטר החלול לעקוב אחר שינוי טמפרטורה.
- לכסות את הגידול כולו עם הפנס (איור 2). הסט הראשון את הכח .8-1 W. הפעל את הלייזר ולחכות לטמפרטורה לעלות. לשמור על הטמפרטורה של הגידול על 42 מעלות צלזיוס ידי התאמת כוח הלייזר ידני בין .1-0.8 W.
6. התפלגות הטמפרטורה העריכו באמצעות MR Thermometry (MRT)
- מדוד את התפלגות הטמפרטורה של הגידול המחומם באמצעות התקנת חימום מבוסס לייזר באמצעות שינוי פרוטון תדר תהודה (PRF משמרת) MRT על מערכת הדמיה MR פרה-קליני 7 טסלה 15 בשיתוף עם מדידות הבדיקה טמפרטורת סיבים אופטיות.
- לרכוש תמונות thermometry במרווחים של 10 שניות תוך שימוש ברצף דופק 2D-FLASH (זמן הד 4.5 msec; זמן החזרה 156.25 אלפיות שני) עם 312 x 312 מיקרומטר במטוס רזולוציה ו -2 מ"מ עובי פרוסה בפרוסה אחת ברמה של הסיבים אופטיים פרו טמפרטורהלִהיוֹת.
7. ניטור MR של שחרור הסוכן
- בצע T 1 הדמיה משוקלל לפני ואחרי 20 דקות ממשלו של הקב"ה-HTLC.
- שני גידולי שתל, אחד בכל אחת מהגפיים האחורי, של עכבר SCID נשי בשיטה שתוארה לעיל בסעיף 3 להשתלה. מחממים את הגידול בגפיים האחורי השמאלי במשך 5 דקות על 42 מעלות צלזיוס לפני ההזרקה של הקב"ה-HTLC במינון של 66.3 מ"ג / קילוגרם הקב"ה-HP-DO3A ו -1.4 מ"ג / קילוגרם CDDP, לאחר מכן לחמם את הגידול ל-20 נוספים לאחר הזרקת דקות. לבצע הזרקה במהלך טיפול חימום. השתמש בגידול בגפיים האחורי ימני כשליטה מוסקות.
- לרכוש תמונות MR דינמיות (36 x 20 מ"מ שדה של נוף, 200 x 200 מיקרומטר במטוס רזולוציה, עובי 2 מ"מ פרוסה; פרוטוקול רצף MR) כדי לפקח על שחרור הקב"ה-HP-DO3A במרווחי 12 שניות לדקות 20 כל הודעה ממשל של הקב"ה-HTLC, מתחיל 30 שניות לפני ההזרקה.
- קונטור גידול (מחומם ומוסק) וכרכי שריר.לחשב את אות MR הממוצעת של כל voxels בתוך כל נפח קווי מתאר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ליפוזומים HTLC מיוצרים תוך שימוש בשיטות נפוצות, הכוללים השקעה בסרט שומנים בדם, לחות, חול ודיאליזה. במהלך השלבים מעורבים CDDP, זהירות יש לנקוט לא לחשוף CDDP לכל חומר אלומיניום, כCDDP יהיה מנוטרלת דרך ההיווצרות של הפקדה שחורה. איור של HTLC מוצג באיור 3. התכונות פיסיקליים והכימיות של HTLC סוכמו בכתב יד שהתפרסמה לאחרונה בכתב העת של שחרור מבוקר 16. ריכוזי גדוליניום ופלטינה של ניסוח הקב"ה-HTLC הם 1.87 מ"ג ± 0.28 / מיליליטר ו0.10 ± 0.02 מ"ג / מיליליטר, בהתאמה.
הפנס של התקנת החימום מבוסס הלייזר משתמש בשלושה תאים קטנים, מחוברים המספקים הפצה הומוגנית אור (± 15%) בנמל היציאה בקוטר 10 מ"מ. בהתאם לכוח ההגדרה של הלייזר, כוח מועבר בטווח של 0.5-1.7 W / 2 סנטימטר, כאמצעיד באמצעות כדור שילוב מכויל. התוצאות מוצגות באיור 4 כמו חתך דרך הגידול. בהנחת כוח כולל של 1 W, שיעור השטף המרבי בכל נקודה בגידול הוא 70 mW / 2 סנטימטר. כוח הלייזר יורד בפקטור של 2 ברמת העור בהשוואה לשטף השיא מתחת לפני שטח הגידול.
חימום באמצעות התקנת חימום מבוסס לייזר יוצר מפת חלוקת הטמפרטורה אחידה יחסית, כפי שאושר על ידי PRF המשמרת MRT (איור 5). PRF משמרת MRT עוקב שינוי הטמפרטורה היחסי ממדידת בסיס מוחלטת שנרכשה לפני חימום על ידי מקור הנקודה (כלומר, חיישן טמפרטורת סיבים אופטיים).
מניתוח אות MR (איור 6 ג), הגידול המחומם מציג את העלייה הגבוהה ביותר ביחס האות בהשוואה לגידול מוסק ושרירים לאחר מתן של הקב"ה-HTLC, שנשמר עד לסיוםתקופת החימום.
איור 1. עיצוב של נורת. מידות (א ') של נורת. (ב) ממדים של התאים הפנימיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. איור של התקנת החימום מבוסס לייזר יחד עם מכשיר ניטור טמפרטורה. סיבי לייזר (קו כחול) מספק אור לנורה. בדיקה טמפרטורת סיבים אופטי (קו צהוב) הוצבה למרכז הגידול באמצעות קטטר 22 G לעקוב אחר שינוי טמפרטורה. מזג בזמן אמתקריאות שבמקום מוצגות על מסך המחשב. שונה מן כתב העת של שחרור מבוקר 2014, 178, 69-78. 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ציור סכמטי של ניסוח HTLC (לא בקנה מידה). יצירות השומנים בדם, ריכוז CDDP וגודל של יפוזומים HTLC מומחשים. שונה מן כתב העת של שחרור מבוקר 2014, 178, 69-78. 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Modelinגרם של משלוח אור לגידול באמצעות שילוב תחום קטן. () סכמטי של מודל מראה גידול המורם מעל הרקמה הבסיסית הנורמלית. חיצים אדומים מייצגים כיסוי וכיוון של פוטונים ראשוניים בחישוב. תאורה מכסה את פני שטח המלא של הגידול גדל. (ב) תוצאות של חישוב מראים הפצת שטף אור בגידול. (C) עלילת חתך של שטף אור לעומת עומק, לאורך קו מקווקו הלבנים מוצג ב( B). שיעור Fluence בגידול בעומק העור הוא 50% מהתעריף המרבי השטף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הפצת 5. טמפרטורת איור הוערכה באמצעות thermometry MR. ו# 160;. () T תמונה משוקלל 2 מראה את המיקום האנטומי של שני גידולים שהושתלו בילטרלי מפת החלוקה (ב) טמפרטורה שנוצרה מחימום גידול השמאל עד 42 מעלות צלזיוס באמצעות התקנת חימום מבוסס לייזר, ואילו גידול תקין נשאר מוסק. הנתונים מחדש ניתחו מעיתון של שחרור מבוקר 2014, 178, 69-78. 16 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניטור 6. MR איור של שחרור gadoteridol מיפוזומים הקב"ה-HTLC על הפעלת חום. T 1 משוקלל תמונות MR (אותה רמת חלון מיושמת) של עכבר נושאת שני ME-180 גידולים תת עורית, עם אחד בכל אחת מהגפיים האחורי ( ) לפני הזרקה של הקב"ה-HTLC ו20 דקות לאחר הזרקה של הקב"ה-HTLC (ב) (כלומר, לאחר כל תקופת החימום). אות MR יחסית (C) משנה מנורמל לנקודת הזמן הראשונה של הרכישה הדינמית MR של העכבר שמוצג () ו- ( B). הנתונים מייצגים SD הממוצע +. הנתונים מחדש ניתחו מעיתון של שחרור מבוקר 2014, 178, 69-78. 16 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ליפוזומים פותחו לראשונה ב -1960 ככלי רכב משלוח סמים שנושאים תרופות הידרופילי בנפח המימי הפנימי שלהם ותרופות הידרופובי בתוך bilayer השומנים שלהם 2. בנוסף להשתמש ביישומים טיפוליים, ליפוזומים נחקרו עבור יישומי אבחון כאשר כותרתו עם אטומים רדיואקטיביים או עמוס חומרי ניגוד הדמיה 17. בשנים האחרונות, theranostics וזוגות טיפוליים-אבחון כבר רדף לספק הזדמנויות לריבוד מטופל מונחה הדמיה ומשלוח הסמים 17,18. המחקר הנוכחי בוסס על הרעיון של משלוח סמים מונחה הדמיה להערכת שחרור תרופה מופעל מיפוזומים thermosensitive באמצעות התקנת חימום מעוצב מותאמת אישית המבוסס על לייזר תחת הדרכת MR.
כפי שצוין לעיל, אמבטיות מים או צנתרים חימום יש בדרך כלל נעשו שימוש כדי לחמם גידולים תת עורית. שיטת אמבט מים דורשת הטבילה של כל האיבר בחם wאטר, וכתוצאה מכך שחרור תרופה שאינה ספציפי, בכל האיבר בתוספת לשחרר באתר הגידול. שימוש בקטטר חימום דורש מיקום של צנתר G 18 במרכז הגידול, והוכח מחייב חימום לתקופה של זמן (15 דקות) ארוכה יחסית כדי להגיע למצב יציב תרמית 11.
במחקר הנוכחי, התקנת החימום מבוסס לייזר החדש תוכננה מספקת דרך קונפורמי של אספקת חום לנפח הגידול כפי שהודגם על ידי הערכה של מפת חלוקת הטמפרטורה (איור 5) המבוססת על MR. ההטרוגניות במפת PRF-השינוי באיבר מוסק תקין האחורי וגידול איבר תקין באיור 5 עשויה לשקף שילוב של אות נמוכה לרעש בסביבה של חפצי רגישות ותנועות פיסיולוגיות או מושרה חימום קלים, שעלול לפגוע באופן ישיר חימום ורישום תמונה בסיסית, אלא גם להציג את השינויים קלים בשדות מושרה סביבאזורים של רגישות מגנטית קיזוז. בנוסף, נמצא כי מצב יציב תרמית ניתן היה להשיג בתוך 1-2 דקות של ייזום חימום. כמו כן, חיישן טמפרטורת סיבים האופטי המבוסס על הנקודה אפשר התאמה של כוח הלייזר בזמן אמת על מנת לשמור על הטמפרטורה על 42 מעלות צלזיוס ולמזער את תנודות טמפרטורה. עם זאת, חשוב למקם את חיישן טמפרטורת סיבים האופטי בעמדה מרכזית יחסית בתוך הגידול. MR הדמיה יכולה להיות מועסק על מנת לאמת את נקודת החתך לחיישן. במהלך חימום, כוח הלייזר צריך להיות מותאם בזהירות כדי לשמור על הטמפרטורה על 42 מעלות צלזיוס עם כוח ראשוני של 0.8 W.
פרוטוקול החימום היה מותאם באמצעות ניטור בזמן אמת של שחרור הקב"ה-HP-DO3A כתחליף לCDDP הסמים. השחרור היעיל של סוכנים במארז מיפוזומים HTLC תורגם ליעילות משופרת, עם קבוצת HTLC המחוממת וכתוצאה מכך advan הטיפולי משמעותיכאחוז על קבוצות טיפול ובקרה אחרות 16.
הפנס של מנגנון החימום נועד לחמם גידולים של 5-7 מ"מ בממד הגדול ביותר. העיצוב של נורת יכול להיות שונה כדי לחמם גידולים גדולים יותר וחיישני טמפרטורת סיבים אופטיים מרובים יכול להיות מוכנסים בכל נפח הגידול לעקוב אחר טמפרטורה בהשוואה למדידת נקודה אחת הנוכחית מבוססת. בנוסף, מאז המכשיר הנייד עשוי מחומרי MR-תואמים, 3 ממדי thermometry MR יכול להתבצע כדי להעריך את התפלגות הטמפרטורה לאורך כל נפח הגידול.
לסיכום, מכשיר החימום מבוסס הלייזר מספק כלי רב ערך לפיתוח פרה-קליני של ניסוחים liposome thermosensitive. גישות מונחות הדמית משלוח סמים, כגון זה המשמש במחקר זה, יש פוטנציאל משמעותי לתרגום קליני ויישום של רפואה אישית כולל אמיתיים-טיםניטור דואר לטיפול רפואי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary evaporator | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG | Laborota 4000 | |
| High pressure extruder | Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml thermobarrel |
| Heating circulator | VWR International LLC. | 11305 | Connected to extruder |
| Polycarbonate membrane filter | Whatman | 110605;110606 | |
| Differential scanning calorimeter (DSC) | TA Instruments | Q100 | |
| Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) | PerkinElmer | Optima 7300DV | |
| Zetasizer | Malvern Instruments Ltd. | Nano-ZS | |
| Cell incubator | NuAire Inc. | NU-5800 | |
| Autoclip wound clip applier | Becton Dickinson | 427630 | |
| Autoclip wound clip remover | Becton Dickinson | 427637 | |
| Wound clips | Becton Dickinson | 427631 | 9 mm |
| 763 nm Laser device | Biolitec | Ceralas CD 403 laser | |
| Laser probe | Thorlabs Inc. | FT400EMT | With SMA and flat cleave connectors |
| Spectralon (illuminator) | Labsphere Inc. | FAST-SL-5CMX5CM | |
| CSTM-SL-5CMX5CM | |||
| 7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system | Bruker Corporation | Biospec 70/30 | |
| Fiber optic temperature sensor | LumaSense Technologies Inc. | Luxtron FOT Lab Kit | |
| Integrating sphere | Newport Corporation | 819C | |
| Optical power meter | Newport Corporation | 1830-R |
References
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Releas. 65 (1-2), 271-284 (2000).
- Simard, P., Leroux, J. C., Allen, C., Meyer, O. Liposomes for Drug Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Application. , American Scientific Publishers. (2007).
- O'Brien, M. E. R., et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX (TM)/Doxil (R)) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. Ann Onco. 15 (3), 440-449 (2004).
- White, S. C., et al. Phase II study of SPI-77 (sterically stabilised liposomal cisplatin) in advanced non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 95 (7), 822-828 (2006).
- Laginha, K. M., Verwoert, S., Charrois, G. J. R., Allen, T. M. Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. Clin Cancer Res. 11 (19), 6944-6949 (2005).
- Baronzio, G. F., Hager, E. D. Hyperthermia in cancer treatment: a primer. , Springer Science. (2006).
- Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale Drug Delivery and Hyperthermia: The Materials Design and Preclinical and Clinical Testing of Low Temperature-Sensitive Liposomes Used in Combination with Mild Hyperthermia in the Treatment of Local Cancer. Open Nanomed. 3, 38-64 (2011).
- Celsion Corporation. , Celsion Announces Updated Overall Survival Data from HEAT Study of ThermoDox http://investor.celsion.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=862248 (2014).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., ten Hagen, T. L. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27 (8), 1750-1754 (2010).
- Viglianti, B. L., et al. In vivo monitoring of tissue pharmacokinetics of liposome/drug using MRI: illustration of targeted delivery. Magn Reson Me. 51 (6), 1153-1162 (2004).
- Ponce, A. M., et al. Magnetic resonance imaging of temperature-sensitive liposome release: drug dose painting and antitumor effects. J Natl Cancer Ins. 99 (1), 53-63 (2007).
- Kong, G., et al. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor xenograft model: importance of triggered drug release. Cancer Res. 60 (24), 6950-6957 (2000).
- Yarmolenko, P. S., et al. Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours. Int J Hyperthermia. 26 (5), 485-498 (2010).
- Wang, L. H., Jacques, S. L., Zheng, L. Q. MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Comput Meth Prog Bio. 47, 131-146 (1995).
- Rieke, V., Butts Pauly, K. MR thermometry. J Magn Reson Imaging. 27 (2), 376-390 (2008).
- Dou, Y. N., et al. Heat-activated thermosensitive liposomal cisplatin (HTLC) results in effective growth delay of cervical carcinoma in mice. J Control Release. 178, 69-78 (2014).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol Pharm. 7 (6), 1899-1912 (2010).
- Lee, H., et al. A novel 64Cu-liposomal PET agent (MM-DX-929) predicts response to liposomal chemotherapeutics in preclinical breast cancer models. Thirty-Fifth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium. , (2012).
