Summary
AN MRI-compatibele maat ontworpen laser gebaseerde verwarmingsapparaten ontwikkeld plaatselijke verhitting van subcutane tumoren verschaffen om afgifte van stoffen uit warmte gevoelige liposomen activeert specifiek op het tumorgebied.
Abstract
Liposomen werden gebruikt als geneesmiddelafgiftesystemen solide tumoren doelwit door benutting van de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect resulteert in significante verminderingen van systemische toxiciteit. Niettemin heeft onvoldoende afgifte van ingekapseld geneesmiddel uit liposomen hun klinische effectiviteit gelimiteerd. Temperatuur-gevoelige liposomen zijn ontworpen om plaatsspecifieke afgifte van geneesmiddel verschaffen om het probleem van beperkte tumorgeneesmiddel biobeschikbaarheid overwinnen. Ons laboratorium heeft ontworpen en ontwikkeld een warmte-geactiveerde thermosensitieve liposoomformulering van cisplatine (CDDP), beter bekend als HTLC om getriggerde afgifte van CDDP leveren tegen solide tumoren. Warmtegeactiveerde delivery in vivo in muismodellen bereikt met een op maat gemaakte laser gebaseerde verwarmingsinrichting die een conforme verwarmingspatroon verschaft op de tumorplaats zoals bevestigd door MR thermometry (MRT). Een vezeloptische temperatuurbewaking werd gebruikt om de temperatuur in real-time te metengedurende de gehele verwarmingsperiode met online aanpassing van de warmtelevering door afwisselend het laservermogen. Geneesmiddelafgifte werd geoptimaliseerd onder magnetisch resonantie (MR) beeld begeleiding door co-inkapseling van een MR-contrastmiddel (dwz gadoteridol) met CDDP in de voor warmte gevoelige liposomen als een middel om de stookprotocol valideren en tumoraccumulatie te beoordelen. De verwarming protocol bestond uit een voorverwarming gedurende 5 min voor toediening van HTLC en 20 min verwarmen na injectie. Deze verwarming protocol resulteerde in efficiënte afgifte van de ingekapselde agentia met de hoogste MR signaalverandering waargenomen in het verwarmde tumor in vergelijking met de onverwarmde tumor en spieren. Deze studie toonde de succesvolle toepassing van de op laser gebaseerde verwarmingsapparaten voor warmte gevoelige liposomen preklinische ontwikkeling en het belang van MR-geleide validatie van de stookprotocol voor de optimalisatie van geneesmiddelafgifte.
Introduction
De pathofysiologie van solide tumoren leidt tot verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) van nanoschaal systemen. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van vele geneesmiddelafgiftesystemen die gebruik maken van dit effect het tumorweefsel richten terwijl het minimaliseren van systemische bijwerkingen 1. Liposomale delivery technologieën zijn op grote schaal onderzocht op drugs of beeldvorming sondes 2. Hoewel liposomen aanzienlijk verminderde de systemische toxiciteit in vergelijking met conventionele chemotherapie, zijn er weinig verbetering in klinische effectiviteit 3,4 zijn. Studies hebben aangetoond dat de beperkte werkzaamheid te wijten is aan een gebrek aan geneesmiddelafgifte uit de drager 4,5. Dientengevolge is de ontwikkeling van liposomen die worden geactiveerd om het ingekapselde geneesmiddel af te geven in reactie op externe stimuli aandacht getrokken. Hyperthermie is gebruikt voor decennia als een relatief veilige behandeling modaliteit voor kankerpatiënten 6. Daarom is de ontwikkelingling van temperatuurgevoelige liposomen met warmte als een externe trigger is een logische combinatie met een aanzienlijk potentieel voor klinische vertaling geweest. Inderdaad, de lysolipide bevattende warmtegevoelige liposoomformulering doxorubicine, zogenaamde LTSL-DOX, nu op klinische evaluatie 7.
Recente klinische gegevens met LTSL-DOX is gebleken dat het protocol voor warmte-afgifte is een kritische factor die sterk kunnen beïnvloeden patient outcomes 8. Bij de mens, worden radiofrequente, magnetron, laser en ultrasone transducers gebruikt om hyperthermie lokaal toe te passen op tumorplaatsen 9. In preklinische studies die verwarming van subcutane tumoren, worden verwarming katheters 10,11 en waterbaden 12,13 vaakst gebruikt. In dit manuscript introduceren we een nieuwe werkwijze voor het verwarmen van subcutane tumoren met behulp van een speciaal ontworpen laser gebaseerde verwarming installatie, die meer conforme verwarmen van het tumorvolume mogelijk maakt. Met behulp van MR compatibele materialen, de setup is klein genoeg om te passen binnen de boring van een klein dier MR imager, waardoor real-time monitoring van de veranderingen in het weefsel temperatuur tijdens de laser verwarming.
De MR-contrastmiddel, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), werd co-ingekapseld met CDDP in een temperatuurgevoelige liposoom formulering van CDDP (HTLC), bekend als Gd-HTLC, voor real-time MR image-begeleide monitoring en evaluatie van de warmte -geactiveerde geneesmiddelafgifte en validatie van de verwarming protocol. Onze resultaten tonen aan dat de op laser gebaseerde verwarmingsinrichting efficiënt geactiveerd de afgifte van ingekapselde middelen van de Gd-HTLC formulering terwijl door middel van MRI wordt gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. liposoompreparaat
- Los de lipiden 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfatidylcholine (MSPC of S-lyso-PC) en N - (carbonyl- methoxypolyethyleneglycol 2000) -1,2-distearoyl- sn-glycero-3-fosfoethanolamine (mPEG 2.000 -DSPE) in chloroform. Bijvoorbeeld, voor de bereiding van 10 ml HTLC afgewogen 314,4 mg DPPC, 39,4 mg MSPC en 83,9 mg mPEG 2.000 -DSPE in een amberkleurig glazen flesje. Vervolgens ontbinding van de lipiden in 2 ml chloroform en opwarmen van het flesje gedurende 30 seconden in een 60 ° C waterbad.
- Verwijder het chloroform met een rotatieverdamper. Plaats de resulterende lipide film onder hoge druk vacuüm O / N.
- Voor 10 ml HTLC, hydrateren de lipide film met 5 ml 0,1 N Tris-buffer (pH 7,4) gedurende 1 uur. Tegelijkertijd afgewogen 162,4 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG) lipiden en 100 mg poeder en CDDP hydraat wi 5 ml 0,1 N Tris-buffer bevattende 30% ethanol (pH 7,4) gedurende 1 uur.
- Voor de Gd-HTLC formulering afgewogen dezelfde hoeveelheid lipide DPPG en 10 mg CDDP poeder, daarna gehydrateerd met 2,5 ml Gd-HP-DO3A oplossing (279,3 mg / ml) plus 2,5 ml 0,1 N Tris-buffer bevattende 30% ethanol ( pH 7,4) gedurende 1 uur. Tijdens hydratatie, moet de mengsels in amberkleurige flesjes bewaard en op een verwarmingsplaat bij 70 ° C onder constant roeren en vortexen elke 10 min.
- Combineer het lipide mengsel en het lipide geneesmiddelmengsel en opnieuw hydrateren 1 uur. Vortex elke 15-20 min.
- Monteer de 10-ml extruder met twee stapels van 200 nm polycarbonaat filters. Sluit de thermobarrel van de extruder een circulerend waterbad bij 70 ° C, en sluit de extruder een gecomprimeerde stikstof tank.
- Direct na hydratatie, breng het mengsel in de extruder kamer. Open stikstofstroom (insteldruk tot 200 psi) om de liposomen geëxtrudeerd door de membranen. Verzamel de liposomes in een 50 ml buis. Bewaar het buisje in een waterbad (70 ° C) te allen tijde tijdens het extrusieproces. Herhaal dit proces 5 keer.
- Demonteren van de extruder en veranderen in twee stapels van 100 nm polycarbonaat filters. Monteer de extruder en stel de druk tot 400 psi. Herhaal stap 5, behalve extrusie van de liposomen 10 maal. Verzamel het monster van het uiteindelijke extrusie in een 15 ml buis.
- Afkoelen van de liposomen tot KT, en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten neerslaan onoplosbare CDDP.
- Dialyseer de liposomen O / N tegen 0,9% zoutoplossing in dialyseslang met een 15.000 molecuulgewicht cutoff (MWCO) onder steriele omstandigheden.
- Verdun 10 ul van de liposomen in 990 pl gedestilleerd water. Met dynamische lichtverstrooiing de grootteverdeling van HTLC en Gd-HTLC meten. 3 metingen uit te voeren met 10 runs per stuk.
- Verdun 40 ul van de liposomen in 3960 pl gedestilleerd water. Zorg 5-6 standaardoplossingen van platina en gadoliniumin een concentratiebereik van 0,1 tot 20 ug / ml. Meet de platina en gadolinium concentraties met inductief gekoppelde plasma-atomaire emissie spectrometer (ICP-AES) op 3 verschillende golflengtes. Presteren 3 metingen bij elke golflengte voor de gemiddelde resultaat.
- Bepaal de gel vloeibaar kristallijne fase overgangstemperatuur (Tm) van de HTLC liposoomformulering met een differentiële scanning calorimeter (DSC). Belasting 5-10 mg HTLC in een DSC-pan en gebruik een lege pan als referentie. Gebruik een scansnelheid van 5 ° C / min tot het opvoeren van de temperatuur van 0 ° C tot 60 ° C.
- Wikkel de liposomen in aluminiumfolie om blootstelling aan licht en bewaar bij 4 ° C te voorkomen.
2. In vitro Vrijval liposomen
- Bereid spinkolommen.
- Incubeer 50 g gelfiltratie parels in 400 ml 0,9% zoutoplossing bij kamertemperatuur 3-4 uur. Oprollen een stuk glaswol, nat met 0,9% zoutoplossing en plaats deze in het uiteinde van een injectiespuit 1 ml. Druk op de glaswol ongeveer 0,05-0,1 ml van de spuit te vullen. Gebruik een glazen pipet om geleidelijk aan ongeveer 1 ml gel filtermedia in de injectiespuit.
- Plaats de spuit in een 15 ml buis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 min. Verwijder de spin kolom en plaats deze in een 15 ml buis.
- Monster 400 gl HTLC of Gd-HTLC in 8-1 dram glazen flesjes en incubeer in een temperatuur geregeld waterbad bij ofwel 37 ° C of 42 ° C. Neem een flacon op elk tijdstip (dwz, 5, 15, 30 en 60 min) en direct plaats het op ijs.
- Voeg 100 ul van 0,9% zoutoplossing in de voorbereide spinkolom, voeg dan 100 ul van HTLC of Gd-HTLC vóór incubatie (controle) of na incubatie in het waterbad in de spin kolom. Centrifugeer bij 1000 g gedurende 3 min. Verwijder de spuit uit de tube en verdun de oplossing in de buis van ICP-AES analyse.
3. Implantatie van subcutaan Xenograft van CervicalTumor
- Alle dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met het gebruik van dieren protocollen door de Animal Care Comite van de University Health Network (UHN) goedgekeurd.
- Voer alle dierproeven in een bioveiligheid kast (BSC). Autoclaaf alle chirurgische instrumenten vóór een operatie. Na elke operatie, veeg de chirurgische instrumenten met 70% ethanol en steriliseer opnieuw met een hete kraal sterilisator.
- Voor euthanasie, plaats het dier in een geïsoleerde CO 2 kamer, dan voeren cervicale dislocatie.
- Voor algemene anesthesie met 100% zuurstof, 5% isofluorane gebruikt voor inductie en 2% onderhoud. Om de diepte van anesthesie garanderen, druk uitoefenen met een tang om palmaire zijde van de voetzool respons dieren te observeren. Breng oogzalf tot droog voorkomen terwijl onder narcose.
- Voor een dier dat een operatie heeft ondergaan, plaats het dier in een schone kooi zonder het gezelschap van andere dieren. Bewaken totdat voldoende bewustzijn herwonnen.
- CultuurME-180 cellen in alfa-minimaal essentieel medium (α-MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica.
- Oogst de cellen en houdt de cellen in compleet medium voor enting. Tel de cellen met een hemocytometer.
- Te enten elke donor muis om een intramusculaire (im) ME-180 (humane baarmoederhalskanker cellen) tumor dragen.
Opmerking: groei bij de im site is geselecteerd om de ontwikkeling van goed gevasculariseerde tumoren waarborgen. Aankoop vrouwelijke SCID muizen (leeftijd 6-8 weken, ongeveer 20 g) van een in-house fokkerij.- Verdoven een vrouwelijke SCID muis en injecteer 1 x 10 6 ME-180 cellen in de gastrocnemius spier van de achterpoot met behulp van een 27 G naald.
- Meet tumorgrootte met een schuifmaat tot tumoren 9-12 mm in de langste afmeting hebben bereikt. Beëindig het onderzoek als de tumor 12 mm overschrijdt, of indien de tumormassa compromissen normaal gedrag, ambulation, voedsel- en wateropname.
- Implantaat tumor stukken uit donor muizen in de ontvangende muizen.
- Verdoven van een donor muis met behulp van 5% isofluorane. Euthanaseren de muis via cervicale dislocatie onder verdoving. Verwijder de donor tumor van de donormuis. Snijd de tumor in kubieke fragmenten van 2-3 mm 3.
- Verdoven van een ontvanger muis met behulp van 5% isofluorane. Injecteer 100 ui van 0,5 mg / ml meloxicam subcutaan vóór de operatie. Solliciteer jodium chirurgische scrub oplossing, dan is 70% ethanol, en ten slotte jodium oplossing voor de geschoren huid. Scheren de linker achterpoot van de ontvanger in de muis. Een insnijding op het niveau van de huid. Steek één donor tumor stuk subcutaan door de incisie. Sluit de incisie met 1-2 wond clip (s).
- Verwijder de klemmen 3-5 dagen na implantatie. Subcutane tumor is vereist voor het gebruik van de laser-gebaseerde verwarming installatie.
- Laat tumoren groeien 2-3 weken vóór warmtebehandeling.
4. Design, Assembly en kalibratie van een Conformal Laser Delivery Illuminator voor in vivo Verwarming
- Bereiken verwarming van weefsel met behulp van een 763 nm diodelaser gekoppeld met een conforme illuminator behulp van een optische vezel.
- De verlichting zorgt voor een gelijkmatige oppervlakkige laser verlichting van de xenograft tumor. Het bestaat uit een 30 x 20 x 17 mm blok sterk reflecterend materiaal dat drie aansluitend licht integreren kamer bollen met een kamer in het midden (16 mm in diameter) en 2 kleine kamers aan weerszijden (16 mm lang en 5 mm in diameter) (Figuur 1).
- Om het licht te gaan van de ene kamer naar de andere, werden twee kleine 5 mm diameter gaten te snijden tussen de kleine buitenste kamers en de grotere middelste kamer. Licht wordt vanuit de laser naar de buitenste kamers met een 400 urn cut-end vezel verbonden met de laser die in de kamer wordt door een 600 urn diameter gat.
- Vanwege de aard van het licht interaction de kamerwanden, afgegeven licht in een van de kleine kamers ruimtelijk gehomogeniseerd vervolgens door het inwendige poorten in de grotere kamer waar het verder ruimtelijk gehomogeniseerd. Licht verlaat dan de 10 mm poort diameter op de middelste kamer.
- Kalibreer het belichtingstoestel Lichttoedieningsapparatuur opzichte van het laservermogen instelling met een NIST gekalibreerde 50 mm integrerende bol het afgegeven vermogen meten.
- Bereken de lichtverdeling in de tumor met behulp van Monte Carlo simulaties op basis van een vereenvoudigde vorm van de tumor. Genereren van de Monte Carlo code in een aangepaste algoritme geschreven met een commercieel computational softwarepakket en de basis van de standaard code van Monte Carlo modellering van licht transport in multi-gelaagde weefsels van Jacques et al. 14.
- Model van de tumor als een halve bol die op een vlakke huidlijn met een diameter overeenkomt met de gemiddelde tumor afmeting van 7 mm op het huidoppervlak en hijechts van 5 mm. Model homogene verlichting van het oppervlak door willekeurig lanceren fotonen gehele blootgestelde halfrond en direct in het midden van de bol.
- Gebruik optische eigenschappen zoals absorptie, p a = 0,025 mm -1, verstrooiing, μ s = 10 mm -1, anisotropie factor, G = 0,9 en brekingsindex n = 1,4. Met 1 miljoen fotonen in de berekening.
- Het uitvoeren van deze metingen voordat een in vivo-experimenten verwarming zonder verdere wijzigingen na de eerste kalibratie.
5. Conforme Verwarming van de tumor met behulp van Custom-ontworpen Laser Kamer Setup
- Sluit het ene uiteinde van een laser fiber to the laser apparaat en het andere uiteinde op de verlichting.
- Verdoven het dier middels 5% isofluorane. Plaats een 27 G injectie katheter in de laterale staartader van de muis. Plaats een 22 G katheter in het midden van de tumor. Plaats een glasvezel temperatuur probe in de holle katheter temperatuurverandering controleren.
- Bedek de gehele tumor met het belichtingstoestel (figuur 2). Eerst de macht om 0,8-1 W. Zet de laser en wacht tot de temperatuur stijgen. Houd de temperatuur van de tumor bij 42 ° C door het handmatig aanpassen van het laservermogen tussen 0,1-0,8 W.
6. temperatuurverdeling geëvalueerd door middel van MR Thermometrie (MRT)
- Meet de temperatuurverdeling van het verwarmde tumor met de laser gebaseerde verwarming installatie door middel protonresonantiefrequentie frequentieverschuiving (PRF-shift) MRT op 7 Tesla preklinische MRI systeem 15 in combinatie met de vezeloptische temperatuursonde metingen.
- Acquire thermometrie afbeeldingen in 10 seconden intervallen met een 2D-FLASH pulssequentie (nagalmtijd 4,5 msec; herhalingstijd 156,25 msec) met 312 x 312 urn in het vlak resolutie en 2 mm schijfdikte in één segment op het niveau van de vezeloptische temperatuur proworden.
7. MR Monitoring van Agent versie
- Voer T 1-gewogen beeldvorming voor en 20 minuten na toediening van Gd-HTLC.
- Implant twee tumoren, een op elk van de achterpoten, vrouwelijke SCID muis met de hierboven in sectie 3 voor de implantatie werkwijze. Verwarm de tumor aan de linker achterpoot gedurende 5 min bij 42 ° C voor de injectie van Gd-HTLC in een dosis van 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A en 1,4 mg / kg CDDP, daarna verhitten van de tumor nog 20 min na de injectie. Voer injectie tijdens de warmtebehandeling. Gebruik de tumor rechts achterpoot als een onverwarmde control.
- Verwerven dynamische MR beelden (36 x 20 mm field-of-view, 200 x 200 micrometer in-plane resolutie van 2 mm plakdikte; MR sequentie protocol) om Gd-HP-DO3A vrijlating op 12 sec intervallen voor de gehele 20 min controleren na toediening van Gd-HTLC, te beginnen op 30 seconden voorafgaand aan de injectie.
- Contour van de tumor (verwarmde en onverwarmde) en spier volumes.Berekent het gemiddelde MR-signaal van alle voxels binnen elk contouren volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De HTLC liposomen worden vervaardigd met behulp van gemeenschappelijke methoden, met inbegrip van lipide-film vorming, hydratatie, extrusie en dialyse. Tijdens het stappen met CDDP, is voorzichtigheid niet worden genomen om CDDP bloot aan aluminium materiaal, zoals CDDP zal worden uitgeschakeld door de vorming van een zwarte storting. Een illustratie van HTLC is weergegeven in figuur 3. De fysisch-chemische eigenschappen van HTLC werden in een manuscript onlangs gepubliceerd in het Journal of Controlled Release 16 samengevat. De gadolinium en platina concentraties van het Gd-HTLC formulering 1,87 ± 0,28 mg / ml en 0,10 ± 0,02 mg / ml, respectievelijk.
De verlichting van de laser gebaseerde verwarming setup maakt gebruik van drie kleine, verbonden kamers die een homogene lichtverdeling (± 15%) bij de 10 mm diameter afslag poort te bieden. Afhankelijk van de vermogensinstelling van de laser, wordt vermogen geleverd binnen het bereik van 0,5 tot 1,7 W / cm2, als maatd met behulp van een gekalibreerde integrerende bol. De resultaten worden getoond in Figuur 4 een doorsnede door de tumor. Uitgaande van een totaal vermogen van 1 W, de maximale fluentie snelheid op elk punt in de tumor 70 mW / cm 2. De laser vermogen neemt met een factor 2 op huidniveau opzichte van de piek fluentie net onder het oppervlak tumor.
Verwarming met de laser gebaseerde verwarming opstelling genereert een relatief gelijkmatige temperatuurverdeling kaart, zoals bevestigd door het PRF-shift MRT (figuur 5). PRF-shift MRT tracks de relatieve temperatuur verandering van een absolute nulmeting door de puntbron (dwz glasvezel temperatuursensor) voor verwarming verworven.
Uit MR signaalanalyse (figuur 6C), de verwarmde tumor toont de hoogste relatieve signaal toename in vergelijking met de onverwarmde tumor en spieren na toediening van Gd-HTLC, die wordt gehandhaafd tot het eindevan het stookseizoen.
Figuur 1. Ontwerp van de verlichting. (A) Afmetingen van de verlichting. (B) Afmetingen van de binnenkamers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Illustratie van de laser gebaseerde verwarming setup samen met een temperatuur controle-apparaat. Een laser vezel (blauwe lijn) levert licht van de schijnwerper. Een vezeloptische temperatuursonde (gele lijn) werd in het midden van de tumor geplaatst via een katheter 22 G temperatuurveranderingen controleren. Real-time humeurtuur metingen worden weergegeven op het computerscherm. Gewijzigd ten opzichte van Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Schematische tekening van de HTLC formulering (niet op schaal). Het lipidesamenstellingen, CDDP concentratie en de grootte van de liposomen HTLC geïllustreerd. Gewijzigd ten opzichte van Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Modeling licht levering aan de tumor met behulp van kleine bolfotometer. (A) Schematische voorstelling van model toont tumor boven de normale onderliggende weefsel verhoogd. Rode pijlen vertegenwoordigen bereik en richting van de eerste fotonen in de berekening. Verlichting beslaat de volledige oppervlakte van de verhoogde tumor. (B) De resultaten van de berekening toont licht Fluence verdeling in de tumor. (C) dwarsdoorsnede plot van licht Fluence versus de diepte, langs de witte stippellijn aangegeven in (B). Fluence tarief in de tumor op een diepte huid is 50% van de maximale Fluence tarief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Temperatuur distributie geëvalueerd door middel van MR thermometrie. &# 160;. (A) T2-gewogen beeld toont de anatomische locatie van de twee bilateraal geïmplanteerde tumoren (B) temperatuurverdeling kaart gegenereerd door verhitten links tumor tot 42 ° C met behulp van de laser gebaseerde verwarming installatie, terwijl de rechter tumor bleef onverwarmd. Data opnieuw geanalyseerd van Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. MR toezicht gadoteridol afgifte uit de Gd-HTLC liposomen bij warmteactivering. T 1-gewogen MR beelden (zelfde vensterniveau toegepast) van een muis dragende twee subcutane ME-180 tumoren, één op elk van de achterste ledematen ( A) pre-injectie van Gd-HTLC en(B) 20 min na injectie van Gd-HTLC (dwz na de volledige verwarmingstijd). (C) Relatieve MR-signaal verandert genormaliseerd op het eerste tijdpunt van de dynamische MR overname van de muis getoond in (A) en ( B). Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde + SD. Data opnieuw geanalyseerd van Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Liposomen werden voor het eerst ontwikkeld in de jaren 1960 geneesmiddelafgiftedragers die hydrofiele geneesmiddelen in hun inwendige waterige volume en hydrofobe geneesmiddelen dragen op hun lipide bilaag 2. Naast het gebruik in therapeutische toepassingen, zijn liposomen onderzocht voor diagnostische toepassingen waarbij gelabeld met radionucliden of geladen met beeldvormende contrastmiddelen 17. In de afgelopen jaren, Theranostics en therapeutische diagnostische paren zijn gevolgd om de mogelijkheden voor beeldgeleide patiënt stratificatie en drug delivery 17,18 bieden. De huidige studie bouwt voort op het concept van beeldgeleide toediening van medicijnen aan getriggerde geneesmiddelafgifte uit temperatuurgevoelige liposomen met behulp van een speciaal ontworpen laser gebaseerde verwarming setup onder MR begeleiding te evalueren.
Zoals hierboven vermeld, hebben waterbaden of verwarmen catheters gewoonlijk gebruikt voor subcutane tumoren te verwarmen. Het waterbad methode vereist de onderdompeling van het gehele ledemaat in heet water, resulterend in niet-specifieke geneesmiddelafgifte gehele ledemaat naast de tumorplaats los. Toepassing van een verwarmings- katheter vereist plaatsing van een 18 G katheter in het midden van de tumor en is aangetoond dat verhitting noodzakelijk voor een relatief lange periode (15 min) om een thermische stabiele toestand 11 te bereiken.
In deze studie is het nieuwe laser gebaseerde verwarming opstelling verschaft een conforme manier van het leveren van warmte aan de tumorvolume zoals aangetoond door MR-gebaseerde beoordeling van de temperatuurverdeling kaart (Figuur 5). Heterogeniteit in het PRF-shift kaart in de onverwarmde rechter achterpoot en rechter ledematen tumor in figuur 5 kan een combinatie van lage signaal-ruis in de nabijheid van susceptibiliteit artefacten en geringe fysiologische of vatbare veroorzaakte bewegingen weerspiegelen, die direct kan compromis verwarming en het basislijn registratie, maar ook kleine variaties in te voeren geïnduceerde velden rondgebieden offset magnetische susceptibiliteit. Bovendien werd gevonden dat de thermische steady state kan worden bereikt binnen 1-2 min initiëren verwarming. Ook het punt gebaseerde vezeloptische temperatuursensor toegestaan real-time aanpassing van het laservermogen om de temperatuur op 42 ° C houden en temperatuurschommelingen te minimaliseren. Echter, is het essentieel om de optische sensor te plaatsen in een relatief centrale positie binnen de tumor. MRI kan worden gebruikt om de incisie voor de sensor te valideren. Tijdens het verwarmen, moet het laservermogen zorgvuldig worden aangepast om de temperatuur op 42 ° C te houden met een initiële vermogen van 0,8 W.
De verwarming protocol werd geoptimaliseerd door middel van real-time monitoring van Gd-HP-DO3A vrijkomen als een surrogaat voor de drug CDDP. De effectieve release van ingekapseld agenten uit de HTLC liposomen vertaald in een betere werkzaamheid, met de verwarmde HTLC groep resulteert in een significante therapeutische advantage ten opzichte van andere behandeling en controle groepen 16.
De verlichting van de kookplaat is ontworpen om tumoren van 5-7 mm verwarmen de grootste afmeting. Het ontwerp van het belichtingstoestel kan worden aangepast om grotere tumoren en meerdere glasvezel temperatuursensoren gehele tumorvolume om de temperatuur in vergelijking met de huidige single-point gebaseerde metingen kunnen worden opgenomen warmte. Bovendien, omdat het draagbare apparaat is gemaakt van MR-compatibele materialen, 3-dimensionaal MR temperatuurmeting kan worden uitgevoerd om de temperatuurverdeling in het hele tumorvolume evalueren.
Concluderend, de laser gebaseerde verwarmingsinrichting een waardevol instrument voor preklinische ontwikkeling van temperatuurgevoelige liposoomformuleringen. Beeldgeleide geneesmiddelafgifte benaderingen, zoals die in deze studie, hebben significant potentieel voor klinische toepassing en uitvoering van geneeskunde zoals real-time controle van de therapeutische behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary evaporator | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG | Laborota 4000 | |
| High pressure extruder | Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml thermobarrel |
| Heating circulator | VWR International LLC. | 11305 | Connected to extruder |
| Polycarbonate membrane filter | Whatman | 110605;110606 | |
| Differential scanning calorimeter (DSC) | TA Instruments | Q100 | |
| Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) | PerkinElmer | Optima 7300DV | |
| Zetasizer | Malvern Instruments Ltd. | Nano-ZS | |
| Cell incubator | NuAire Inc. | NU-5800 | |
| Autoclip wound clip applier | Becton Dickinson | 427630 | |
| Autoclip wound clip remover | Becton Dickinson | 427637 | |
| Wound clips | Becton Dickinson | 427631 | 9 mm |
| 763 nm Laser device | Biolitec | Ceralas CD 403 laser | |
| Laser probe | Thorlabs Inc. | FT400EMT | With SMA and flat cleave connectors |
| Spectralon (illuminator) | Labsphere Inc. | FAST-SL-5CMX5CM | |
| CSTM-SL-5CMX5CM | |||
| 7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system | Bruker Corporation | Biospec 70/30 | |
| Fiber optic temperature sensor | LumaSense Technologies Inc. | Luxtron FOT Lab Kit | |
| Integrating sphere | Newport Corporation | 819C | |
| Optical power meter | Newport Corporation | 1830-R |
References
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Releas. 65 (1-2), 271-284 (2000).
- Simard, P., Leroux, J. C., Allen, C., Meyer, O. Liposomes for Drug Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Application. , American Scientific Publishers. (2007).
- O'Brien, M. E. R., et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX (TM)/Doxil (R)) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. Ann Onco. 15 (3), 440-449 (2004).
- White, S. C., et al. Phase II study of SPI-77 (sterically stabilised liposomal cisplatin) in advanced non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 95 (7), 822-828 (2006).
- Laginha, K. M., Verwoert, S., Charrois, G. J. R., Allen, T. M. Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. Clin Cancer Res. 11 (19), 6944-6949 (2005).
- Baronzio, G. F., Hager, E. D. Hyperthermia in cancer treatment: a primer. , Springer Science. (2006).
- Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale Drug Delivery and Hyperthermia: The Materials Design and Preclinical and Clinical Testing of Low Temperature-Sensitive Liposomes Used in Combination with Mild Hyperthermia in the Treatment of Local Cancer. Open Nanomed. 3, 38-64 (2011).
- Celsion Corporation. , Celsion Announces Updated Overall Survival Data from HEAT Study of ThermoDox http://investor.celsion.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=862248 (2014).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., ten Hagen, T. L. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27 (8), 1750-1754 (2010).
- Viglianti, B. L., et al. In vivo monitoring of tissue pharmacokinetics of liposome/drug using MRI: illustration of targeted delivery. Magn Reson Me. 51 (6), 1153-1162 (2004).
- Ponce, A. M., et al. Magnetic resonance imaging of temperature-sensitive liposome release: drug dose painting and antitumor effects. J Natl Cancer Ins. 99 (1), 53-63 (2007).
- Kong, G., et al. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor xenograft model: importance of triggered drug release. Cancer Res. 60 (24), 6950-6957 (2000).
- Yarmolenko, P. S., et al. Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours. Int J Hyperthermia. 26 (5), 485-498 (2010).
- Wang, L. H., Jacques, S. L., Zheng, L. Q. MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Comput Meth Prog Bio. 47, 131-146 (1995).
- Rieke, V., Butts Pauly, K. MR thermometry. J Magn Reson Imaging. 27 (2), 376-390 (2008).
- Dou, Y. N., et al. Heat-activated thermosensitive liposomal cisplatin (HTLC) results in effective growth delay of cervical carcinoma in mice. J Control Release. 178, 69-78 (2014).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol Pharm. 7 (6), 1899-1912 (2010).
- Lee, H., et al. A novel 64Cu-liposomal PET agent (MM-DX-929) predicts response to liposomal chemotherapeutics in preclinical breast cancer models. Thirty-Fifth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium. , (2012).
