Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) is een complex maaswerk van verknoopte eiwitten die biofysische en biochemische signalen die belangrijke regulatoren van celproliferatie, overleving, migratie, etc. Het ECM speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling en in diverse pathologieën waaronder hart- en voorziet en aandoeningen van het bewegingsapparaat ziekten, fibrose en kanker. Aldus karakteriseren van de samenstelling van ECM's van normale en zieke weefsels kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe prognostische en diagnostische biomarkers en potentiële nieuwe therapeutische doelwitten. Echter, de aard van ECM eiwitten (groot in omvang, verknoopt en covalent gebonden, zwaar geglycosyleerd) biochemische analyse van ECM uitdagende gesmolten. Om deze uitdaging te overwinnen, ontwikkelden we een methode om ECM verrijken van verse of diepgevroren weefsels en tumoren die gebruik maakt van de onoplosbaarheid van ECM eiwitten. We beschrijven hier in detail de cellen ontdoen procedure die bestaat uit opeenvolgende incubations in buffers van verschillende pH en zout en afwasmiddel concentraties en dat resulteert in 1) de winning van intracellulaire (cytosolisch, nucleaire, membraan en cytoskelet) eiwitten en 2) de verrijking van ECM eiwitten. Vervolgens beschrijven we hoe deglycosylate en te verteren-ECM verrijkt eiwitpreparaten in peptiden voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) is een complex maaswerk verknoopt en geglycosyleerde eiwitten die bouwkundige ondersteuning en verankering van cellen en definieert bepaalt gedeeltelijk biomechanische eigenschappen weefsels "1,2. ECM eiwitten ook signaal aan de cellen hetzij direct via hun receptoren (bijvoorbeeld integrinen syndecans, enzovoort) of door het moduleren groeifactor signalering 3. De ECM geeft dus biofysische en biochemische signalen die belangrijke regulatoren van cellulaire processen zoals proliferatie, overleving, polarisatie, differentiatie, migratie, etc.
De ECM speelt een belangrijke rol in de fysiologie, ontwikkeling en veroudering 4. Bovendien verschillende pathologieën, zoals hart- en vaatziekten, fibrose, spier-skelet ziekten, kanker, veroorzaakt door of resulteren in ECM wijzigingen. Bovendien is de ECM bijdraagt tot de instandhouding van stamcelniches vastgelegd en de belangrijkste ECM moleculen thop steun stemness zal directe toepassing in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde 5 hebben. Ondanks het belang ervan, is de ECM gebleven tot voor kort onderbelichte 6.
In silico analyse is gebleken dat de matrisome, gedefinieerd als het geheel van ECM en ECM-geassocieerde eiwitten omvat de produkten van honderden genen in zowel het menselijke genoom en de muis 1,7,8. Echter, de onoplosbaarheid van ECM eiwitten systematische karakterisering van de samenstelling van in vivo extracellulaire matrices van normale en pathologische monsters belemmerd. We hebben onlangs aangetoond dat deze onoplosbaarheid kan worden gedraaid voordelig worden gebruikt voor ECM proteïnen verrijken 8-10. Wij en anderen verder aangetoond dat massaspectrometrie is een voorkeurswerkwijze voor de samenstelling van ECM's te karakteriseren 8 - 10, 13.
Webeschrijf hier een decellularisatie procedure die bestaat uit opeenvolgende incubaties in buffers van verschillende pH en zout en afwasmiddel concentraties. Deze procedure resulteert in de extractie (of depletie) cytosolisch, nucleaire membraan en cytoskeleteiwitten en verrijking van ECM eiwitten. Vervolgens beschrijven we hoe ECM-verrijkte eiwitpreparaten verteren in peptiden voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie.
De gedetailleerde procedures en hier weergegeven hebben we met succes verrijkt en gekenmerkt met massaspectrometrie de extracellulaire matrices uit tien verschillende weefsels en soorten tumoren Normale muizen long 8, menselijke en murine colon 8,9, humane lever 9, humane colorectale tumoren en afgeleide levermetastasen 9, melanoom xeno-transplantaten 8, mammaire tumor xenotransplantaten 10 van muis pancreaseilandjes en murine insulinomen (Naba et al., ongepubliceerd). Vergelijking van de verschillende matrisomes geopenbaard weefsel- en tumorspecifieke ECM handtekeningen die verder kan worden gebruikt als potentiële diagnostische of prognostische biomarkers.
We geloven dat deze procedure kan worden toegepast op andere monsters zonder of met relatief kleine aanpassingen.
Protocol
OPMERKING: De procedure kan worden uitgevoerd op vers of flash ingevroren weefsels. We raden perfusie vaatrijke weefsels met PBS op het moment van dissectie rode bloedcellen en plasma-eiwitten te elimineren. We raden niet aan het uitvoeren van de procedure op vaste weefsels als fixatie (dwz chemische verknoping) interfereert met decellularisatie en kan ook aanzienlijk compromis daaropvolgende massaspectrometrie analyse. Voor de gehele procedure, raden we het gebruik van lage-retentie buizen en pipet tips om eiwitten en peptiden herstel te maximaliseren.
1. Decellularisatie van weefsels of tumoren
OPMERKING: Voordat Bereid reagentia en voeg proteaseremmers (geleverd bij het compartiment Protein Extraction kit) om het gewenste volume van elke buffer. Alle buffers en monsters moeten worden bewaard op ijs gedurende de duur van het experiment behalve Buffer CS dat moet bij kamertemperatuur worden gehouden SDS neerslag voorkomenitation.
Opmerking: Het protocol maakt gebruik van een reeks incubatie in buffers met verschillende pH en met verschillende hoeveelheid zouten en detergentia extract intracellulaire eiwitten opeenvolgend verrijken onoplosbare ECM eiwitten (Figuur 1, Tabel 1; zie tevens alternatieven voor het gebruik van de commerciële kit hier beschreven). De hoeveelheden reagentia worden hieronder gegeven voor 100 mg van weefsels of tumoren (zie tabel 1) en moeten dienovereenkomstig aangepast.
- Homogeniseer 100 mg weefsel in 500 pl buffer C met proteaseremmers met een tissue homogenisator totdat het weefsel volledig wordt verstoord en een homogene suspensie wordt verkregen.
OPMERKING: Voeg deoxyribonuclease I (eindconcentratie: 200 ug / ml, gereconstitueerd volgens de instructies van de fabrikant) en ribonuclease A (eindconcentratie 20 ug / ml, opgelost volgens de instructies van de fabrikant) omBuffer N. - Sequentiële extractie van intracellulaire oplosbare proteïnen
- Extractie van cytosolische eiwitten. Incubeer het homogenaat op een buis rotator gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Sla een kleine hoeveelheid (10 pl tot 20 pl) van het homogenaat voor daaropvolgende Western blot-analyse (zie Verwachte resultaten doorsnede en figuur 2).
- Centrifugeer het homogenaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis, zal dit de cytosolische (C) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C.
- Te wassen, resuspendeer de pellet in 400 pl buffer W bevattende proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het homogenaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Het afzuigen, kerneiwitten, resuspendeer de pellet in 150 pl buffer N bevattende proteaseremmers, deoxyribonuclease I en ribonuclease A en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis. Herhaal deze stap eenmaal: Na het centrifugeren van het monster voor de tweede maal, voeg de supernatant aan de vorige supernatant: dit zal de kern (N) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C. Dan, wassingen presteren als per stap 1.2.3.
- Membraaneiwitten te extraheren, resuspendeer de pellet in 100 pl buffer M bevattende proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis: dit zal het membraan (M) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C.
- Om cytoskeleteiwitten extraheren, resuspendeer de pellet in 200 ui buffer CS bevattende proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Merk op dat de pellet niet volledig oplost. Wij stellen voor het verstoren van de pellet door en neer te pipetteren totdat waarnemen verstoring van de pellet. - Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis. Hierbij aan een verdere scherpe afname van de grootte van de pellet (zie video).
- Resuspendeer de pellet in 150 ul buffer C met proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof toevoegen aan het vorige supernatant: dit zal het cytoskelet (CS) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C.
- Voer extra wasbeurten. Resuspendeer de pellet in 500 pl PBS met proteaseremmers and incuberen van het monster op een buis rotator gedurende 5 min bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal deze stap drie keer.
Opmerking: Alle sporen van detergentia moeten worden verwijderd door uitgebreid wassen voorafgaand aan digestie van de eiwitten in peptiden (zie sectie 3). Op dit punt kan de ECM-verrijkte pellet snel bevroren en bij -80 ° C bewaard. Merk op dat de grootte van de pellets is afhankelijk van de hoeveelheid onoplosbare (ECM) proteïnen in het uitgangsmateriaal en de efficiëntie van de decellularisatie.
2. Monitoring van de kwaliteit van de Decellularisatie / ECM Verrijking door SDS-PAGE en Western Blot
- Meng 10-20 pl aliquot van de totale weefselextract en 50 pi aliquots van tussenproduct fracties met Laemmli buffer bevattende 100 mM DTT. Resuspendeer de ECM-verrijkte, onoplosbare fractie in 3 x Laemmli buffer bevattende 100 mM DTT.
Let op: hij verhoogde concentratiesDTT en SDS helpen bij het oplosbaar maken van ECM eiwitten die relatief onoplosbaar zijn. - Scheid de eiwitten door SDS-PAGE en overgebracht naar nitrocellulose membranen.
- Voer immuun-blots met behulp van antilichamen voor eiwitten die representatief zijn voor elk van de cytosolische, kern, membraan, cytoskelet en ECM fracties monitor (zie Representatieve resultaten sectie tabel 2 en figuur 2).
3. In-oplossing vertering van eiwitten te peptiden voor massaspectrometrie Analyse
Opmerking: Het na het van cellen ontdoen behandeling en verwijdering van SDS pellet sterk verrijkt in onoplosbare ECM eiwitten voor verdere analyse door massaspectrometrie deze eiwitten moeten worden gedigereerd tot peptiden. Merk op dat, als gevolg van ECM eiwitten onoplosbaarheid is het niet mogelijk deze stap aan de eiwitconcentratie van het monster te meten. We bieden dus volumes van de reagentia aan de ECM-enri verterenChed samples in peptiden op basis van de grootte (mm) of drooggewicht van het ECM-verrijkte pellet (tabel 3). De oplossingen van ammonium bicarbonaat, ureum, DTT, joodacetamide en trifluorazijnzuur moeten allemaal vers worden bereid.
- Resuspendeer de ECM-verrijkte monster door het toevoegen van de juiste hoeveelheid van 8 M ureum op de ECM-verrijkte pellet en voeg DTT in een eindconcentratie van 10 mM (zie Tabel 3). Incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C.
LET OP: op dit punt de ECM eiwitten niet volledig zal worden opgelost en de zichtbare grote eiwitdeeltjes mag niet door centrifugeren of filtratie worden weggegooid. De schorsing zal duidelijk op deglycosylatie en de spijsvertering (zie video). - Alkylering
- Bereid de joodacetamide oplossing in HPLC-grade water. Laat het monster tot kamertemperatuur en voeg de joodaceetamide tot een eindconcentratie van 25 mM. Voor volledige alkylering, de DTT: moet iodoacetamide verhouding tussen 1: 2.5 en 1: 3.
- Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Deglycosylatie:
Opmerking: deglycosylatie is nodig koolhydraatzijketens die interfereren met de identificatie van peptiden gemodificeerd door N-gebonden glycosylering te verwijderen.- Verdun tot 2 M ureum met 100 mM ammoniumbicarbonaat pH 8,0 en voeg de juiste hoeveelheid PNGaseF (zie tabel 3). Incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Spijsvertering
- Voeg Lys-C en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. Voeg de trypsine en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm O / N bij 37 ° C.
LET OP: de ECM-rijke schorsing die troebel bij eerste reconstructie in 8M ureum begon verschijnt duidelijk na O / N spijsvertering (zie video). - Voeg een tweede portie van het monster met trypsine en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende nog 2 uur bij 37 ° C. </ Li>
- Voeg Lys-C en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. Voeg de trypsine en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm O / N bij 37 ° C.
- Verzuring
- Na voltooiing van de vertering, het trypsine te inactiveren door aanzuren van het monster met vers bereide 50% trifluorazijnzuur (TFA). Het monster moet pH <2. bereikt Wij stellen voegen 1-1,5 pi 50% TFA in een tijd en onder gebruikmaking van 1 pl van de peptide-oplossing om de pH van de oplossing met pH-papier (zie video) te meten.
- Centrifugeer het aangezuurde monster bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone low-retentie buis. Op dit punt kan de peptide oplossing worden bewaard bij -20 ° C.
- Ontzouten
Merk op: dat de laatste stap wordt gewoonlijk uitgevoerd bij een massaspectrometrie faciliteit naar eigen voorkeurswerkwijzen.- Vóór proteomics analyse ontzouten de monsters en peptiden geëlueerd met vers bereide 60% acetonitril, 0,1% trifluorazijnzuur, gevolgd door concentreren in vacuüm concentrator. Resuspendeer de peptiden in vers bereide 3% acetonitrile, 0,1% trifluorazijnzuur 8.
OPMERKING: dat na ontzouting, de concentratie van de peptide-oplossing kan worden gemeten door spectrofotometrie (zie verwachte resultaten sectie). - Nu analyseren de steekproef door massaspectrometrie, opnieuw volgens de optimale procedures van de massaspectrometrie faciliteit.
LET OP: We moedigen onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het karakteriseren van de samenstelling van de ECM's met behulp van massaspectrometrie om te verwijzen naar onze andere publicaties 8 - 10 en de website die een meer gedetailleerde uitleg, met inbegrip van LC-MS / MS parameters, massa-spectrometrie zoeken gegevens voor de identificatie en data-eiwit analyses met behulp van de in silico matrisome annotatie instrument dat we ontwikkeld 8.
- Vóór proteomics analyse ontzouten de monsters en peptiden geëlueerd met vers bereide 60% acetonitril, 0,1% trifluorazijnzuur, gevolgd door concentreren in vacuüm concentrator. Resuspendeer de peptiden in vers bereide 3% acetonitrile, 0,1% trifluorazijnzuur 8.
Representative Results
Kwaliteitscontrole van de decellularisatie procedure
De efficiëntie van de decellularisatie kan worden gevolgd door het analyseren van het eiwitgehalte van elke fractie met western blot. Tabel 2 lijsten eiwitten van diagnostische waarde voor de kwaliteit van de cellen ontdoen procedure te beoordelen. Figuur 2A toont de efficiënte extractie de halfproducten cytosolische (GAPDH ), kern (histonen), membraan (β1 integrine) en cytoskelet (actine) eiwitten, terwijl geen ECM eiwitten (collageen I) gedetecteerd in deze fracties (Figuur 2). Op zijn beurt wordt de definitieve pellet verrijkt aan ECM eiwitten en grotendeels ontdaan van intracellulaire eiwitten (Figuur 2A). Figuur 2B toont bevredigende intracellulair proteïne afbraak (geen histone wordt gedetecteerd in de ECM-fractie), ofschoon actine nog steeds kan worden gedetecteerd in de ECM-rijke fractie en de depletie van monomeer collageen I- Schijnbaar molecuulgewicht ~ 110 kDa, vermoedelijk overeenkomend met gemonteerde collageen I - kan worden waargenomen in de CS fractie.
We hebben ook regelmatig andere ECM eiwitten zoals fibronectine en laminine bewaken, hoewel in sommige weefsels kunnen deze componenten gedeeltelijk opgelost in eerdere fracties 8-10. Bijvoorbeeld, fibronectine komt voor als oplosbare plasma fibronectine dat niet in de ECM opgenomen. Perfusie van het weefsel vóór de extractie vermindert plasma fibronectine concentratie maar niet altijd elimineren. In sommige weefsels, worden laminins gevonden losjes verbonden aan het celoppervlak of de ECM en extract in intermediaire fracties. Als dit gebeurt kan worden aangepakt door een wijziging van de extractie (zie Discussie).
Merk op dat de verrijking van ECM eiwitten en gelijktijdige depletie van intracellulaire componenten is gebaseerd op de relatieve oplosbaarheid van eiwitten in de verschillende buffers. This verschilt tussen verschillende weefsels - in sommige gevallen de histonen en actine zijn gemakkelijker geëxtraheerd dan in andere. Merk ook op dat hoewel histonen worden verwacht in de N fractie (Figuur 2B) te extraheren, zien we vaak een volledige depletie van histonen in de M of CS fractie (figuur 2A en B).
Indicatieve peptide concentratie verwacht
De concentratie van de peptide oplossing verkregen na digestie, aanzuring en ontzouten kan worden gemeten door spectrofotometrie of door de absorptie van de peptideoplossing met de 280 nm golflengte overeenkomend met tryptofaan, tyrosine, of met de 205 nm golflengte die overeenkomt met de absorptie van het peptide obligaties.
We maten de concentratie van de uit de cellen ontdoen van drie muizen long monsters peptideoplossingen (82 mg, 100 mg en 100 mg, respectievelijk) preparrood in parallel, verkregen uit elk: 424 ng / ul, 450 ng / ul en 580 ng / ul peptiden resp.
Identificatie van ECM peptiden met behulp van massaspectrometrie
Massaspectrometrische analyse van de samenstelling van ECM-eiwit verrijkte monsters, bereid zoals hier beschreven, toonde aan dat> 70% van de signaalsterkte overeenkomt met ECM en ECM-geassocieerde eiwitten 10/08.
Tabel 1. Volume reagentia uit Compartimentele Extraction kit om 100 mg (nat gewicht) van weefsel of tumor decellularize. Deze tabel geeft de samenstelling en het volume van elke buffer gebruikt voor de decellularisatie van 100 mg weefsel of tumor voeren. Een cocktail van proteaseremmers wordt geleverd als 50x oplossing en moet worden toegevoegd aan elke buffer 2.
| Reagentia van compartiment Protein Extraction Kit | Volume voor 100 mg van het weefsel | Samenstelling (op basis van Millipore datasheet cat # 2145 1) |
| Buffer C | 500 gl | HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, EDT 4, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat 5 |
| Buffer W | 400 gl | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat |
| Buffer N | 150 ul 2 x | HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glycerol, natriumorthovanadaat |
| Buffer W | 400 gl | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat |
| Buffer M | 100 gl | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natrium deoxycholaat (DOC) 6, NP-40 6 |
| Buffer CS | 200 gl | PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sucrose, natriumdodecylsulfaat (SDS) 7, natriumorthovanadaat |
| Buffer C | 150 gl | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat |
| 1x PBS | 500 pl / wasbeurt | - |
Opmerkingen:
1 Voor eigen redenen, we waren niet in staat om de precieze samenstelling van de buffers van de leverancier van de kit te krijgen, maar we zijn onder andere hier wat aantekeningen op basis van onze eigen ervaring met behulp van zelfgemaakte buffers om soortgelijke extracties uit te voeren.
2 Protease inhibitor: het is wenselijk om een verscheidenheid van remmers tegen cysteïne, serine en threonine peptidasen, serine-esterasen, divalente kationen omvatten metalloproteasen etc.Vele commercieel verkrijgbare protease-inhibitor cocktail bestaan.
3 pH boven 7,0 is een effectieve remmer van lysosomale proteasen.
4 EDTA (meestal gebruikt bij een 2 mM) is een effectieve remmer van divalente kationen proteases.
5 natriumorthovanadaat een fosfatase-inhibitor. Een typische effectieve concentratie zou 0,5-5 mM.
6 NP40 0.1% -0,5% voldoende om de meeste membraanlipiden oplosbaar. De combinatie van NP40 en DOC - vaak in gelijke concentraties (bijvoorbeeld 0,5% van elk) - wordt vaak gebruikt als een strengere extractie die nog laat vele eiwit-eiwit interacties intact.
7 SDS is een strengere ionisch detergens (CMC 0,1%). Het kan ook worden gebruikt in combinatie met de andere twee detergentia SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% als gemiddelde stringentie buffer.
Tabel 2. Diagnostische eiwittenbewaken van de kwaliteit van de cellen ontdoen procedure. Deze tabel geeft voorbeelden van eiwitten die kenmerken van elk subcellulair compartiment (cytosol, nucleus, plasmamembraan, cytoskelet en ECM) die kunnen worden gebruikt om de kwaliteit van de cellen ontdoen procedure en de doelmatigheid van het toezicht ECM-verrijking.
| Intracellulaire compartiment | Diagnostic Eiwitten |
| Cytosolische eiwitten | Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) |
| Kerneiwitten | Histonen, lamins, Nucleoporin |
| Membraaneiwitten | Integrinen, transferrinereceptor |
| Cytoskeleteiwitten | Actine, tubuline, Vimentin |
| Basaal membraan ECM eiwitten | Collageen IV, Nidogens, laminins |
| Interstitiële ECM eiwitten (interstitiële) | Collageen I, collageen III, collageen VI, Fibronectine |
Voor aanbeveling over antilichamen, zie onze publicaties 8-10.
Tabel 3. Volume van de reagentia te ECM verrijkte monsters in peptiden te verteren. Deze tabel geeft de reagentia gebruikt om ECM verrijkt eiwit monsters mengen en te verminderen, alkylaat, deglycosylate en te verteren eiwitten monsters in peptiden voor massaspectrometrie analyse.
| Reagentia | Voorbereiding | Uiteindelijke concentratie / bedrag voor 1 mm dik pellet (~ 5-10 mg droog gewicht) | Volume 1 mm dik pellet (~ 5-10 mg droog gewicht) |
| Ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) | 100 mM oplossing in HPLC-grade water | - | - |
| Ureum | 8 M oplossing in 100 mM ammoniumbicarbonaat | 8 M | 50 gl |
| Dithiothreitol | Reconstrueren in HPLC-grade water bij 500 mM | 10 mM | 1 gl |
| Joodacetamide | Reconstrueren in HPLC-grade water bij 500 mM | 25 mM | 2,5 pl |
| Peptide N -Glycosidase F (PNGaseF) | Commercieel oplossing bij 500 U / gl | 1.000 U | 2 pi |
| Endoproteinase LysC, massaspectrometrie-grade | Reconstrueren in HPLC-grade water bij 0,5 ug / ul | 1 ug | 2 pi |
| Trypsine, massaspectrometrie-grade (rond 1) | Commercieel oplossing bij 0,5 ug / ul | 3 ug | 6 pi |
| Trypsine, massaspectrometrie-waardering (ronde 2) | Commercieel oplossing bij 0,5 ug / ul | 1.5 ug | 3 gl |
| Trifluorazijnzuur (TFA) | 50% oplossing in HPLC-grade water | - | 2-5 pi |
| Acetonitril (elutie) | 60% oplossing met een 0,1% TFA in HPLC-grade water | - | 500 gl |
| Acetonitril (reconstitutie) | 3% oplossing met een 0,1% TFA in HPLC-grade water | - | 100 gl |
Figuur 1. Schema van de experimentele procedure. Schematische workflow van de protocol aan weefsels (deel 1) decellularize, controle van de kwaliteit van de decellularisatie en evalueren van de ECM verrijking (hoofdstuk 2) en te verteren-ECM verrijkt eiwit monsters in peptiden voor massaspectrometrie analyse (hoofdstuk 3).
Figuur 2. Kwaliteitscontrole van de decellularisatie procedure met western blot Western blots werden uitgevoerd op muizen long (A) en humaan borstcarcinoom xenograft (B) monsters met de volgende antilichamen:. Konijn anti-actine (kloon 14-1) en konijn anti- -β1 integrine antilichamen die in ons laboratorium; konijn anti-collageen I, muis anti-GAPDH en konijn anti-pan-histonen antilichamen waren van Millipore. Na primaire antilichaam incubatie werden de membranen gewassen en geïncubeerd in de aanwezigheid van HRP-geconjugeerd geit anti-konijn of geit anti-mouse secundair antilichaam van Jackson ImmunoResearch Laboratory. Tenslotte werden de membranen gewassen en geïncubeerd in Western Lightning Chemiluminescence Reagent ™ (PerkinElmer LAS). * Geeft minimal residual histon verontreiniging van de ECM-fractie. ** Geeft gedeeltelijke uitputting van monomeer (vermoedelijk niet gemonteerd) collageen I in de CS-fractie. *** Geeft resterende actine verontreiniging van de ECM-fractie. De gedetecteerd met de anti-collageen-antilichaam vlek vertegenwoordigt verschillende post-translationele modificaties (bijvoorbeeld verknoping, glycosylering).
Discussion
Wijzigingen
Hoewel we in dienst deze exacte procedure om de ECM verrijken van tien weefsel en tumor types 8-10, dienen wijzigingen van het protocol te worden beschouwd in de volgende gevallen:
1) Detectie van ECM eiwitten in de tussenliggende fracties.
Extracellulaire matrix van verschillende weefsels of tumorsoorten kunnen verschillen in hun extraheerbaarheid / onoplosbaarheid, zoals hierboven besproken voor fibronectine en lamininen. Bijvoorbeeld wordt aangenomen dat de ECM van fibrotische weefsels of verbouwen weefsels keert zeer dynamisch en daardoor zou men zich aan een groter deel van ECM eiwitten in die weefsels gemakkelijker extraheerbaar 12 zijn. Afhankelijk van de fractie waarin ECM eiwitten worden gedetecteerd, stellen we het verminderen van de incubatietijd van de trede waardoor de winning van ECM eiwitten of weglaten van deze stap.
2) Detection van een aanzienlijk deel van intracellulaire componenten in de ECM-verrijkte pellet. In sommige weefsels of tumorsoorten de verhouding cellen: ECM is bijzonder hoog (bijvoorbeeld lever, milt, non-desmoplastisch tumoren). In dat geval kan een aanzienlijke verontreiniging van het ECM-verrijkte fractie door intracellulaire eiwitten (met name cytoskelet proteïnen en / of histonen) worden waargenomen. Om intracellulaire eiwitten efficiënt, raden we herhalen tweemaal de incubatie in buffer M en / of Buffer CS (beide met detergenten, deze put meestal overvloedige intracellulaire eiwitten) afbreken. Een ander alternatief zou zijn om alternatieve buffers met hogere concentraties detergent, met het voorbehoud dat dit kan leiden tot de uitputting van relatief beter oplosbaar ECM eiwitten en (zie volgende paragraaf).
3) Methode voor het gebruik van een commerciële kit.
We waren niet in staat om eigen redenen om de precieze samenstelling van de buffers weer te verkrijgenm de leverancier van de Compartimentele Protein Extraction kit. We hebben echter in Tabel 1 toelichting basis van eigen ervaring met zelfgemaakte buffers met gedefinieerde detergens (NP-40, natriumdeoxycholaat en SDS) concentraties vergelijkbare extracties voeren. Een recente studie benadrukt ook het belang van de pH van decellularisatie buffers aan ECM eiwitten 13 te behouden.
Beperkingen van de techniek
De hier gepresenteerde methode berust op het feit dat ECM eiwitten intrinsiek niet oplosbaar dan de meeste intracellulaire eiwitten. Echter, hier beschreven de decellularisatie methode zeker onttrekt oplosbare componenten aanwezig binnen de ECM zoals sommige groeifactoren of-ECM remodeling enzymen. Hoewel ECM-geassocieerde eiwitten nauw verbonden met ECM eiwitten werden gedetecteerd door proteomics in monsters bereid zoals beschreven kan deze werkwijze te streng zijn volledig het profiel van de samenstelling van matrisome geassocieerdeeiwitten.
Betekenis van de techniek met betrekking tot andere methoden
Het voordeel van de hier gepresenteerde boven andere methoden werkwijze is dat deze kan worden aangepast aan de aard van de ECM plaats: tussenstappen kunnen worden overgeslagen of herhaald om het verlies van ECM eiwitten voorkomen of verhogen uitputting van respectievelijk verontreinigende intracellulaire eiwitten. Deze werkwijze gebruikt ook slechts minimale hoeveelheden detergentia die worden afgespoeld hun interferentie met latere peptide preparaat en massaspectrometrie voorkomen. Ten slotte is de hier beschreven ECM-rijke eiwitten te verteren preparaten in peptiden methode heeft ook het voordeel dat er geen eiwitten oplosbaar en kunnen worden uitgevoerd op "eenvoudige" ECM-verrijkte fracties.
Alternatieve werkwijzen die gebruik maken van cellen ontdoen chaotrope middelen (bijvoorbeeld guanidine hydrochloride) de samenstelling van ECM door massaspectrometrie bestuderen bEen gerapporteerd in de literatuur (besproken in 14) en zijn gebruikt in combinatie met massaspectrometrie de ECM samenstelling van kraakbeen 15,16, hart 17, borstklier 18 en vasculaire 19 en 20 glomerulaire basale membranen karakteriseren.
Aanbevelingen
Decellularisatie werkwijzen die gebruik trypsine verteerbaar uit cellen mag niet worden gebruikt wanneer ECM's worden verrijkt voor daaropvolgende proteomics analyses, zoals trypsine resulteert in partiële digestie ECM en verlies van ECM eiwitten en peptiden. Evenzo, als collagenase digestie zou worden gebruikt weefselverstoring steun, zou zorgvuldig moeten worden gevolgd zoals veroorzaakt ECM vertering en verlies van ECM eiwitten en peptiden.
In water dan in-gel digestie? ECM eiwitten zijn verknoopt en hoogst onoplosbaar, zelfs wanneer geresuspendeerd in 3 x Laemmli buffer (die 6% SDS) en 100 mM DTT, aparte poOrly op SDS gels. Dus in-gel digestie geen voorkeur.
Toekomstige toepassingen
Opgemerkt zij dat, hoewel hier niet besproken, de samenstelling van elk van de halfproducten tijdens het van cellen ontdoen verzameld kan ook worden geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit kan met name waardevol zijn bij het bestuderen van zeer kleine monsters (bijvoorbeeld, menselijke biopsies) of achterhaalde informatie gewenst andere celfracties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
