Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

doi: 10.3791/53055 Published: December 13, 2015

Summary

Ein MRI-kompatiblen maßgeschneiderten Laserbasis Heizvorrichtung wurde entwickelt, um eine lokale Erwärmung der subkutanen Tumoren um die Freisetzung von Wirkstoffen aus wärmeempfindlichen Liposomen gezielt an der Tumorregion aktivieren bereitzustellen.

Abstract

Liposomen als Arzneimittelabgabesysteme eingesetzt worden, um feste Tumore durch Ausbeutung der erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung was zu erheblichen Verringerungen der systemische Toxizität zu zielen. Dennoch hat unzureichende Freisetzung von verkapselten Arzneimittels aus Liposomen ihre klinische Wirksamkeit begrenzt. Temperaturempfindliche Liposome wurden entwickelt, um ortsspezifische Freisetzung des Arzneimittels, um das Problem der begrenzten Tumor-Medikament Bioverfügbarkeit zu überwinden. Unser Labor hat entworfen und entwickelt eine wärmeaktivierte wärmeempfindliche Liposomenformulierung von Cisplatin (CDDP), wie HTLC bekannt, um ausgelöste Freisetzung von CDDP bei soliden Tumoren bereitzustellen. Wärmeaktivierte Lieferung in vivo wurde in Mausmodellen mit einem speziell angefertigten laserbasierten Heizvorrichtung, die eine konforme Heizmuster bietet am Ort des Tumors, wie durch MR-Thermometrie (MRT) bestätigt erzielt. Eine faseroptische Temperaturüberwachungseinrichtung verwendet, um die Temperatur in Echtzeit zu messen,während der gesamten Heizperiode mit Online-Anpassung der Wärmeabgabe durch den Wechsel der Laserleistung. Arzneimittelabgabe wurde unter Magnetresonanz (MR) Bildführung durch Co-Einkapselung eines MR-Kontrastmittels (dh Gadoteridol) zusammen mit CDDP in die wärmeempfindlichen Liposomen als Mittel, um die Hitzeprotokoll zu validieren und Tumorakkumulation beurteilen optimiert. Das Erhitzen Protokoll bestand aus einer Vorwärmzeit von 5 min vor der Verabreichung des HTLC und 20 Minuten Erhitzen nach der Injektion. Diese Erwärmung Protokoll ergab eine wirksame Freisetzung der eingekapselten Wirkstoffe mit dem höchsten im Vergleich zum unbeheizten Tumor und Muskel im beheizten Tumors beobachtet MR Signaländerung. Diese Studie zeigte die erfolgreiche Anwendung des laserbasierten Heizvorrichtung für die präklinische Entwicklung wärmeempfindliches Liposom und die Bedeutung der MR-gesteuerte Validierung des Heizprotokoll zur Optimierung der Arzneimittelabgabe.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die Pathophysiologie von soliden Tumoren ergibt die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) von nanoskaligen Systemen. Dies hat zu der Entwicklung von vielen Arzneistoffabgabesysteme, die die Vorteile dieses Effektes, das Tumorgewebe gezielt unter Minimierung systemischen Nebenwirkungen 1 geführt. Liposomalen Verabreichungstechnologien wurden weitgehend für Arzneimittel oder bildgebende Sonden 2 untersucht. Obwohl Liposomen deutlich gegenüber einer herkömmlichen Chemotherapie reduziert die systemische Toxizität, gab es einige Verbesserungen der klinischen Wirksamkeit 3,4. Studien haben gezeigt, dass die begrenzte Wirksamkeit aufgrund des Fehlens der Arzneimittelfreisetzung aus dem Träger 4,5 ist. Als Ergebnis wurde die Entwicklung von Liposomen, die aktiviert werden, um das eingekapselte Arzneimittel in Reaktion auf äußere Reize frei beträchtliche Aufmerksamkeit erregt. Hyperthermie ist seit Jahrzehnten als eine relativ sichere Behandlungsmethode für Krebspatienten, 6 eingesetzt. Deshalb ist die Entwicklunglung von wärmeempfindlichem Liposomen mit Wärme als ein externes Trigger hat eine logische Kombination mit beträchtlicher Bedeutung für die klinische Übersetzung. Tatsächlich hat die Lysolipid enthaltenden thermo Liposomformulierung Doxorubicin, wie LTSL-DOX war, nun erreichte klinische Bewertung 7.

Neuere klinische Daten mit LTSL-DOX hat gezeigt, dass das Protokoll für die Wärmeabgabe ist ein kritischer Faktor, die Behandlungsergebnisse 8 stark beeinflussen können. Beim Menschen sind Radiofrequenz, Mikrowelle, Laser- und Ultraschallwandler verwendet, um Hyperthermie lokal an Tumorstellen 9 anzuwenden. In präklinischen Studien Erwärmung der subkutanen Tumoren erforderlich sind Heizung Kathetern 10,11 und Wasserbäder 12,13 am häufigsten eingesetzt wird. In diesem Manuskript, führen wir eine neue Methode zum Erwärmen subkutane Tumoren unter Verwendung eines kundenspezifischen Laser-basierten Setup-Heizung, die mehr konforme Erwärmung des Tumorvolumens ermöglicht. Verwenden von MR-kompatible mastoffe, ist die Einrichtung klein genug, um innerhalb der Bohrung eines kleinen Tieres MR Imager passt, um sich in Echtzeit-Überwachung von Veränderungen in der Gewebetemperatur während der Lasererhitzung.

Das MR-Kontrastmittels, Gadoteridol (Gd-HP-DO3A), wurde mit CDDP zusammen verkapselt sind, in einer wärmeempfindlichen Liposomformulierung CDDP (HTLC) wie Gd-HTLC bekannt, Echtzeit-MR bildgeführte Überwachung und Bewertung der Wärme -aktivierten Wirkstofffreisetzung und Validierung der Heizungs Protokoll. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das laserbasierte Heizvorrichtung effizient aktiviert die Freisetzung von eingekapselten Mitteln aus dem Gd-HTLC Formulierung, während sie durch MR-Bildgebung überwacht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Liposomen-Herstellung

  1. Löse den Lipiden 1,2-Dipalmitoyl- sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-Phosphatidylcholin (MSPC oder S-Lyso-PC) und N - (Carbonyl- Methoxypolyethylenglykol 2000) -1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamin (mPEG 2000 -DSPE) in Chloroform. Beispielsweise für die Herstellung von 10 ml HTLC abzuwiegen 314,4 mg DPPC, 39,4 mg MSPC und 83,9 mg mPEG 2000 -DSPE in eine Braunglasampulle. Dann lösen sich die Lipide in 2 ml Chloroform und erwärmen das Fläschchen für 30 s in einer 60 ° C warmen Wasserbad.
  2. Entfernen des Chloroforms am Rotationsverdampfer. Legen Sie die resultierende Lipidfilm unter Hochdruck-Vakuum-O / N.
  3. 10 ml HTLC, Hydrat der Lipidfilm mit 5 ml 0,1 N Tris-Puffer (pH 7,4) für 1 Std. Zur gleichen Zeit, wiegen 162,4 mg 1,2-Dipalmitoyl--sn-glycero-3-Phosphoglycerin (DPPG) Lipid und 100 mg CDDP Pulver und Hydrat with 5 ml 0,1 N Tris-Puffer, enthaltend 30% Ethanol (pH 7,4) für 1 Stunde.
  4. Für die Gd-HTLC Formulierung abzuwiegen die gleiche Menge an DPPG Lipid und 10 mg CDDP Pulver, dann Hydrat mit 2,5 ml Gd-HP-DO3A Lösung (279,3 mg / ml) plus 2,5 ml 0,1 N Tris-Puffer, enthaltend 30% Ethanol ( pH 7,4) für 1 Stunde. Während der Hydration sind die Mischungen in Braunglasfläschchen aufbewahrt und auf einer Heizplatte bei 70 ° C unter konstantem Rühren und Vortexen alle 10 Minuten gesetzt werden.
  5. Kombinieren Sie die Lipidmischung und die Lipid-Wirkstoff-Mischung, wieder Hydrat für 1 Stunde. Vortex alle 15-20 min.
  6. Montieren Sie die 10-ml-Extruder mit zwei Stapel von 200 nm Polycarbonatfilter. Verbinden den thermobarrel des Extruders zu einem zirkulierenden Wasserbad bei 70 ° C und eine Verbindung dem Extruder in einer komprimierten Stickstofftank.
  7. Unmittelbar nach der Hydration, übertragen Sie die Mischung in den Extruder Kammer. Öffnen Sie den Stickstoffstrom (set Druck auf 200 psi), um die Liposomen durch die Membranen zu extrudieren. Sammeln Sie die Liposomes in ein 50 ml Röhrchen. Halten des Rohres in ein heißes Wasserbad (70 ° C) zu jeder Zeit während des Extrusionsprozesses. Wiederholen Sie diesen Vorgang 5 mal.
  8. Demontieren Sie den Extruder und wechseln Sie in zwei Stapel von 100 nm Polycarbonatfilter. Montieren Sie den Extruder und setzen Sie den Druck auf 400 psi. Wiederholen Sie Schritt 5, mit der Ausnahme, extrudieren die Liposomen 10 mal. Die Probe wird aus dem endgültigen Extrusion in einen 15-ml-Tube.
  9. Cool down der Liposomen auf RT und Zentrifuge bei 1.000 × g für 3 min, um unlösliche CDDP auszufällen.
  10. Dialysieren der Liposomen O / N gegen 0,9% Salzlösung in Dialyseschläuchen mit einer 15.000 Molekulargewichtsgrenze (MWCO) unter sterilen Bedingungen.
  11. Verdünnen Sie 10 ul der Liposomen in 990 & mgr; l destilliertem Wasser. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung, um die Größenverteilung der HTLC und Gd-HTLC messen. Führen Sie 3 Messungen mit je 10 Läufe.
  12. Verdünnen von 40 ul der Liposomen in 3.960 & mgr; l destilliertes Wasser. Machen 5-6 Standardlösungen von Platin und Gadoliniumim Konzentrationsbereich von 0,1 bis 20 & mgr; g / ml. Messung der Platin und Gadoliniumkonzentrationen mit induktiv gekoppelten Plasma-Atomemissionsspektrometer (ICP-AES) bei 3 verschiedenen Wellenlängen. Führen Sie 3 Messungen bei jeder Wellenlänge für durchschnittliches Ergebnis.
  13. Bestimmen das Gel flüssigkristallinen Phasenübergangstemperatur (T m) der HTLC Liposomenformulierung unter Verwendung eines Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC). Last 5-10 mg HTLC in eine DSC-Wanne und eine leere Pfanne als Referenz. Verwenden einer Scanrate von 5 ° C / min von 0 ° C Rampe bis die Temperatur auf 60 ° C.
  14. Wickeln Sie die Liposomen in Alufolie, um Belichtung und bei 4 ° C zu vermeiden.

2. in vitro-Freisetzung von Liposomen

  1. Bereiten Spinsäulen.
    1. Inkubieren Sie 50 g Gelfiltration Perlen in 400 ml 0,9% Kochsalzlösung bei Raumtemperatur für 3-4 Stunden. Roll up ein Stück Glaswolle, nass mit 0,9% Salzlösung und legen Sie sie in die Spitze einer 1 ml Spritze. Drücken Sie die Glaswolle auf etwa 0,05 bis 0,1 ml der Spritze zu füllen. Verwenden Sie eine Glaspipette auf etwa 1 ml Gelfiltrationsmedien in die Spritze nach und nach hinzufügen.
    2. Legen Sie die Spritze in einen 15-ml-Tube und zentrifugieren bei 1.000 × g für 3 min. Entfernen Sie die Spin-Säule und legen Sie sie in einen 15-ml-Tube.
  2. Probe 400 ul HTLC oder Gd-HTLC in 8 1-Dram-Glasfläschchen und Inkubieren in einem temperaturkontrollierten Wasserbad bei entweder 37 ° C oder 42 ° C. Nehmen Sie ein Fläschchen zu jedem Zeitpunkt (dh, 5, 15, 30 und 60 min) und sofort legen Sie es auf Eis.
  3. 100 l 0,9% Kochsalzlösung in den vorbereiteten Spin-Säule, dann wurden 100 ul HTLC oder Gd-HTLC hinzuzufügen vor der Inkubation (Kontrolle) oder nach Inkubation im Wasserbad in die Spin-Säule. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 min. Entfernen der Spritze aus der Röhre und verdünnt die Lösung in dem Rohr für ICP-AES-Analyse.

3. Die Implantation von subkutanen Xenotransplantat von GebärmutterhalskrebsTumor

  1. Alle tierexperimentellen Studien wurden nach Tiernutzung Protokolle von der Animal Care Committee der University Health Network (UHN) genehmigt durchgeführt.
  2. Führen Sie alle tierexperimentellen Studien in einer Sicherheitswerkbank (BSC). Autoklaven alle chirurgische Instrumente vor jeder Operation. Nach jeder Operation, wischen Sie die chirurgische Werkzeuge mit 70% Ethanol und sterilisieren wieder unter Verwendung eines heißen Perle Sterilisator.
  3. Um Sterbehilfe, legen Sie das Tier in einem isolierten CO 2 Kammer, führen Genickbruch.
  4. Für eine Vollnarkose mit 100% Sauerstoff, verwenden Sie 5% Isofluran für die Induktion und 2% für die Wartung. Um die Tiefe der Anästhesie zu gewährleisten, wenden Sie Druck mit einer Pinzette nach Palmar Oberfläche der Fußsohle zu Tier Reaktion zu beobachten. Bewerben Augen Schmierstoff bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  5. Für ein Tier, das Operation unterzogen hat, legen Sie das Tier in einem sauberen Käfig ohne die Gesellschaft von anderen Tieren. Überwachen, bis genügend Bewusstsein wiedererlangt.
  6. KulturDie ME-180-Zellen in Alpha-Minimalmedium (α-MEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika ergänzt.
  7. Ernten Sie die Zellen und die Zellen in komplettem Medium zu halten vor der Impfung. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
  8. Zu impfen jedes Spender Maus, um eine intramuskuläre (im) ME-180 (humanes Zervixkarzinom-Zellen) Tumor zu tragen.
    Hinweis: Das Wachstum in der im Ort ist, um die Entwicklung von Tumoren gut vaskularisiert sicherzustellen ausgewählt. Kauf weiblichen SCID-Mäusen (im Alter von 6-8 Wochen, ca. 20 g) von einer Inhouse-Zuchtanlage.
    1. Anesthetize einen weiblichen SCID-Maus und spritzen 1 x 10 6 ME-180-Zellen in den Gastrocnemius-Muskel der Hintergliedmaße mit einer 27 G-Nadel.
    2. Messen der Tumorgröße mit einem Bremssattel, bis die Tumoren 9-12 mm in ihrer längsten Dimension erreicht. Beenden Sie die Studie, wenn der Tumor 12 mm überschritten hat, oder wenn die Tumormasse beeinträchtigt normales Verhalten, Gehfähigkeit, Futter- und Wasseraufnahme.
  9. Implant Tumorstücke aus Spendermäusen in Empfängermäuse.
    1. Anesthetize eine Spendermaus mit 5% Isofluran. Euthanize die Maus mit Genickbruch unter Narkose. Entfernen Sie das Geber Tumor aus der Spendermaus. Schneiden Sie den Tumor in Kubik Fragmente von 2-3 mm 3.
    2. Anesthetize eine Empfängermaus mit 5% Isofluran. Injizieren 100 ul 0,5 mg / ml Meloxicam subkutan vor der Operation. Bewerben Jod chirurgischen Scheuerlösung, dann 70% Ethanol und schließlich Jodlösung auf die rasierte Haut. Rasieren Sie die linke Hinterbein des Empfängers Maus. Einen Einschnitt auf der Ebene der Haut. Stecken Sie ein Spendertumorstück subkutan durch den Einschnitt. Schließen Sie den Schnitt mit 1-2 Wundklammer (n).
    3. Entfernen Sie die Clips von 3-5 Tagen nach der Implantation. Subkutanen Tumor ist für die Verwendung der laserbasierten Heizungs Einrichtung erforderlich.
    4. Erlauben Tumoren, für 2-3 Wochen Wärmebehandlung wachsen.

4. Entwurf, AssemBly und Kalibrierung eines Conformal Laser Liefer Illuminator für In-vivo-Heizung

  1. Gewebeerwärmung zu erreichen unter Verwendung eines 763 nm-Diodenlaser, um eine konforme Illuminator Verwendung einer optischen Faser gekoppelt ist.
    1. Der Illuminator bietet einheitliche oberflächliche Laserbeleuchtung des Tumors Xenograft. Es besteht aus einem 30 x 20 x 17 mm-Block aus hoch reflektierendem Material, das drei beige- fügtem Lichtintegrationskammer Kugeln mit einer Kammer in der Mitte (16 mm Durchmesser) und 2 kleine Kammern auf beiden Seiten (16 mm Länge und 5 mm besteht im Durchmesser) (Abbildung 1).
    2. Damit Licht, um von einer Kammer in die andere übergeben wurden zwei kleine Löcher mit einem Durchmesser von 5 mm zwischen den kleinen äußeren Kammern und dem größeren mittleren Kammer geschnitten. Licht von dem Laser in die äußeren Kammern mit einem 400 & mgr; m Schnittende Faser zu dem Laser, der in die Kammer durch ein 600 & mgr; m Durchmesser Loch geführt angeschlossen geliefert.
    3. Aufgrund der Natur des Lichtes interaction mit den Kammerwänden ist das Licht in einer der kleinen Kammern geliefert räumlich homogenisiert dann durch die Innenöffnungen in der größeren Kammer, wo es weiter räumlich homogenisiert. Licht tritt dann aus dem Durchmesser von 10 mm-Anschluss an der mittleren Kammer.
  2. Kalibrieren Sie das Hilfslicht Lieferung in Bezug auf die Laserleistungseinstellung mit einem NIST kalibriert 50 mm Ulbrichtkugel, um die abgegebene Leistung zu messen.
    1. Berechnen Sie die Lichtverteilung im Tumor mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen auf Basis einer vereinfachten Geometrie des Tumors. Generieren Sie die Monte-Carlo-Code in einem benutzerdefinierten Algorithmus mit einem kommerziellen Computersoftwarepaket und Basis auf dem Standard-Code des Monte-Carlo-Modellierung von Lichttransport in mehrschichtigen Geweben von Jacques et al. 14 geschrieben.
    2. Modell der Tumor als eine Halbkugel, die auf einem flachen Hautlinie mit einem Durchmesser entsprechend der durchschnittlichen Tumor Dimension 7 mm an der Hautoberfläche und eine eright von 5 mm. Modell homogenen Beleuchtung der Oberfläche durch zufälliges Starten Photonen ganzen exponierten Hemisphäre und direkt im Zentrum der Kugel.
    3. Verwenden optischer Eigenschaften, einschließlich Absorption, & mgr; a = 0,025 mm -1, Streuen, = μ s 10 mm -1, Anisotropiefaktor g = 0,9 und der Brechungsindex n = 1,4. Verwenden einer Million Photonen in der Berechnung.
    4. Führen Sie diese Messungen vor allen in vivo Experimenten Heizung ohne weitere Änderungen, die nach anfänglichen Kalibrierung.

5. Conformal Heizung der Tumor mit Maßgeschneiderte Laserkammer-Setup

  1. Verbinden eines Endes eines Laserfaser an den Laser-Gerät und dem anderen Ende an dem Illuminator.
  2. Betäuben das Tier unter Verwendung von 5% Isofluran. Legen Sie eine 27 G Injektionskatheter in die laterale Schwanzvene der Maus. Legen Sie eine 22 G-Katheter in das Zentrum des Tumors. Legen Sie einen faseroptischen Temperatur probe in den hohlen Katheter auf eine Temperaturänderung zu überwachen.
  3. Decken die gesamte Tumor mit der Beleuchtungseinrichtung (Abbildung 2). Stellen Sie zuerst die Macht, 0,8-1 W. Schalten Sie den Laser und warten Sie, die Temperatur zu steigen. Pflegen Sie die Temperatur des Tumors bei 42 ° C von der manuellen Einstellung der Laserleistung zwischen 0,1 bis 0,8 W.

6. Temperaturverteilung ausgewertet Durch MR-Temperaturmessung (MRT)

  1. Messen der Temperaturverteilung der beheizten Tumor mit der lasergestützten Erwärmung Konfiguration durch Protonenresonanz-Frequenzverschiebung (PRF-Verschiebung) MRT auf einem 7-Tesla-MR-Bildgebungssystem präklinischen 15 in Verbindung mit der faseroptischen Temperaturfühler Messungen.
  2. Erwerben Thermometrie Bilder in 10 Sekunden-Intervallen mit Hilfe eines 2D-FLASH-Impulsfolge (Echozeit 4,5 ms, Wiederholungszeit 156,25 ms) mit 312 x 312 & mgr; m in-plane-Auflösung und 2 mm Schichtdicke in einer einzigen Scheibe auf der Ebene der Faseroptik TemperaturprofilSein.

7. MR Überwachung der Wirkstofffreisetzung

  1. Führen T 1 -gewichteten Bildgebung vor und 20 Minuten nach der Verabreichung von Gd-HTLC.
  2. Implantat zwei Tumoren, eine auf jeder der Hinterbeine eines weiblichen SCID-Maus unter Verwendung der oben in Abschnitt 3 zur Implantation beschriebenen Verfahrens. Vorwärmen der Tumor am linken hinteren Gliedmaßen für 5 min bei 42 ° C vor der Injektion von Gd-HTLC mit einer Dosis von 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A und 1,4 mg / kg CDDP, dann Hitze des Tumors für weitere 20 min nach der Injektion. Führen Einspritzung während Wärmebehandlung. Verwenden Sie den Tumor am rechten Hinterbein nach einem unbeheizten Kontrolle.
  3. Erwerben dynamischen MR-Bilder (36 x 20 mm Feld-of-view, 200 x 200 um Auflösung in der Ebene, 2 mm Schichtdicke; MR-Sequenz-Protokoll), um Gd-HP-DO3A Release bei 12 Sekunden-Intervallen für den gesamten 20 Minuten überwachen nach der Verabreichung von Gd-HTLC, beginnend 30 Sekunden vor der Injektion.
  4. Kontur des Tumors (beheizt und unbeheizt) und Muskelvolumen.Berechnen Sie die mittlere MR-Signal aller Voxel in jedem konturierte Volumen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die HTLC Liposomen werden unter Verwendung üblicher Verfahren, einschließlich Lipidfilmbildung, Hydratation, Extrusion und Dialyse hergestellt. Während der Schritte mit CDDP ist Vorsicht geboten, nicht eingenommen werden, um CDDP zu jedem Aluminium-Material freizulegen, wie CDDP wird durch die Bildung eines schwarzen Niederschlag deaktiviert werden. Eine Abbildung der HTLC ist in Abbildung 3 dargestellt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der HTLC wurden in einer Handschrift vor kurzem veröffentlicht in der Zeitschrift der Controlled Release 16 zusammengefasst. Gadolinium-und Platin-Konzentrationen des Gd-HTLC Formulierung geeignet sind 1,87 ± 0,28 mg / ml und 0,10 ± 0,02 mg / ml.

Die Beleuchtung des laserbasierten Heizungs Setup verwendet drei kleinen, verbundenen Kammern, die eine homogene Lichtverteilung (± 15%) an der 10 mm Austrittsdurchmesser Anschluss liefern. Abhängig von der eingestellten Leistung des Lasers wird Energie in einem Bereich von 0,5 bis 1,7 W / cm 2 geliefert wird, als Maßnahmed mit einem kalibrierten Ulbrichtkugel. Die Ergebnisse sind in Figur 4 als Querschnitt durch den Tumor gezeigt. Unter der Annahme einer Gesamtleistung von 1 W, die maximale Fluenz an jedem Punkt des Tumors 70 mW / cm 2. Die Laserleistung nimmt um einen Faktor von 2 auf der Hautebene im Vergleich zum Spitzen Fluenz knapp unterhalb der Tumoroberfläche.

Heizung mit Hilfe der laserbasierten Heizungs Setup erzeugt eine relativ gleichmäßige Temperaturverteilung Karte, wie sie in der PRF-shift MRT (Abbildung 5) bestätigt. PRF-shift MRT verfolgt den relativen Temperaturänderung von einer absoluten Nullmessung vor dem Erhitzen durch die Punktquelle (dh faseroptischen Temperatursensor) erworben.

Von MR-Signalanalyse (6C), zeigt das beheizte Tumor die höchste relative Signalanstieg im Vergleich zu der unbeheizten Tumor und Muskel nach Gabe von Gd-HTLC, die bis zum Ende gehalten wirdder Heizperiode.

Abbildung 1
Abbildung 1. Design der Beleuchtungseinrichtung. (A) Abmessungen der Beleuchtungseinrichtung. (B) Abmessungen der Innenkammern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Illustration der laserbasierten Heizungs Setup zusammen mit einer Vorrichtung zur Temperaturüberwachung. Ein Laserfaser (blaue Linie) liefert Licht an der Beleuchtungseinrichtung. Eine faseroptische Temperatursonde (gelbe Linie) wurde durch eine 22 G-Katheter in das Zentrum des Tumors platziert auf eine Temperaturänderung zu überwachen. Echtzeit-Launetur Messwerte werden auf dem Computerbildschirm angezeigt. Geändert von Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3 Schematische Darstellung der HTLC Formulierung (nicht maßstabsgetreu). Die Lipidzusammensetzungen, CDDP Konzentration und Größe der HTLC Liposomen werden veranschaulicht. Geändert von Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Modeling hell Lieferung an Tumor mit kleinen Ulbrichtkugel. (A) Schematische Darstellung des Modells, das Tumor über dem normalen darunter liegende Gewebe erhöht. Rote Pfeile Abdeckung und die Richtung der anfänglichen Photonen in der Berechnung. Beleuchtung deckt die gesamte Fläche des erhöhten Tumor. (B) Ergebnisse der Berechnung, die Licht Fluenzverteilung im Tumor. (C) Querschnitts Grundstück von Lichtfluss als Funktion der Tiefe entlang der weißen gestrichelten in (B) gezeigten Linie. Fluenzrate im Tumor an der Hauttiefe beträgt 50% der maximalen Fluenzrate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Temperaturverteilung durch MR-Thermometrie ausgewertet. &# 160;. (A) T 2 -gewichteten Bild, das die anatomische Lage der beiden bilateral implantierten Tumoren (B) Temperaturverteilungskarte vom Erhitzen der linken Tumor auf 42 ° C unter Verwendung der laserbasierten Heizungs Setup generiert, während die rechte Tumor blieb unbeheizt. Daten aus Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78 erneut analysiert. 16 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. MR Überwachung Gadoteridol Freisetzung aus den Gd-HTLC Liposomen bei Wärmeaktivierung. T 1 -gewichteten MR-Bilder (gleiche Fenster Ebene angewendet) einer Maus, die zwei subkutane ME-180-Tumoren, mit einem an jedem der Hinterbeine ( A) vor der Injektion von Gd-HTLC und(B) 20 min nach der Injektion von Gd-HTLC (dh nachdem die gesamte Heizperiode). (C) Relative MR Signal ändert normiert auf den ersten Zeitpunkt der dynamischen MR Nahme der Maus in (A) und ( B). Die Daten stellen Mittelwert ± SD. Daten aus Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78 erneut analysiert. 16 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Liposomen wurden in den 1960er Jahren als Arzneimittelabgabevehikel, die hydrophilen Arzneimitteln in ihrem inneren wässrigen Volumen und hydrophobe Arzneimittel in ihrer Lipiddoppelschicht 2 tragen entwickelt. Zusätzlich zu in therapeutischen Anwendungen zu verwenden, wurden Liposomen zur diagnostischen Anwendungen untersucht worden, wenn sie mit Radionukliden markiert oder mit Bildgebungskontrastmittel 17 geladen. In den letzten Jahren theranostics und therapeutischen Diagnosepaaren verfolgt worden, um Möglichkeiten für bildgeführte Stratifizierung von Patienten und Verabreichungs 17,18 bereitzustellen. Die aktuelle Studie baut auf dem Konzept der Bild-geführte Arzneimittelabgabe an getriggerte Wirkstofffreisetzung aus thermosensitiven Liposomen mit einem speziell angefertigten laserbasierten Heizungs Setup unter MR Führung zu bewerten.

Wie oben erwähnt, haben Wasserbädern oder Erwärmen Kathetern häufig verwendet worden, um die subkutane Tumoren zu erhitzen. Das Wasserbad Verfahren erfordert das Eintauchen der gesamten Extremität in heißem water, was zu einer nicht-spezifischen Wirkstofffreisetzung in der gesamten Extremität neben an der Tumorstelle freisetzen. Verwendung einer Heizungskatheters erfordert die Platzierung einer 18 G Katheters im Zentrum des Tumors, und es wurde gezeigt Erwärmung für einen relativ langen Zeitraum (15 min), um eine thermische Gleichgewichtszustand 11 erreicht erfordern.

In der vorliegenden Studie, bietet die neu gestaltete laserbasierten Heizungs Setup eine konforme Art und Weise der Bereitstellung von Wärme an das Tumorvolumen, wie durch MR-basierte Beurteilung der Temperaturverteilungskarte (Abbildung 5) demonstriert. Heterogenität in der PRF-Schaltkennfeld in der unbeheizten rechten Hinterbein und rechten Schenkel Tumor in Abbildung 5 kann eine Kombination aus Low-Signal-zu-Rausch in der Nähe der Suszeptibilitätsartefakte und leichten physiologischen oder Heizung-induzierte Bewegungen zu reflektieren, das direkt könnte Kompromiss Heizung und Bildbaseline Registrierung, sondern auch leichte Variationen einführen induzierten Feldern rund umRegionen der Offset der magnetischen Suszeptibilität. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die thermische Gleichgewichtszustand kann innerhalb von 1-2 min initiieren Heizung erreicht werden. Auch das punktbasierte faseroptischen Temperatursensor für Echtzeit-Anpassung der Laserleistung erlaubt, um die Temperatur auf 42 ° C gehalten wird und gegenüber Temperaturschwankungen zu minimieren. Jedoch ist es wichtig, den faseroptischen Temperatursensor in einer relativ zentralen Stellung innerhalb des Tumors zu platzieren. MR-Bildgebung verwendet werden, um die Einschnittstelle für den Sensor zu validieren. Beim Erhitzen, sollte die Laserleistung sorgfältig eingestellt werden, um die Temperatur auf 42 ° C mit einer Anfangsleistung von 0,8 W. aufrechtzuerhalten

Die Heizung-Protokoll wurde durch die Echtzeit-Überwachung von Gd-HP-DO3A Mitteilung als Surrogat für das Medikament CDDP optimiert. Die effektive Freisetzung von verkapselten Wirkstoffe aus den HTLC Liposomen in verbesserte Wirksamkeit übersetzt, mit dem erhitzten HTLC Gruppe was zu einer signifikanten therapeutischen ADVANtage über anderen Behandlungs- und Kontrollgruppen 16.

Der Illuminator der Heizvorrichtung wurde entwickelt, um Tumoren von 5-7 mm in der größten Abmessung zu erhitzen. Die Konstruktion der Beleuchtungs könnte modifiziert werden, um größere Tumore und mehrere faseroptische Temperatursensoren könnten in der gesamten Tumorvolumen auf Temperatur im Vergleich zu dem aktuellen Einzelpunkt-basierte Messung überwachen eingefügt erhitzen. Zusätzlich kann, da die tragbare Vorrichtung aus MR-kompatiblen Materialien, die 3-dimensionale NMR-Thermometrie könnte durchgeführt werden, um die Temperaturverteilung über das gesamte Tumorvolumen zu bewerten.

Zusammenfassend stellt die Laser-basierten Heizvorrichtung ein wertvolles Werkzeug für die präklinische Entwicklung von wärmeempfindlichen Liposomenformulierungen. Bildgeführten Arzneimittelabgabe Ansätze, wie die in dieser Studie verwendet wurden, eine signifikante Bedeutung für die klinische Übersetzung Umsetzung personalisierte Medizin einschließlich Echt time Überwachung der therapeutischen Behandlung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotary evaporator Heidolph Instruments GmbH & Co.KG Laborota 4000
High pressure extruder Northern Lipids Inc. T.001 10 ml thermobarrel
Heating circulator VWR International LLC. 11305 Connected to extruder
Polycarbonate membrane filter Whatman 110605;110606
Differential scanning calorimeter (DSC) TA Instruments Q100
Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) PerkinElmer Optima 7300DV
Zetasizer Malvern Instruments Ltd. Nano-ZS
Cell incubator NuAire Inc. NU-5800
Autoclip wound clip applier Becton Dickinson 427630
Autoclip wound clip remover Becton Dickinson 427637
Wound clips Becton Dickinson 427631 9 mm
763 nm Laser device Biolitec Ceralas CD 403 laser
Laser probe Thorlabs Inc. FT400EMT With SMA and flat cleave connectors
Spectralon (illuminator) Labsphere Inc. FAST-SL-5CMX5CM
CSTM-SL-5CMX5CM
7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system Bruker Corporation Biospec 70/30
Fiber optic temperature sensor LumaSense Technologies Inc. Luxtron FOT Lab Kit
Integrating sphere Newport Corporation 819C
Optical power meter Newport Corporation 1830-R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Releas. 65, (1-2), 271-284 (2000).
  2. Simard, P., Leroux, J. C., Allen, C., Meyer, O. Liposomes for Drug Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Application. American Scientific Publishers. (2007).
  3. O'Brien, M. E. R., et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX (TM)/Doxil (R)) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. Ann Onco. 15, (3), 440-449 (2004).
  4. White, S. C., et al. Phase II study of SPI-77 (sterically stabilised liposomal cisplatin) in advanced non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 95, (7), 822-828 (2006).
  5. Laginha, K. M., Verwoert, S., Charrois, G. J. R., Allen, T. M. Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. Clin Cancer Res. 11, (19), 6944-6949 (2005).
  6. Baronzio, G. F., Hager, E. D. Hyperthermia in cancer treatment: a primer. Springer Science. (2006).
  7. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale Drug Delivery and Hyperthermia: The Materials Design and Preclinical and Clinical Testing of Low Temperature-Sensitive Liposomes Used in Combination with Mild Hyperthermia in the Treatment of Local Cancer. Open Nanomed. 3, 38-64 (2011).
  8. Celsion Corporation. Celsion Announces Updated Overall Survival Data from HEAT Study of ThermoDox http://investor.celsion.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=862248 (2014).
  9. Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., ten Hagen, T. L. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, (8), 1750-1754 (2010).
  10. Viglianti, B. L., et al. In vivo monitoring of tissue pharmacokinetics of liposome/drug using MRI: illustration of targeted delivery. Magn Reson Me. 51, (6), 1153-1162 (2004).
  11. Ponce, A. M., et al. Magnetic resonance imaging of temperature-sensitive liposome release: drug dose painting and antitumor effects. J Natl Cancer Ins. 99, (1), 53-63 (2007).
  12. Kong, G., et al. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor xenograft model: importance of triggered drug release. Cancer Res. 60, (24), 6950-6957 (2000).
  13. Yarmolenko, P. S., et al. Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours. Int J Hyperthermia. 26, (5), 485-498 (2010).
  14. Wang, L. H., Jacques, S. L., Zheng, L. Q. MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Comput Meth Prog Bio. 47, 131-146 (1995).
  15. Rieke, V., Butts Pauly, K. MR thermometry. J Magn Reson Imaging. 27, (2), 376-390 (2008).
  16. Dou, Y. N., et al. Heat-activated thermosensitive liposomal cisplatin (HTLC) results in effective growth delay of cervical carcinoma in mice. J Control Release. 178, 69-78 (2014).
  17. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol Pharm. 7, (6), 1899-1912 (2010).
  18. Lee, H., et al. A novel 64Cu-liposomal PET agent (MM-DX-929) predicts response to liposomal chemotherapeutics in preclinical breast cancer models. Thirty-Fifth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium. (2012).
Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dou, Y. N., Weersink, R. A., Foltz, W. D., Zheng, J., Chaudary, N., Jaffray, D. A., Allen, C. Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance. J. Vis. Exp. (106), e53055, doi:10.3791/53055 (2015).More

Dou, Y. N., Weersink, R. A., Foltz, W. D., Zheng, J., Chaudary, N., Jaffray, D. A., Allen, C. Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance. J. Vis. Exp. (106), e53055, doi:10.3791/53055 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter