Summary
En MR-kompatibel skräddarsydda laserbaserad uppvärmningsanordning har utvecklats för att ge lokal uppvärmning av subkutana tumörer för att aktivera frisättningen av agenter från värmekänsliga liposomer speciellt på tumörområdet.
Abstract
Liposomer har använts som läkemedelsleveranssystem för att rikta solida tumörer genom att utnyttja den förbättrade permeabilitet och retention (EPR) effekt resulterar i betydande minskningar av systemisk toxicitet. Icke desto mindre har otillräcklig frisättning av inkapslat läkemedel från liposomer begränsat deras kliniska effekt. Temperaturkänsliga liposomer har konstruerats för att tillhandahålla sätesspecifik frisättning av läkemedel i syfte att övervinna problemet med begränsad tumörläkemedel biotillgänglighet. Vårt laboratorium har designat och utvecklat en värmeaktiverad värmekänsligt liposomformulering av cisplatin (CDDP), känd som HTLC, för att ge utlöst frisättning av CDDP på solida tumörer. Värmeaktiverade leverans in vivo uppnåddes i musmodeller med hjälp av en specialbyggd laserbaserad apparat värme som ger en konform uppvärmningsmönster vid tumörstället vilket bekräftas av MR termometri (MRT). En fiberoptisk temperaturövervakningsanordningen användes för att mäta temperaturen i realtidunder hela uppvärmningsperioden online justering av värmeleverans genom att växla lasereffekten. Läkemedelsavgivning optimerades under magnetisk resonans (MR) bildstyrning genom sam-inkapsling av ett MR-kontrastmedel (dvs gadoteridol) tillsammans med CDDP in i de värmekänsliga liposomer som ett medel för att validera uppvärmningsprotokoll och bedöma tumör ackumulering. Värmeprotokollet bestod av en period av fem minuter före administrering av HTLC och 20 min uppvärmning efter injektion förvärmning. Denna uppvärmningsprotokoll resulterade i effektiv frisättning av de inkapslade medel med den högsta MR-signalen förändring observerades i den uppvärmda tumör i jämförelse med den ouppvärmda tumören och muskler. Denna studie visade en framgångsrik tillämpning av laserbaserade uppvärmningsanordning för preklinisk värmekänslig liposom utveckling och betydelsen av MR-guidad validering av uppvärmningsprotokoll för optimering av läkemedelstillförsel.
Introduction
Patofysiologin av solida tumörer resulterar i förbättrad permeabilitet och retention (EPR) i nanosystem. Detta har lett till utvecklingen av många läkemedelstillförselsystem som utnyttjar denna effekt för att rikta tumörvävnaden samtidigt minimera systemiska biverkningar 1. Liposomalt delivery-teknologier har i stor utsträckning undersökts för drog- eller avbildningssonder 2. Även liposomer har minskat systemisk toxicitet avsevärt jämfört med konventionell kemoterapi, har det skett några förbättringar i klinisk effekt 3,4. Studier har visat att den begränsade effekten beror på en brist på läkemedelsfrisättning från bäraren 4,5. Som ett resultat, har utvecklingen av liposomer som aktiveras för att frisätta det inkapslade läkemedlet som svar på yttre stimuli fått stor uppmärksamhet. Hypertermi har använts i årtionden som en relativt säker behandlingsform för cancerpatienter 6. Därför utvecklarlingen av värmekänsliga liposomer med värme som en extern trigger har varit en logisk kombination med betydande potential för klinisk översättning. I själva verket har lysolipid innehållande termosensitiva liposomformulering av doxorubicin, som kallas LTSL-DOX, nu nått klinisk utvärdering 7.
Nyligen genomförda kliniska data med LTSL-DOX har visat att protokollet för värmeleverans är en kritisk faktor som starkt kan påverka behandlingsresultat 8. Hos människor är radiofrekventa, mikrovågsugn, laser- och ultraljudsgivare används för att applicera hypertermi lokalt vid tumörplatser 9. I prekliniska studier som kräver uppvärmning av subkutana tumörer, är uppvärmnings katetrar 10,11 och vattenbad 12,13 oftast används. I detta manuskript, introducerar vi en ny metod för att värma subkutana tumörer med hjälp av en specialdesignad laserbaserad värme installation, vilket möjliggör mer konforma uppvärmning av tumörvolymen. Använda MR kompatibel material, är den setup liten nog att passa inuti hålet i en liten djur MR imager, vilket tillåter övervakning i realtid av förändringar i vävnadstemperaturen under laseruppvärmning.
MR-kontrastmedel, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), var co-inkapslad med CDDP i ett värme liposomformulering av CDDP (HTLC), känd som Gd-HTLC, för realtids-MR bildstyrd övervakning och utvärdering av värme -activated läkemedelsdosering och validering av uppvärmningsprotokoll. Våra resultat visar att laserbaserade uppvärmningsanordningen effektivt aktiveras frisättningen av inkapslade medel från Gd-HTLC formuleringen medan den övervakas genom MR-avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Liposomberedning
- Lös lipiderna 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC), 1-stearoyl-2-hydroxi-sn-glycero-3-fosfatidylkolin (MSPC eller S-lyso-PC) och N - (karbonyl- methoxypolyethyleneglycol 2000) -1,2-distearoyl- sn-glycero-3-fosfoetanolamin (mPEG 2000 -DSPE) i kloroform. Exempelvis för framställning av 10 ml HTLC, väg upp 314,4 mg DPPC, 39,4 mg MSPC, och 83,9 mg mPEG 2000 -DSPE in i en bärnstensfärgad glasflaska. Därefter upplösa lipiderna i 2 ml kloroform och värma upp flaskan under 30 sek under en 60 ° C vattenbad.
- Avlägsna kloroform med användning av en rotationsindunstare. Placera den erhållna lipidfilmen under högt tryck vakuum O / N.
- För 10 ml HTLC, hydratisera lipidfilmen med 5 ml 0,1 N Tris-buffert (pH 7,4) under 1 h. Samtidigt, väg upp 162,4 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoglycerol (DPPG) lipid och 100 mg CDDP pulver och hydrat wed 5 ml 0,1 N Tris-buffert innehållande 30% etanol (pH 7,4) under 1 h.
- För Gd-HTLC formulering, väg upp samma mängd DPPG lipid och 10 mg CDDP-pulver, sedan hydratiseras med 2,5 ml Gd-HP-DO3A-lösning (279,3 mg / ml) plus 2,5 ml 0,1 N Tris-buffert innehållande 30% etanol ( pH 7,4) under 1 h. Under hydratisering, måste blandningarna förvaras i bruna ampuller och placerades på en värmeplatta vid 70 ° C under konstant omröring och vortexa varje 10 min.
- Kombinera lipidblandningen och lipiden läkemedelsblandningen, och återigen hydratisera i en timme. Vortex varje 15-20 min.
- Montera 10 ml extruder med två staplar av 200 nm polykarbonatfilter. Anslut thermobarrel extruderns till ett cirkulerande vattenbad vid 70 ° C, och anslut extrudern till en komprimerad kväve tank.
- Omedelbart efter hydratisering, överföra blandningen i strängsprutningskammaren. Öppna kväveflödet (inställt tryck till 200 psi) för att extrudera liposomerna genom membranen. Samla upp liposomes i en 50 ml tub. Håll röret i ett varmt vattenbad (70 ° C) vid alla tidpunkter under extruderingsprocessen. Upprepa denna process 5 gånger.
- Demon extrudern och ändra till två staplar av 100 nm polykarbonatfilter. Sätt ihop extrudern och ange trycket till 400 psi. Upprepa steg 5, med undantag pressa liposomerna 10 gånger. Samla provet från den slutliga strängsprutningen till en 15 ml-rör.
- Kyl ner liposomerna till RT, och centrifugera vid 1000 xg under 3 min för att fälla olöslig CDDP.
- Dialysera liposomerna O / N mot 0,9% saltlösning i dialysrör med en 15 tusen molekylviktsgräns (MWCO) under sterila betingelser.
- Späd 10 pl av liposomerna i 990 ul destillerat vatten. Använd dynamisk ljusspridning för att mäta storleksfördelningen av HTLC och Gd-HTLC. Utför 3 mätningar med 10 körningar vardera.
- Späd 40 fil liposomerna i 3,960 il destillerat vatten. Gör 5-6 standardlösningar av platina och gadoliniumi koncentrationsområdet av 0,1 till 20 | ig / ml. Mät platina och gadolinium koncentrationer genom induktivt kopplad plasma-atomemissionsspektrometer (ICP-AES) på 3 olika våglängder. Utför 3 mätningar vid varje våglängd för genomsnittliga resultat.
- Bestäm gel till flytande kristallin fas övergångstemperaturen (Tm) hos HTLC liposomformuleringen med användning av en differentiell svepkalorimeter (DSC). Belastning 5-10 mg HTLC till en DSC-pan och använda en tom kastrull som referens. Använd en svephastighet av 5 ° C / min till ramp upp temperaturen från 0 ° C till 60 ° C.
- Wrap liposomerna i aluminiumfolie för att förhindra ljusexponering och förvara vid 4 ° C.
2. In vitro Kommuniké från liposomer
- Förbered centrifugeringskolonner.
- Inkubera 50 g gelfiltrering pärlor i 400 ml 0,9% koksaltlösning vid RT i 3-4 h. Rulla upp en bit glasull, våt med 0,9% saltlösning och placera den i spetsen på en 1 ml spruta. Tryck på glasull för att fylla ca 0,05-0,1 ml sprutan. Använd en glaspipett att gradvis tillsätt ca 1 ml gel filtermaterial i sprutan.
- Placera sprutan i ett 15 ml rör och centrifugera vid 1000 xg under 3 min. Avlägsna spinnkolonn och placera den i en 15 ml-rör.
- Prov 400 il HTLC eller Gd-HTLC i 8 1-dram glasflaskor och inkubera i en temperaturkontrollerad vattenbad vid antingen 37 ° C eller 42 ° C. Ta ut en flaska vid varje tidpunkt (dvs 5, 15, 30 och 60 min) och omedelbart placera den på is.
- Tillsätt 100 ni 0,9% koksaltlösning i den förberedda spinnkolonn, tillsätt sedan 100 | il av HTLC eller Gd-HTLC före inkubering (kontroll) eller efter inkubering i vattenbadet i spinnkolonn. Centrifugera vid 1000 x g under 3 minuter. Ta bort sprutan från röret och späd lösningen i röret för ICP-AES-analys.
3. Implantation av subkutan xenograft av CervicalTumör
- Samtliga djurstudier utfördes enligt djur använda protokoll som godkänts av Animal Care kommittén för University Health Network (UHN).
- Utför alla djurstudier i en biosäkerhet skåp (BSC). Autoklav alla kirurgiska verktyg innan någon form av operation. Efter varje operation, torka av kirurgiska instrument med 70% etanol och sterilisera igen med en varm pärla autoklav.
- För dödshjälp, placera djuret i en isolerad CO2 kammare, sedan utföra halsdislokation.
- För allmänna anestesi använder 100% syre, använder 5% isofluoran för induktion och 2% för underhåll. För att säkerställa djup anestesi, utöva påtryckningar med pincett till palmar ytan av trampdynan för att observera djur svar. Applicera ögon smörjmedel för att förhindra torrhet under narkos.
- För ett djur som har genomgått en operation, placera djuret i en ren bur utan sällskap av andra djur. Övervaka tills tillräcklig medvetenhet återfås.
- KulturME-180-celler i alfa-minimalt essentiellt medium (α-MEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och antibiotika.
- Skörda cellerna och hålla cellerna i komplett medium före ympning. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer.
- Inokulera varje donator mus att bära en intramuskulär (im) ME-180 (humana cervical cancerceller) tumör.
Obs: Tillväxt på im hemsida har valts ut för att säkerställa utvecklingen av väl vaskulariserade tumörer. Köp kvinnlig SCID-möss (i åldern 6-8 veckor, cirka 20 g) från en egen avelsanläggning.- Söva en kvinnlig SCID-mus och injicera 1 x 10 6 ME-180-celler i gastrocnemiusmuskeln i bakbenet med användning av en 27 G-nål.
- Mät tumörstorlek med hjälp av en passare tills tumörerna har nått 9-12 mm i deras längsta dimension. Avsluta studien om tumören har överskridit 12 mm, eller om tumörmassan äventyrar normalt beteende, ambulering, mat och vattenintag.
- Implantattumörstycken från donatormöss till recipientmöss.
- Söva en donator musen med 5% isofluoran. Euthanize musen med cervikal dislokation under anestesi. Ta donatortumör från donatorn musen. Skär tumör i kubik fragment av 2-3 mm 3.
- Söva en mottagare musen med 5% isofluoran. Injicera 100 pl av 0,5 mg / ml meloxikam subkutant före operation. Applicera jod kirurgisk skrubblösning, därefter 70% etanol, och slutligen jodlösning till den rakade huden. Raka vänstra bakbenet hos mottagaren musen. Gör ett snitt i nivå med huden. Sätt en donator tumör stycke subkutant genom snittet. Stäng snittet med hjälp av 1-2 sår klipp (s).
- Ta bort clipsen 3-5 dagar efter implantation. Subkutan tumör krävs för att använda installationslaserbaserade uppvärmning.
- Låt tumörer att växa under 2-3 veckor innan värmebehandling.
4. Design, Assembly och kalibrering av en Conformal Laser Delivery belysning för In Vivo Uppvärmning
- Uppnå vävnadsuppvärmning med användning av en 763 nm diodlaser kopplad till en konform illuminator med användning av en optisk fiber.
- Belysnings ger jämn ytlig laser belysning av xenograft tumör. Den består av en 30 x 20 x 17 mm block av högreflekterande material innehållande tre angränsar ljusintegrerande kammar sfärer med en kammare i mitten (16 mm i diameter) och 2 små kammare på vardera sidan (16 mm i längd och 5 mm i diameter) (figur 1).
- För för ljuset att passera från en kammare till den andra, har två små hål 5 mm diameter skärs mellan de små yttre kamrarna och den större mittkammaren. Ljuset avges från lasern in i de yttre kamrarna med användning av en 400 | j, m snitt-fiberänden är ansluten till lasern som leds in i kammaren genom ett hål 600 um i diameter.
- På grund av ljusets natur interaction med kammarväggarna, är ljus avges i en av de små kamrarna spatialt homogeniserades därefter passerar genom de inre portarna in i den större kammaren där det vidare rumsligt homogeniserades. Ljus lämnar sedan diameter port 10 mm på mitten kammaren.
- Kalibrera belysningsljus leverans i förhållande till lasereffekt inställningen med en NIST kalibrerad 50 mm integrerande sfär för att mäta den avgivna effekt.
- Beräkna ljusfördelningen i tumören med hjälp av Monte Carlo-simuleringar baserade på en förenklad geometri av tumören. Generera Monte Carlo-kod i en anpassad algoritm skriven med en kommersiell beräknings programpaket och bas på standarden koden för Monte Carlo modellering av ljus transport i flerskiktade vävnader av Jacques et al. 14.
- Model tumören som en halvsfär som ligger på en plan hud linje med en diameter som matchar den genomsnittliga tumör dimension 7 mm vid hudytan och en hanight av 5 mm. Modell homogen belysning av ytan genom att slumpmässigt lansera fotoner hela den exponerade halvklotet och direkt i mitten av klotet.
- Använd optiska egenskaper inklusive absorption, | j a = 0,025 mm -1, spridning, = μ s 10 mm -1, anisotropi faktor, g = 0,9 och brytningsindex, n = 1,4. Använd en miljon fotoner i beräkningen.
- Utför dessa mätningar före eventuella in vivo värmeexperiment utan ytterligare ändringar efter ursprunglig kalibrering.
5. Conformal Uppvärmning av tumör använder Skräddarsydda Laser Chamber Setup
- Anslut en ände av en laser fiber till laseranordningen och den andra änden till illuminatorn.
- Söva djuret med användning av 5% isofluoran. Sätt i en 27 G injektionskatetern i den laterala svansvenen på musen. Sätt i en 22 G kateter in i centrum av tumören. Placera en fiberoptisk temperatur probe in i den ihåliga katetern för att övervaka temperaturändring.
- Täck hela tumören med belysnings (figur 2). Först ställa in kraften till 0,8-1 W. Slå på lasern och vänta tills temperaturen att stiga. Upprätthåll temperaturen av tumören vid 42 ° C genom manuell justering av lasereffekten mellan 0,1-0,8 W.
6. Temperatur Distribution utvärderas genom MR Termometri (MRT)
- Mät fördelningen av den uppvärmda tumören med hjälp av installationslaserbaserade uppvärmning genom protonresonansfrekvensen shift (PRF-skift) MRT på en 7 Tesla preklinisk MR-systemet 15 i samband med fiberoptiska temperatursondmätningar temperatur.
- Skaffa termometri bilder med 10 sek intervall med användning av en 2D-FLASH pulssekvens (ekotid 4,5 ms; repetitionstid 156,25 msek) med 312 x 312 ^ m i-planet upplösning och 2 mm snittjocklek i en enda skiva vid nivån för den fiberoptiska temperatur provara.
7. MR Övervakning av Agent Release
- Utför T 1-viktade avbildning före och 20 minuter efter administrering av Gd-HTLC.
- Implantat två tumörer, en på vardera av bakbenen, av en kvinnlig SCID musen med den metod som beskrivs ovan i avsnitt 3 för implantation. Förvärm tumören på vänster bakben under 5 minuter vid 42 ° C före injektion av Gd-HTLC vid en dos av 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A och 1,4 mg / kg CDDP, sedan upphetta tumören under ytterligare 20 min efter injektion. Utför injektion under värmebehandling. Använd tumör på höger bakben som en ouppvärmd kontroll.
- Förvärva dynamiska MR-bilder (36 x 20 mm field-of-view, 200 x 200 ^ m i-planet upplösning, 2 mm skivtjocklek; MR sekvensprotokoll) för att övervaka Gd-HP-DO3A frisättning vid 12 sek intervall för hela 20 minuter efter administrering av Gd-HTLC början 30 sekunder före injektion.
- Kontur tumören (uppvärmda och ouppvärmda) och muskelvolym.Beräkna medelvärdet MR-signalen av alla voxlar inom varje kontur volym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De HTLC liposomerna tillverkas med vanliga metoder, inklusive lipid filmbildning, fukt, extrudering och dialys. Under steg involverar CDDP, bör försiktighet iakttas inte utsätta CDDP till alla aluminiummaterial, såsom CDDP inaktiveras genom bildandet av en svart insättning. En illustration av HTLC visas i Figur 3. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos HTLC sammanfattades i ett manuskript som nyligen publicerades i Journal of Controlled Release 16. Gadolinium och platina koncentrationer av Gd-HTLC formulering är 1,87 ± 0,28 mg / ml och 0,10 ± 0,02 mg / ml, respektive.
Belysnings av installationslaserbaserad värme använder tre små, anslutna kammare som ger en homogen ljusfördelning (± 15%) vid 10 mm utloppsdiameter port. Beroende på den elektriska inställningen av lasern, är effekt som levereras inom intervallet 0,5 till 1,7 W / cm 2, som åtgärdd med användning av en kalibrerad integrerande sfär. Resultaten visas i figur 4 som ett tvärsnitt genom tumören. Under antagande av en total effekt på 1 W, är den maximala fluensen hastigheten vid varje punkt i tumören 70 mW / cm 2. Lasereffekten minskar med en faktor av två vid nivån huden jämfört med toppen fluensen strax under tumörytan.
Uppvärmning med hjälp av installationslaserbaserad värme genererar en relativt jämn temperaturfördelning karta, vilket bekräftas av PRF-shift MRT (Figur 5). PRF-shift MRT spår förändring den relativa temperatur från en absolut baslinjemätning förvärvats före uppvärmning av punktkällan (dvs fiberoptisk temperaturgivare).
Från MR signalanalys (figur 6C), visar den uppvärmda tumören den högsta relativa signalökning jämfört med ouppvärmda tumören och muskler efter administrering av Gd-HTLC, som upprätthålls fram till slutetav uppvärmningsperioden.
Figur 1. Design av belysnings. (A) Mått belysnings. (B) Mått i de inre kamrarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Illustration av installationslaserbaserad värme tillsammans med en temperaturövervakningsanordning. En laserfiber (blå linje) avger ljus till belysningen. En fiberoptisk temperatursond (gul linje) placerades i centrum av tumören genom en 22 G kateter för att övervaka temperaturändring. Realtids humörratur avläsningar visas på datorskärmen. Modifierad från Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk ritning av HTLC formuleringen (ej skalenlig). De lipidkompositioner, CDDP koncentration och storlek på HTLC liposomerna illustreras. Modifierad från Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Modeling lätt leverans till tumören med hjälp av små integrerande sfär. (A) Schematisk bild av modell som visar tumör upphöjd över det normala underliggande vävnad. Röda pilar representerar täckning och riktning inledande fotoner i beräkningen. Belysning täcker hela ytarean hos den upphöjda tumören. (B) Resultaten av beräkning som visar ljus fluens fördelning i tumören. (C) Tvärsnitts kurva över ljus fluens kontra djup, längs den vita streckade linjen visad i (B). Fluence takten i tumören på huden djupet är 50% av den maximala inflytande hastigheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Temperaturfördelning utvärderas genom MR termometri. &# 160;. (A) T 2 viktade bild som visar den anatomiska placeringen av de två bilateralt implanterade tumörer (B) Temperatur distribution karta som genereras från upphettning av vänster tumören till 42 ° C med hjälp av installationslaserbaserad värme, medan den högra tumören förblev ouppvärmd. Data analyseras på nytt från Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. MR övervakning av gadoteridol frisättning från Gd-HTLC liposomer vid värmeaktivering. T 1-viktade MR-bilder (samma fönster nivå tillämpas) på en mus som bär två subkutana ME-180 tumörer, med en på vardera av bakbenen ( A) före injektion av Gd-HTLC och(B) 20 min efter injektion av Gd-HTLC (dvs., efter det att hela upphettningsperioden). (C) Relativ MR-signal ändrar normaliserade till den första tidpunkten för den dynamiska MR förvärvet av mus visas i (A) och ( B). Data representerar medelvärde + SD. Data analyseras på nytt från Journal of Controlled Release 2014, 178, 69-78. 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Liposomer utvecklades först på 1960-talet som drug delivery fordon som transporterar hydrofila droger i deras inre vattenvolym och hydrofoba läkemedel inom deras lipiddubbelskikt 2. Förutom användning i terapeutiska tillämpningar, har liposomer undersökts för diagnostiska tillämpningar när märkt med radionuklider eller laddas med imaging kontrastmedel 17. Under de senaste åren, teranostik och terapeutiska diagnostiska par har bedrivits för att skapa möjligheter för bildstyrd patienten stratifiering och drug delivery 17,18. Den aktuella studien bygger på begreppet bildstyrd drug delivery för att utvärdera utlöst läkemedelsfrisättning från värmekänsliga liposomer med hjälp av en specialdesignad laserbaserad värme inställning enligt MR vägledning.
Såsom nämnts ovan, har vattenbad eller värmecentraler katetrar som vanligen använts för att värma subkutana tumörer. Vattenbadet metod kräver nedsänkning av hela lemmen i varmt water, att ge upphov till icke-specifik frisättning av läkemedel, i hela lemmen dessutom frisätta vid tumörstället. Användning av en värmekateter kräver placering av en 18 G kateter i centrum av tumören, och har visat att det krävs uppvärmning under en relativt lång tidsperiod (15 min) för att nå termisk stabilt tillstånd 11.
I den aktuella studien ger nydesignade installationslaserbaserad värme ett konformt sätt att leverera värme till tumörvolymen vilket framgår av MR-baserad bedömning av temperaturfördelningen kartan (Figur 5). Heterogenitet i PRF-shift kartan i ouppvärmda högra bakbenet och höger lem tumör i Figur 5 kan återspegla en kombination av låg signal-brus i närheten av känslighet artefakter och små fysiologiska eller värme-inducerade rörelser, vilket kan direkt kompromiss värme och utgångsbildregistrering men också införa små variationer i induktionsfält runtregioner i offset magnetisk känslighet. Dessutom visade det sig att termisk stabilt tillstånd skulle kunna uppnås inom 1-2 min av initiera uppvärmning. Punkten baserade fiberoptisk temperaturgivare tillåts för realtidsjustering av lasereffekten, för att hålla temperaturen vid 42 ° C och för att minimera temperaturväxlingar. Emellertid är det viktigt att placera den fiberoptiska temperaturgivaren i ett relativt centralt läge inuti tumören. MR kan användas för att validera snittet poäng för sensorn. Under upphettning bör lasereffekten justeras noggrant för att hålla temperaturen vid 42 ° C med en initial effekt på 0,8 W.
Värme protokollet optimeras genom realtidsövervakning av Gd-HP-DO3A frisättning som ett surrogat för drogen CDDP. Den effektiva frisättningen av inkapslade medel från HTLC liposomerna översättas till förbättrad effektivitet, med den uppvärmda HTLC gruppen resulterar i en betydande terapeutisk Advantage jämfört med andra behandlings- och kontrollgrupper 16.
Belysnings av uppvärmningsanordningen var utformad för att värma tumörer av 5-7 mm i den största dimensionen. Utformningen av belysnings skulle kunna modifieras för att värma större tumörer och flera fiberoptiska temperaturgivare skulle kunna införas i hela tumörvolymen för att övervaka temperaturen i jämförelse med det nuvarande enda punkt baserad mätning. Dessutom, eftersom den portabla enheten är tillverkad av MR-kompatibla material, tre-dimensionell MR-termometri kunde utföras för att utvärdera temperaturfördelningen i hela tumörvolymen.
Sammanfattningsvis ger laserbaserade uppvärmningsanordning ett värdefullt verktyg för preklinisk utveckling av värmekänsliga liposomformuleringar. Bildstyrd drug delivery metoder, såsom den som används i denna studie, har en betydande potential för klinisk översättning och genomförande av personlig medicin inklusive real-time övervakning av terapeutisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary evaporator | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG | Laborota 4000 | |
| High pressure extruder | Northern Lipids Inc. | T.001 | 10 ml thermobarrel |
| Heating circulator | VWR International LLC. | 11305 | Connected to extruder |
| Polycarbonate membrane filter | Whatman | 110605;110606 | |
| Differential scanning calorimeter (DSC) | TA Instruments | Q100 | |
| Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES) | PerkinElmer | Optima 7300DV | |
| Zetasizer | Malvern Instruments Ltd. | Nano-ZS | |
| Cell incubator | NuAire Inc. | NU-5800 | |
| Autoclip wound clip applier | Becton Dickinson | 427630 | |
| Autoclip wound clip remover | Becton Dickinson | 427637 | |
| Wound clips | Becton Dickinson | 427631 | 9 mm |
| 763 nm Laser device | Biolitec | Ceralas CD 403 laser | |
| Laser probe | Thorlabs Inc. | FT400EMT | With SMA and flat cleave connectors |
| Spectralon (illuminator) | Labsphere Inc. | FAST-SL-5CMX5CM | |
| CSTM-SL-5CMX5CM | |||
| 7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system | Bruker Corporation | Biospec 70/30 | |
| Fiber optic temperature sensor | LumaSense Technologies Inc. | Luxtron FOT Lab Kit | |
| Integrating sphere | Newport Corporation | 819C | |
| Optical power meter | Newport Corporation | 1830-R |
References
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Releas. 65 (1-2), 271-284 (2000).
- Simard, P., Leroux, J. C., Allen, C., Meyer, O. Liposomes for Drug Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Application. , American Scientific Publishers. (2007).
- O'Brien, M. E. R., et al. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCl (CAELYX (TM)/Doxil (R)) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast cancer. Ann Onco. 15 (3), 440-449 (2004).
- White, S. C., et al. Phase II study of SPI-77 (sterically stabilised liposomal cisplatin) in advanced non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 95 (7), 822-828 (2006).
- Laginha, K. M., Verwoert, S., Charrois, G. J. R., Allen, T. M. Determination of doxorubicin levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors. Clin Cancer Res. 11 (19), 6944-6949 (2005).
- Baronzio, G. F., Hager, E. D. Hyperthermia in cancer treatment: a primer. , Springer Science. (2006).
- Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale Drug Delivery and Hyperthermia: The Materials Design and Preclinical and Clinical Testing of Low Temperature-Sensitive Liposomes Used in Combination with Mild Hyperthermia in the Treatment of Local Cancer. Open Nanomed. 3, 38-64 (2011).
- Celsion Corporation. , Celsion Announces Updated Overall Survival Data from HEAT Study of ThermoDox http://investor.celsion.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=862248 (2014).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., ten Hagen, T. L. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27 (8), 1750-1754 (2010).
- Viglianti, B. L., et al. In vivo monitoring of tissue pharmacokinetics of liposome/drug using MRI: illustration of targeted delivery. Magn Reson Me. 51 (6), 1153-1162 (2004).
- Ponce, A. M., et al. Magnetic resonance imaging of temperature-sensitive liposome release: drug dose painting and antitumor effects. J Natl Cancer Ins. 99 (1), 53-63 (2007).
- Kong, G., et al. Efficacy of liposomes and hyperthermia in a human tumor xenograft model: importance of triggered drug release. Cancer Res. 60 (24), 6950-6957 (2000).
- Yarmolenko, P. S., et al. Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours. Int J Hyperthermia. 26 (5), 485-498 (2010).
- Wang, L. H., Jacques, S. L., Zheng, L. Q. MCML-Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Comput Meth Prog Bio. 47, 131-146 (1995).
- Rieke, V., Butts Pauly, K. MR thermometry. J Magn Reson Imaging. 27 (2), 376-390 (2008).
- Dou, Y. N., et al. Heat-activated thermosensitive liposomal cisplatin (HTLC) results in effective growth delay of cervical carcinoma in mice. J Control Release. 178, 69-78 (2014).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol Pharm. 7 (6), 1899-1912 (2010).
- Lee, H., et al. A novel 64Cu-liposomal PET agent (MM-DX-929) predicts response to liposomal chemotherapeutics in preclinical breast cancer models. Thirty-Fifth Annual CTRC-AACR San Antonio Breast Cancer Symposium. , (2012).
