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Bioengineering

चुंबकीय अनुनाद छवि मार्गदर्शन के साथ थर्मल Liposomes से Cisplatin की उत्प्रेरित रिलीज के लिए कस्टम डिजाइन लेजर आधारित ताप उपकरण

doi: 10.3791/53055 Published: December 13, 2015

Summary

एक एमआरआई-संगत कस्टम डिजाइन लेजर आधारित हीटिंग उपकरण विशेष रूप से ट्यूमर के क्षेत्र में थर्मल लिपिड से एजेंटों की रिहाई सक्रिय करने के लिए चमड़े के नीचे ट्यूमर के स्थानीय हीटिंग प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है।

Abstract

Liposomes बढ़ाया पारगम्यता और प्रणालीगत विषाक्तता में महत्वपूर्ण कटौती में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिधारण (EPR) प्रभाव के शोषण के माध्यम से ठोस ट्यूमर को लक्षित करने के लिए दवा वितरण प्रणाली के रूप में नियोजित किया गया है। बहरहाल, लिपिड से समझाया दवा की अपर्याप्त रिहाई उनके नैदानिक ​​प्रभावकारिता सीमित है। तापमान के प्रति संवेदनशील liposomes सीमित ट्यूमर दवा जैव उपलब्धता की समस्या को दूर करने के लिए दवा की साइट विशेष रिहाई प्रदान करने के लिए इंजीनियर किया गया है। हमारी प्रयोगशाला बनाया गया है और ठोस ट्यूमर पर CDDP का ट्रिगर रिहाई प्रदान करने के लिए, HTLC रूप में जाना जाता सिसप्लैटिन की गर्मी सक्रिय थर्मल liposome निर्माण (CDDP), विकसित की है। विवो में गर्मी सक्रिय वितरण एमआर thermometry (एमआरटी) द्वारा की पुष्टि के रूप में ट्यूमर साइट पर एक conformal हीटिंग पैटर्न प्रदान करता है कि एक कस्टम निर्मित लेजर आधारित हीटिंग उपकरण का उपयोग कर murine मॉडल में हासिल की थी। एक फाइबर ऑप्टिक तापमान निगरानी उपकरण वास्तविक समय में तापमान को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया थालेजर शक्ति बारी से गर्मी वितरण की ऑनलाइन समायोजन के साथ पूरे हीटिंग अवधि के दौरान। दवा वितरण हीटिंग प्रोटोकॉल मान्य करने के लिए और ट्यूमर संचय का आकलन करने के लिए एक साधन के रूप में थर्मल liposomes में CDDP के साथ-साथ एक एमआर विपरीत एजेंट (यानी, gadoteridol) के सह-encapsulation के द्वारा चुंबकीय अनुनाद (एमआर) छवि मार्गदर्शन में अनुकूलित किया गया था। हीटिंग प्रोटोकॉल से पहले HTLC के प्रशासन और 20 मिनट के हीटिंग के बाद इंजेक्शन के लिए 5 मिनट की एक पूर्वतापन अवधि शामिल थे। इस हीटिंग प्रोटोकॉल unheated ट्यूमर और मांसपेशियों की तुलना में गर्म ट्यूमर में मनाया उच्चतम एमआर संकेत परिवर्तन के साथ समझाया एजेंटों की प्रभावी रिलीज में हुई। इस अध्ययन प्रीक्लीनिकल थर्मल liposome विकास के लिए लेजर आधारित हीटिंग उपकरण और दवा वितरण के अनुकूलन के लिए हीटिंग प्रोटोकॉल के श्री निर्देशित सत्यापन के महत्व के सफल आवेदन का प्रदर्शन किया।

Introduction

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नेनो पैमाने सिस्टम का बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (ई पी आर) में ठोस ट्यूमर परिणाम के pathophysiology। इस प्रणालीगत दुष्प्रभाव 1 जबकि कम से कम ट्यूमर के ऊतक को लक्षित करने के लिए इस आशय का लाभ ले कि कई दवा वितरण प्रणाली के विकास के लिए प्रेरित किया है। लिपोसोमल वितरण प्रौद्योगिकियों व्यापक रूप से दवा या इमेजिंग जांच 2 के लिए जांच की गई है। लिपिड काफी पारंपरिक कीमोथेरेपी की तुलना में प्रणालीगत विषाक्तता को कम कर दिया है, नैदानिक ​​प्रभावकारिता 3,4 में कुछ सुधार किया गया है। अध्ययन सीमित प्रभावकारिता वाहक 4,5 से दवा रिहाई की कमी की वजह से है कि पता चला है। नतीजतन, बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में समझाया दवा जारी करने के लिए सक्रिय कर रहे हैं कि liposomes की विकास काफी ध्यान आकर्षित किया है। अतिताप कैंसर रोगियों 6 के लिए एक अपेक्षाकृत सुरक्षित उपचार के साधन के रूप में दशकों के लिए नियोजित किया गया है। इसलिए विकसितएक बाहरी ट्रिगर के रूप में गर्मी के साथ थर्मल लिपिड के बयान नैदानिक ​​अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण क्षमता के साथ एक तार्किक संयोजन किया गया है। दरअसल, LTSL-DOX रूप में जाना जाता डॉक्सोरूबिसिन की lysolipid युक्त थर्मल liposome तैयार, अब नैदानिक ​​मूल्यांकन 7 तक पहुँच गया है।

LTSL-DOX के साथ हाल ही में नैदानिक ​​डेटा गर्मी वितरण के लिए प्रोटोकॉल भारी रोगी परिणामों 8 प्रभावित कर सकते हैं कि एक महत्वपूर्ण कारक है कि दिखाया गया है। इंसानों में, रेडियोफ्रीक्वेंसी, माइक्रोवेव, लेजर और अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर ट्यूमर साइटों 9 में स्थानीय स्तर पर हाइपरथर्मिया लागू करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। चमड़े के नीचे ट्यूमर के ताप की आवश्यकता होती है preclinical अध्ययन में, गर्म कैथेटर 10,11 और पानी स्नान 12,13 सबसे अक्सर कार्यरत हैं। इस पांडुलिपि में, हम ट्यूमर की मात्रा का अधिक conformal हीटिंग सक्षम बनाता है जो एक कस्टम डिजाइन लेजर आधारित हीटिंग सेटअप का उपयोग करते हुए चमड़े के नीचे ट्यूमर को गर्म करने के लिए एक नई विधि का परिचय। एमआर संगत मा का प्रयोगterials, सेटअप लेजर हीटिंग के दौरान ऊतक के तापमान में परिवर्तन की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति, एक छोटा सा जानवर एमआर इमेजर के बोर के भीतर फिट करने के लिए काफी छोटा है।

एमआर विपरीत एजेंट, gadoteridol (जीडी-HP-DO3A), जी.डी.-HTLC रूप में जाना जाता CDDP (HTLC) की एक थर्मल liposome तैयार करने में CDDP के साथ सह-समझाया था, वास्तविक समय के लिए एमआर गर्मी की निगरानी और मूल्यांकन छवि निर्देशित -activated दवा रिहाई और हीटिंग प्रोटोकॉल का सत्यापन। हमारे परिणाम एमआर इमेजिंग के माध्यम से नजर रखी जा रही है, जबकि लेजर आधारित हीटिंग तंत्र कुशलतापूर्वक जी.डी.-HTLC सूत्रीकरण से समझाया एजेंटों की रिहाई सक्रिय कि प्रदर्शित करता है।

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Protocol

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1. Liposome तैयारी

  1. (Carbonyl- - लिपिड 1,2-Dipalmitoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-stearoyl-2-हाइड्रो- एस.एन. -glycero-3-phosphatidylcholine (MSPC या एस lyso-पीसी) और एन भंग methoxypolyethyleneglycol 2000) क्लोरोफॉर्म में -1,2-distearoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine (एमपीईजी 2000 -DSPE)। उदाहरण के लिए, HTLC के 10 मिलीलीटर की तैयारी के लिए, एक एम्बर कांच की शीशी में बाहर 314.4 मिलीग्राम DPPC, 39.4 मिलीग्राम MSPC, और 83.9 मिलीग्राम एमपीईजी 2000 -DSPE तौलना। फिर, क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीलीटर में लिपिड भंग करने और एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 सेकंड के लिए शीशी गर्मी।
  2. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर क्लोरोफॉर्म निकालें। उच्च दबाव निर्वात हे / एन के तहत परिणामस्वरूप लिपिड फिल्म रखें।
  3. HTLC के 10 मिलीलीटर के लिए, 1 घंटे के लिए 5 मिलीलीटर 0.1N Tris बफर (7.4 पीएच) के साथ लिपिड फिल्म हाइड्रेट। एक ही समय में, बाहर का वजन 162.4 मिलीग्राम 1,2-dipalmitoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoglycerol (DPPG) लिपिड और 100 मिलीग्राम CDDP पाउडर और हाइड्रेट डब्ल्यूith 5 मिलीलीटर 0.1N 1 घंटे के लिए 30% इथेनॉल (7.4 पीएच) युक्त Tris बफर।
  4. जी.डी.-HTLC तैयार करने के लिए, DPPG लिपिड और 10 मिलीग्राम CDDP पाउडर का एक ही राशि बाहर तौलना, तो (2.5 मिलीलीटर जी.डी.-HP-DO3A समाधान (279.3 मिलीग्राम / एमएल) प्लस 30% इथेनॉल युक्त 2.5 मिलीलीटर 0.1N Tris बफर के साथ हाइड्रेट 1 घंटे के लिए 7.4 पीएच)। हाइड्रेशन के दौरान मिश्रण एम्बर शीशियों में रखा जाना चाहिए और लगातार सरगर्मी और हर 10 मिनट vortexing के साथ 70 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर रखा।
  5. लिपिड मिश्रण और लिपिड दवा मिश्रण का मिश्रण है, और फिर एक घंटे के लिए हाइड्रेट। भंवर हर 15-20 मिनट।
  6. 200 एनएम पॉली कार्बोनेट फिल्टर के दो ढेर के साथ 10 मिलीलीटर बाहर निकालना इकट्ठे। 70 डिग्री सेल्सियस पर एक घूम पानी स्नान करने के लिए बाहर निकालना thermobarrel कनेक्ट करें, और एक संकुचित नाइट्रोजन टैंक को बाहर निकालना कनेक्ट।
  7. इसके तत्काल बाद हाइड्रेशन के बाद, बाहर निकालना कक्ष में मिश्रण हस्तांतरण। झिल्ली के माध्यम से लिपिड बाहर करने के लिए नाइट्रोजन प्रवाह (200 साई करने के लिए सेट दबाव) को खोलें। Liposom लीजिएएक 50 मिलीलीटर ट्यूब में ते। बाहर निकालना प्रक्रिया के दौरान हर समय एक गर्म पानी से स्नान (70 डिग्री सेल्सियस) में ट्यूब रखें। इस प्रक्रिया 5 बार दोहराएँ।
  8. बाहर निकालना जुदा और 100 एनएम पॉली कार्बोनेट फिल्टर के दो ढेर करने के लिए बदल जाते हैं। बाहर निकालना पुनः और 400 साई के दबाव निर्धारित किया है। लिपिड 10 बार बाहर निकालना छोड़कर दोहराएँ चरण 5,। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अंतिम बाहर निकालना से नमूना ले लीजिए।
  9. 3 मिनट अघुलनशील CDDP वेग के लिए 1,000 XG पर आरटी के लिए लिपिड, और सेंट्रीफ्यूज शांत हो जाओ।
  10. बाँझ शर्तों के तहत एक 15,000 आणविक वजन कटऑफ (MWCO) के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग में 0.9% खारा के खिलाफ liposomes हे / एन dialyze।
  11. आसुत जल 990 μl में लिपिड के 10 μl पतला। HTLC और जी.डी.-HTLC के आकार के वितरण को मापने के लिए गतिशील प्रकाश बिखरने का प्रयोग करें। 10 रन से प्रत्येक के साथ 3 मापन प्रदर्शन।
  12. आसुत जल 3,960 μl में liposomes की 40 μl पतला। प्लैटिनम और gadolinium के 5-6 मानक समाधान बनाओ0.1-20 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता रेंज में। 3 अलग अलग तरंग दैर्ध्य में उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा परमाणु उत्सर्जन स्पेक्ट्रोमीटर (आईसीपी-एईएस) का उपयोग प्लैटिनम और gadolinium सांद्रता उपाय। औसत परिणाम के लिए प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में 3 मापन प्रदर्शन।
  13. एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर (डीएससी) का उपयोग HTLC liposome तैयार करने की तरल क्रिस्टलीय चरण संक्रमण तापमान (टी एम) के लिए जेल का निर्धारण करते हैं। लोड 5-10 एक डीएससी पैन में HTLC की मिलीग्राम और एक संदर्भ के रूप में एक खाली पैन का उपयोग करें। 60 डिग्री सेल्सियस 0 डिग्री सेल्सियस से तापमान को रैंप पर 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर स्कैन का प्रयोग करें।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश जोखिम और दुकान को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लिपिड लपेटें।

Liposomes से इन विट्रो रिलीज 2.

  1. स्पिन स्तंभों तैयार करें।
    1. 3-4 घंटे के लिए आरटी पर 400 मिलीलीटर 0.9% खारा में 50 ग्राम जेल निस्पंदन मोती सेते हैं। 0.9% नमक के साथ गीला कांच ऊन का एक टुकड़ा, ऊपर रोल और 1 मिलीलीटर सिरिंज की नोक में जगह। लगभग 0.05-0.1 मिलीलीटर सिरिंज के भरने के लिए कांच ऊन दबाएं। धीरे-धीरे सिरिंज में लगभग 1 मिलीलीटर जेल निस्पंदन मीडिया को जोड़ने के लिए एक गिलास पिपेट का प्रयोग करें।
    2. 3 मिनट के लिए 1,000 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र में सिरिंज रखें। स्पिन स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह।
  2. नमूना 400 8 1-घूंट कांच की शीशियों में HTLC या जी.डी.-HTLC की μl और 37 डिग्री सेल्सियस या 42 डिग्री सेल्सियस पर या तो एक तापमान नियंत्रित नहाने के पानी में सेते हैं। हर समय बिंदु पर एक शीशी (यानी, 5, 15, 30 और 60 मिनट) बाहर ले जाओ और तुरंत बर्फ पर जगह है।
  3. तब ऊष्मायन (नियंत्रण) से पहले HTLC या जी.डी.-HTLC के 100 μl जोड़ने या स्पिन स्तंभ में नहाने के पानी में ऊष्मायन के बाद, तैयार स्पिन स्तंभ में 0.9% खारा के 100 μl जोड़ें। 3 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र। ट्यूब से सिरिंज निकालें और आईसीपी-एईएस के विश्लेषण के लिए ट्यूब में समाधान पतला।

सरवाइकल के चमड़े के नीचे Xenograft 3. आरोपणट्यूमर

  1. सभी जानवरों के अध्ययन विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क के पशु की देखभाल समिति (UHN) द्वारा अनुमोदित पशु का उपयोग प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित की गई।
  2. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में सभी पशु अध्ययन करते हैं। किसी भी सर्जरी से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव। प्रत्येक सर्जरी के बाद, 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल उपकरण पोंछे और फिर एक गर्म मनका अजीवाणु का उपयोग कर बाँझ।
  3. इच्छामृत्यु के लिए, तो ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन, एक अछूता सीओ 2 चैम्बर में जानवरों की जगह।
  4. 100% ऑक्सीजन का उपयोग सामान्य संज्ञाहरण के लिए, शामिल करने के लिए 5% isofluorane और रखरखाव के लिए 2% का उपयोग करें। संज्ञाहरण की गहराई सुनिश्चित करने, पशु प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए लुटेरा की पलमार सतह के लिए संदंश के साथ दबाव लागू होते हैं। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें।
  5. सर्जरी आया है कि एक पशु के लिए, दूसरे जानवरों की कंपनी के बिना एक साफ पिंजरे में जानवरों की जगह। पर्याप्त होश आ जाता है जब तक की निगरानी करें।
  6. संस्कृतिअल्फा न्यूनतम आवश्यक मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (α-सदस्य) में एमई-180 कोशिकाओं।
  7. कोशिकाओं फसल और टीका से पहले पूरा मीडिया में कोशिकाओं रखें। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  8. एक इंट्रामस्क्युलर (आईएम) ME-180 (मानव गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर की कोशिकाओं) ट्यूमर सहन करने के लिए प्रत्येक दाता माउस टीका लगाना।
    नोट: आईएम साइट पर विकास अच्छी तरह vascularized ट्यूमर के विकास को सुनिश्चित करने के लिए चुना गया है। क्रय महिला SCID चूहों (आयु वर्ग के 6-8 सप्ताह लगभग 20 ग्राम) एक घर में प्रजनन सुविधा से।
    1. एक महिला SCID माउस anesthetize और एक 27 जी सुई का उपयोग हिंद अंग की gastrocnemius मांसपेशियों में 1 एक्स 10 6 ME-180 कोशिकाओं इंजेक्षन।
    2. ट्यूमर उनकी सबसे लंबे समय तक आयाम में 9-12 मिमी तक पहुँच चुके हैं एक कैलीपर का उपयोग ट्यूमर के आकार को मापने। ट्यूमर 12 मिमी को पार कर गया है, तो अध्ययन समाप्त, या ट्यूमर जन सामान्य व्यवहार, ambulation, भोजन और पानी का सेवन समझौता है।
  9. प्राप्तकर्ता चूहों में दाता चूहों से प्रत्यारोपण ट्यूमर के टुकड़े।
    1. 5% isofluorane का उपयोग कर एक दाता माउस anesthetize। संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग माउस euthanize। दाता माउस से दाता ट्यूमर को निकाल दें। 2-3 मिमी 3 के घन टुकड़ों में ट्यूमर कट।
    2. 5% isofluorane का उपयोग कर एक प्राप्तकर्ता माउस anesthetize। मिलीलीटर meloxicam subcutaneously सर्जरी से पहले / 0.5 मिलीग्राम के 100 μl इंजेक्षन। मुंडा त्वचा के लिए आयोडीन शल्य तो हाथ धोने समाधान, 70% इथेनॉल, और अंत में आयोडीन समाधान को लागू करें। प्राप्तकर्ता माउस के बाएं हिंद अंग दाढ़ी। त्वचा के स्तर पर एक चीरा। चीरा के माध्यम से एक दाता ट्यूमर टुकड़ा subcutaneously डालें। 1-2 घाव क्लिप (एस) का उपयोग चीरा बंद करें।
    3. आरोपण के बाद क्लिप 3-5 दिन निकालें। चमड़े के नीचे ट्यूमर लेजर आधारित हीटिंग सेटअप का उपयोग करने के लिए आवश्यक है।
    4. ट्यूमर हीटिंग इलाज से पहले 2-3 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें।

4. डिजाइन, विधानसभामें विवो ताप के लिए एक conformal लेजर प्रसव के प्रकाशक की Bly और कैलिब्रेशन

  1. एक ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग कर एक conformal प्रकाशक मिलकर 763 एनएम डायोड लेजर का उपयोग ऊतक हीटिंग पाना।
    1. प्रकाशक जेनोग्राफ्ट ट्यूमर की वर्दी सतही लेजर रोशनी प्रदान करता है। यह बीच में एक कक्ष के साथ (व्यास में 16 मिमी) और 2 छोटे कक्षों दोनों तरफ (लंबाई में 16 मिमी और 5 मिमी चैम्बर क्षेत्रों को एकीकृत तीन adjoined प्रकाश युक्त अत्यधिक परावर्तक सामग्री की एक 30 x 20 x 17 मिमी ब्लॉक से बना है व्यास में) (चित्रा 1)।
    2. आदेश में प्रकाश के लिए दूसरे में एक कक्ष से पारित करने के लिए, दो छोटे 5 मिमी व्यास छेद छोटे बाहरी कक्षों और बड़ा बीच चैम्बर के बीच काट रहे थे। प्रकाश एक 600 मीटर व्यास छेद के माध्यम से चैम्बर में पारित हो जाता है कि लेजर से जुड़ा एक 400 माइक्रोन कट अंत फाइबर का उपयोग बाहरी कक्षों में लेजर से वितरित किया जाता है।
    3. कारण प्रकाश पूर्णांक की प्रकृति केकक्ष की दीवारों के साथ eraction, छोटे कक्षों में से एक में कर दिया प्रकाश तो स्थानिक homogenized है यह आगे स्थानिक homogenized है जहां बड़े कक्ष में आंतरिक बंदरगाहों से होकर गुजरता है। प्रकाश तो बीच चैम्बर पर 10 मिमी व्यास बंदरगाह से बाहर निकालता है।
  2. एक NIST का उपयोग कर लेजर सत्ता स्थापित करने के लिए सम्मान के साथ प्रकाशक प्रकाश वितरण जांचना वितरित की शक्ति को मापने के लिए एकीकृत क्षेत्र में 50 मिमी calibrated।
    1. ट्यूमर का एक सरल ज्यामिति के आधार पर मोंटे कार्लो सिमुलेशन का उपयोग ट्यूमर में प्रकाश वितरण की गणना। जैक्स एट अल। 14 के बहुस्तरीय ऊतकों में प्रकाश परिवहन के मोंटे कार्लो मॉडलिंग के मानक कोड पर एक वाणिज्यिक कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर पैकेज और आधार के साथ लिखा एक कस्टम एल्गोरिथ्म में मोंटे कार्लो कोड उत्पन्न करता है।
    2. वह एक गोलार्द्ध त्वचा की सतह और एक में 7 मिमी औसत ट्यूमर आयाम मिलान एक व्यास के साथ एक फ्लैट त्वचा लाइन पर झूठ बोल के रूप में ट्यूमर मॉडल5 मिमी ight। बेतरतीब ढंग से क्षेत्र के केंद्र में अवगत कराया गोलार्द्ध और प्रत्यक्ष भर फोटॉनों शुरू करने से सतह का मॉडल सजातीय रोशनी।
    3. अवशोषण सहित ऑप्टिकल गुण का उपयोग करें, एक = 0.025 मिमी -1, बिखरने μ, μ 10 मिमी -1, anisotropy कारक, छ = 0.9 और अपवर्तनांक, एन = 1.4 =। गणना में एक लाख फोटॉनों का प्रयोग करें।
    4. प्रारंभिक अंशांकन के बाद आगे नहीं संशोधनों के साथ किसी भी इन विवो हीटिंग प्रयोगों से पहले इन मापन प्रदर्शन।

कस्टम डिजाइन लेजर चैंबर सेटअप का उपयोग कर ट्यूमर के 5. Conformal ताप

  1. लेज़र युक्ति और प्रकाशक के लिए दूसरे छोर से एक लेजर फाइबर का एक छोर से कनेक्ट।
  2. 5% isofluorane का उपयोग कर पशु anesthetize। माउस के पार्श्व पूंछ नस में एक 27 जी इंजेक्शन कैथेटर डालें। ट्यूमर के केंद्र में एक 22 जी कैथेटर डालें। एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जनसंपर्क रखेंखोखले कैथेटर में ओबीई तापमान परिवर्तन पर नजर रखने के लिए।
  3. प्रकाशक (चित्रा 2) के साथ पूरे ट्यूमर को कवर किया। पहले लेजर पर मुड़ें और तापमान में वृद्धि के लिए प्रतीक्षा डब्ल्यू 0.8-1 करने के लिए बिजली की स्थापना की। मैन्युअल 0.1-0.8 डब्ल्यू के बीच लेजर शक्ति का समायोजन करके 42 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूमर का तापमान बनाए रखें

एमआर thermometry माध्यम से मूल्यांकन 6. तापमान वितरण (एमआरटी)

  1. फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच माप के साथ संयोजन के रूप में एक 7 टेस्ला प्रीक्लीनिकल एमआर इमेजिंग प्रणाली 15 पर प्रोटॉन अनुनाद आवृत्ति पारी (पीआरएफ-पाली) एमआरटी के माध्यम से लेजर आधारित हीटिंग सेटअप का उपयोग गरम किया ट्यूमर का तापमान वितरण उपाय।
  2. एक 2 डी-फ्लैश पल्स अनुक्रम का उपयोग कर 10 सेकंड के अंतराल (गूंज समय 4.5 मिसे; पुनरावृत्ति समय 156.25 मिसे) पर thermometry छवियों का मोल के साथ 312 x 312 माइक्रोन में विमान संकल्प और फाइबर ऑप्टिक के स्तर पर एक भी टुकड़ा में 2 मिमी टुकड़ा मोटाई तापमान समर्थकहोना।

एजेंट रिलीज 7. एमआर निगरानी

  1. टी 1 भारित इमेजिंग से पहले और जी.डी.-HTLC के प्रशासन के बाद 20 मिनट के प्रदर्शन करना।
  2. आरोपण के लिए धारा 3 में ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर एक महिला SCID माउस का प्रत्यारोपण दो ट्यूमर, हिंद अंग में से प्रत्येक पर एक। 66.3 मिलीग्राम / किग्रा जी.डी.-HP-DO3A और 1.4 मिलीग्राम / किग्रा CDDP की एक खुराक पर जी.डी.-HTLC के इंजेक्शन के लिए पहले 42 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए छोड़ दिया हिंद अंग पर ट्यूमर पहले से गरम है, तो एक अतिरिक्त 20 के लिए ट्यूमर गर्मी मिनट के बाद इंजेक्शन। हीटिंग इलाज के दौरान इंजेक्शन प्रदर्शन। एक unheated नियंत्रण के रूप में सही हिंद अंग पर ट्यूमर का प्रयोग करें।
  3. गतिशील एमआर छवियों का मोल (36 x 20 मिमी क्षेत्र का दृश्य, 200 x 200 माइक्रोन में विमान संकल्प, 2 मिमी टुकड़ा मोटाई, एमआर अनुक्रम प्रोटोकॉल) पूरे 20 मिनट के लिए 12 सेकंड के अंतराल पर जी.डी.-HP-DO3A रिहाई की निगरानी के लिए जी.डी.-HTLC के पद के प्रशासन, इंजेक्शन के लिए पहले 30 सेकंड शुरुआत।
  4. (गर्म और unheated) ट्यूमर और मांसपेशियों की मात्रा कंटूर।प्रत्येक contoured मात्रा के भीतर सभी voxels का मतलब एमआर संकेत गणना।

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Representative Results

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HTLC लिपिड लिपिड फिल्म गठन, हाइड्रेशन, बाहर निकालना और डायलिसिस सहित आम तरीकों का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं। CDDP एक काले रंग की जमा के गठन के माध्यम से निष्क्रिय हो जाएगा के रूप में CDDP शामिल चरणों के दौरान, सावधानी, किसी भी एल्यूमीनियम सामग्री को CDDP बेनकाब करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। HTLC का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है। HTLC के भौतिक-रासायनिक गुणों हाल ही नियंत्रित रिलीज 16 के जर्नल में प्रकाशित एक पांडुलिपि में संक्षेप थे। जी.डी.-HTLC तैयार करने की gadolinium और प्लैटिनम सांद्रता हैं 1.87 ± 0.28 मिलीग्राम / एमएल और 0.10 ± 0.02 मिलीग्राम / एमएल, क्रमशः।

लेजर आधारित हीटिंग की स्थापना के प्रकाशक 10 मिमी व्यास बाहर निकलने के बंदरगाह पर एक सजातीय प्रकाश वितरण (± 15%) प्रदान करते हैं कि तीन छोटे, जुड़ा कक्षों का उपयोग करता है। लेजर की सत्ता स्थापित करने पर निर्भर करता है, सत्ता उपाय के रूप में, 1.7 डब्ल्यू / 2 सेमी 0.5 की सीमा के भीतर वितरित किया जाता हैडी नपे-तुले एकीकृत क्षेत्र का उपयोग कर। परिणाम ट्यूमर के माध्यम से एक पार अनुभाग के रूप में चित्रा 4 में दिखाया जाता है। 1 डब्ल्यू की कुल बिजली मान लिया जाये, ट्यूमर में किसी भी बिंदु पर अधिकतम प्रभाव दर 70 मेगावाट / 2 सेमी है। लेजर शक्ति सिर्फ ट्यूमर की सतह के नीचे शिखर प्रभाव की तुलना में त्वचा के स्तर पर 2 का एक पहलू से कम हो जाती है।

पीआरएफ पारी एमआरटी (चित्रा 5) से इसकी पुष्टि के रूप में लेजर आधारित हीटिंग सेटअप का उपयोग हीटिंग, एक अपेक्षाकृत समान तापमान वितरण नक्शा उत्पन्न करता है। पीआरएफ पारी एमआरटी बिंदु स्रोत (यानी, फाइबर ऑप्टिक तापमान संवेदक) द्वारा हीटिंग से पहले अधिग्रहीत एक निरपेक्ष आधारभूत माप से रिश्तेदार तापमान परिवर्तन पटरियों।

एमआर संकेत विश्लेषण (चित्रा 6C) से, गरम ट्यूमर अंत तक बनाए रखा है जो जी.डी.-HTLC, के प्रशासन के बाद unheated ट्यूमर और मांसपेशियों की तुलना में सबसे ज्यादा रिश्तेदार संकेत वृद्धि को प्रदर्शित करता हैहीटिंग अवधि की।

आकृति 1
प्रकाशक की 1. डिजाइन चित्रा। प्रकाशक की (ए) आयाम। (बी) के भीतरी कक्ष के आयाम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा एक तापमान निगरानी उपकरण के साथ साथ लेजर आधारित हीटिंग सेटअप 2. चित्रण। एक लेजर फाइबर (नीली रेखा) प्रकाशक के लिए प्रकाश बचाता है। एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच (पीले लाइन) तापमान परिवर्तन पर नजर रखने के लिए एक 22 जी कैथेटर के माध्यम से ट्यूमर के केंद्र में रखा गया था। वास्तविक समय गुस्साature रीडिंग कंप्यूटर स्क्रीन पर दिखाए जाते हैं। नियंत्रित रिलीज 2014, 178 के जर्नल, 69-78। 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
HTLC सूत्रीकरण (पैमाने पर नहीं) की चित्रा 3. योजनाबद्ध ड्राइंग। लिपिड रचनाओं, HTLC liposomes की CDDP एकाग्रता और आकार सचित्र हैं। नियंत्रित रिलीज 2014, 178 के जर्नल, 69-78। 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Modelinछोटे एकीकृत क्षेत्र का उपयोग कर ट्यूमर के लिए प्रकाश वितरण की छ। (ए) सामान्य अंतर्निहित ऊतक से ऊपर उठाया ट्यूमर दिखा मॉडल की योजनाबद्ध। लाल तीर कवरेज और गणना में प्रारंभिक फोटॉनों की दिशा का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोशनी उठाया ट्यूमर की पूरी सतह क्षेत्र शामिल हैं। (बी) के ट्यूमर में प्रकाश प्रभाव वितरण दिखा गणना के परिणाम। (सी) बनाम गहराई प्रकाश प्रभाव के क्रॉस अनुभागीय साजिश, सफेद (बी) में दिखाया लाइन धराशायी साथ। त्वचा की गहराई में ट्यूमर में fluence दर अधिकतम प्रभाव दर का 50% है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. तापमान वितरण एमआर thermometry के माध्यम से मूल्यांकन किया है। &# 160;। लेजर आधारित हीटिंग सेटअप का उपयोग सी 42 डिग्री के लिए छोड़ दिया ट्यूमर को गर्म करने से उत्पन्न दो द्विपक्षीय रूप से प्रत्यारोपित ट्यूमर के संरचनात्मक स्थान दिखा (ए) टी 2 भारित छवि (बी) के तापमान वितरण नक्शा, सही ट्यूमर है, जबकि unheated बने रहे। डेटा 69-78, नियंत्रित रिलीज 2014, 178 के जर्नल से फिर से विश्लेषण किया। 16 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
गर्मी सक्रियण पर जी.डी.-HTLC लिपिड से gadoteridol रिहाई की चित्रा 6 एमआर निगरानी। टी 1 हिंद अंग में से प्रत्येक पर एक साथ दो चमड़े के नीचे ME-180 ट्यूमर, असर एक माउस के (एक ही खिड़की स्तर लागू) एमआर छवियों भारित ( ए) जी.डी.-HTLC की पूर्व इंजेक्शन और(पूरे हीटिंग अवधि के बाद, यानी) (बी) जी.डी.-HTLC के 20 मिनट के बाद इंजेक्शन। (सी) सापेक्ष एमआर संकेत गतिशील एमआर में दिखाया माउस के अधिग्रहण (ए) और पहली बार बिंदु (के लिए सामान्यीकृत में परिवर्तन बी)। डाटा + मतलब एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा 69-78, नियंत्रित रिलीज 2014, 178 के जर्नल से फिर से विश्लेषण किया। 16 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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Liposomes पहले अपने लिपिड bilayer 2 के भीतर अपने आंतरिक जलीय मात्रा में हाइड्रोफिलिक दवाओं और हाइड्रोफोबिक ड्रग्स ले कि दवा वितरण वाहनों के रूप में 1960 के दशक में विकसित किया गया। रेडिओन्युक्लिआइड के साथ लेबल या इमेजिंग विपरीत एजेंटों 17 के साथ भरी हुई जब चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उपयोग करने के अलावा, लिपिड नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए पता लगाया गया है। हाल के वर्षों, theranostics और चिकित्सीय निदान जोड़े में छवि निर्देशित रोगी स्तरीकरण और दवा वितरण 17,18 के लिए अवसर प्रदान करने के लिए अपनाई गई है। वर्तमान अध्ययन एमआर मार्गदर्शन में एक कस्टम डिजाइन लेजर आधारित हीटिंग सेटअप का उपयोग थर्मल लिपिड से चालू दवा रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए छवि निर्देशित दवा वितरण की अवधारणा पर बनाता है।

जैसा कि ऊपर कहा, पानी स्नान या हीटिंग कैथेटर आमतौर पर चमड़े के नीचे ट्यूमर गर्म करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। पानी के स्नान विधि गर्म w में पूरे अंग के विसर्जन की आवश्यकता हैअटर, इसके अलावा में अंग भर में, गैर विशिष्ट दवा रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर साइट पर रिहा करने के लिए। एक हीटिंग कैथेटर का उपयोग ट्यूमर के केंद्र में एक 18 जी कैथेटर की नियुक्ति की आवश्यकता है, और थर्मल स्थिर राज्य के 11 तक पहुंचने के लिए समय (15 मिनट) के एक अपेक्षाकृत लंबी अवधि के लिए हीटिंग की जरूरत को दिखाया गया है।

वर्तमान अध्ययन में, नए डिजाइन लेजर आधारित हीटिंग सेटअप तापमान वितरण नक्शा (चित्रा 5) के श्री आधारित आकलन के द्वारा प्रदर्शन के रूप में ट्यूमर मात्रा को गर्मी देने के एक conformal हो गए हैं। चित्रा 5 में unheated सही हिंद अंग और सही अंग ट्यूमर में पीआरएफ पारी नक्शे में विविधता, संवेदनशीलता कलाकृतियों और मामूली शारीरिक या हीटिंग प्रेरित गतियों के आसपास के क्षेत्र में कम संकेत करने वाली शोर का एक संयोजन प्रतिबिंबित कर सकते हैं जो समझौता सीधे कर सकते हैं हीटिंग और आधारभूत छवि पंजीकरण लेकिन यह भी चारों ओर प्रेरित क्षेत्रों में मामूली बदलाव परिचयऑफसेट चुंबकीय संवेदनशीलता के क्षेत्रों के। इसके अलावा, यह थर्मल स्थिर अवस्था हीटिंग की शुरुआत के 1-2 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है कि पाया गया था। इसके अलावा, इस बिंदु पर आधारित फाइबर ऑप्टिक तापमान संवेदक 42 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखने के लिए और तापमान के उतार चढ़ाव को कम करने के क्रम में लेजर शक्ति के वास्तविक समय समायोजन के लिए अनुमति दी। हालांकि, यह ट्यूमर के भीतर एक अपेक्षाकृत केंद्रीय स्थिति में फाइबर ऑप्टिक तापमान संवेदक जगह के लिए महत्वपूर्ण है। एमआर इमेजिंग सेंसर के लिए चीरा बिंदु मान्य करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। हीटिंग के दौरान, लेजर शक्ति ध्यान से 0.8 डब्ल्यू के एक प्रारंभिक शक्ति के साथ 42 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए

हीटिंग प्रोटोकॉल दवा CDDP के लिए एक किराए के रूप में जी.डी.-HP-DO3A रिहाई की वास्तविक समय की निगरानी के माध्यम से अनुकूलित किया गया था। गरम किया HTLC समूह एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लाभ में जिसके परिणामस्वरूप के साथ सुधार प्रभावकारिता में अनुवाद किया HTLC लिपिड से समझाया एजेंटों की प्रभावी रिहाई,अन्य उपचार और नियंत्रण समूहों 16 से अधिक Tage।

हीटिंग तंत्र के प्रकाशक सबसे बड़ा आयाम में 5-7 मिमी के ट्यूमर गर्म करने के लिए डिजाइन किया गया था। प्रकाशक के डिजाइन बड़ा ट्यूमर है और कई फाइबर ऑप्टिक तापमान सेंसरों मौजूदा एकल बिंदु आधारित माप की तुलना में तापमान पर नजर रखने के लिए ट्यूमर मात्रा भर डाला जा सकता है गर्म करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। पोर्टेबल डिवाइस एमआर संगत सामग्री से बनाया गया है, क्योंकि इसके अलावा, 3-आयामी एमआर thermometry पूरा ट्यूमर मात्रा भर में तापमान वितरण का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

अंत में, लेजर आधारित हीटिंग तंत्र थर्मल liposome योगों के प्रीक्लीनिकल विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इस तरह इस अध्ययन में इस्तेमाल एक के रूप में छवि निर्देशित दवा वितरण दृष्टिकोण, वास्तविक टिम सहित नैदानिक ​​अनुवाद और व्यक्तिगत दवा के क्रियान्वयन के लिए महत्वपूर्ण क्षमता हैचिकित्सीय उपचार के ई निगरानी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rotary evaporator Heidolph Instruments GmbH & Co.KG Laborota 4000
High pressure extruder Northern Lipids Inc. T.001 10 ml thermobarrel
Heating circulator VWR International LLC. 11305 Connected to extruder
Polycarbonate membrane filter Whatman 110605;110606
Differential scanning calorimeter (DSC) TA Instruments Q100
Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) PerkinElmer Optima 7300DV
Zetasizer Malvern Instruments Ltd. Nano-ZS
Cell incubator NuAire Inc. NU-5800
Autoclip wound clip applier Becton Dickinson 427630
Autoclip wound clip remover Becton Dickinson 427637
Wound clips Becton Dickinson 427631 9 mm
763 nm Laser device Biolitec Ceralas CD 403 laser
Laser probe Thorlabs Inc. FT400EMT With SMA and flat cleave connectors
Spectralon (illuminator) Labsphere Inc. FAST-SL-5CMX5CM
CSTM-SL-5CMX5CM
7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system Bruker Corporation Biospec 70/30
Fiber optic temperature sensor LumaSense Technologies Inc. Luxtron FOT Lab Kit
Integrating sphere Newport Corporation 819C
Optical power meter Newport Corporation 1830-R

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References

  1. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Releas. 65, (1-2), 271-284 (2000).
  2. Simard, P., Leroux, J. C., Allen, C., Meyer, O. Liposomes for Drug Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Application. American Scientific Publishers. (2007).
  3. O'Brien, M. E. R., et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX (TM)/Doxil (R)) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. Ann Onco. 15, (3), 440-449 (2004).
  4. White, S. C., et al. Phase II study of SPI-77 (sterically stabilised liposomal cisplatin) in advanced non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 95, (7), 822-828 (2006).
  5. Laginha, K. M., Verwoert, S., Charrois, G. J. R., Allen, T. M. Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. Clin Cancer Res. 11, (19), 6944-6949 (2005).
  6. Baronzio, G. F., Hager, E. D. Hyperthermia in cancer treatment: a primer. Springer Science. (2006).
  7. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale Drug Delivery and Hyperthermia: The Materials Design and Preclinical and Clinical Testing of Low Temperature-Sensitive Liposomes Used in Combination with Mild Hyperthermia in the Treatment of Local Cancer. Open Nanomed. 3, 38-64 (2011).
  8. Celsion Corporation. Celsion Announces Updated Overall Survival Data from HEAT Study of ThermoDox http://investor.celsion.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=862248 (2014).
  9. Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., ten Hagen, T. L. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, (8), 1750-1754 (2010).
  10. Viglianti, B. L., et al. In vivo monitoring of tissue pharmacokinetics of liposome/drug using MRI: illustration of targeted delivery. Magn Reson Me. 51, (6), 1153-1162 (2004).
  11. Ponce, A. M., et al. Magnetic resonance imaging of temperature-sensitive liposome release: drug dose painting and antitumor effects. J Natl Cancer Ins. 99, (1), 53-63 (2007).
  12. Kong, G., et al. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor xenograft model: importance of triggered drug release. Cancer Res. 60, (24), 6950-6957 (2000).
  13. Yarmolenko, P. S., et al. Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours. Int J Hyperthermia. 26, (5), 485-498 (2010).
  14. Wang, L. H., Jacques, S. L., Zheng, L. Q. MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Comput Meth Prog Bio. 47, 131-146 (1995).
  15. Rieke, V., Butts Pauly, K. MR thermometry. J Magn Reson Imaging. 27, (2), 376-390 (2008).
  16. Dou, Y. N., et al. Heat-activated thermosensitive liposomal cisplatin (HTLC) results in effective growth delay of cervical carcinoma in mice. J Control Release. 178, 69-78 (2014).
  17. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol Pharm. 7, (6), 1899-1912 (2010).
  18. Lee, H., et al. A novel 64Cu-liposomal PET agent (MM-DX-929) predicts response to liposomal chemotherapeutics in preclinical breast cancer models. Thirty-Fifth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium. (2012).
चुंबकीय अनुनाद छवि मार्गदर्शन के साथ थर्मल Liposomes से Cisplatin की उत्प्रेरित रिलीज के लिए कस्टम डिजाइन लेजर आधारित ताप उपकरण
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Dou, Y. N., Weersink, R. A., Foltz, W. D., Zheng, J., Chaudary, N., Jaffray, D. A., Allen, C. Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance. J. Vis. Exp. (106), e53055, doi:10.3791/53055 (2015).More

Dou, Y. N., Weersink, R. A., Foltz, W. D., Zheng, J., Chaudary, N., Jaffray, D. A., Allen, C. Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance. J. Vis. Exp. (106), e53055, doi:10.3791/53055 (2015).

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