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Biology

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ऊतकों और पाचन से बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के संवर्धन

Published: July 23, 2015 doi: 10.3791/53057
Automatic Translation
1, 2, 1
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Proteomics Platform, Broad Institute

Abstract

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ईसीएम कारणों से हृदय सहित विकास में और विविध विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है सेल प्रसार, अस्तित्व, प्रवास, आदि के प्रमुख नियामकों हैं कि biophysical और जैव रासायनिक संकेतों प्रदान करता है कि पार से जुड़े प्रोटीन की एक जटिल meshwork है और पेशीय-कंकाल रोगों, फाइब्रोसिस, और कैंसर। इस प्रकार, सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों के ECMs की संरचना निस्र्पक उपन्यास शकुन और नैदानिक ​​बायोमार्कर और संभावित उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए ले जा सकता है। हालांकि, ईसीएम प्रोटीन की बहुत प्रकृति (आकार में बड़े पार से जुड़े और covalently बाध्य, भारी ग्लाइकोसिलेटेड) चुनौतीपूर्ण ECMs के जैव रासायनिक विश्लेषण प्रदान की गई है। इस चुनौती पर काबू पाने के लिए, हम ईसीएम प्रोटीन की जटिलता का लाभ लेता है कि ताजा या फ्रोजन ऊतकों और ट्यूमर से ECMs को समृद्ध करने के लिए एक विधि विकसित की है। हम विस्तार से यहाँ अनुक्रमिक मैं के होते हैं कि decellularization प्रक्रिया का वर्णनअलग पीएच और नमक और डिटर्जेंट सांद्रता के buffers में ncubations और कहा कि 1 में परिणाम) इंट्रासेल्युलर (साइटोसोलिक, परमाणु, झिल्ली और cytoskeletal) प्रोटीन और ईसीएम प्रोटीन का 2) संवर्धन की निकासी। हम तो deglycosylate और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ईसीएम समृद्ध प्रोटीन की तैयारियों को पचाने के लिए क्या करते हैं।

Introduction

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) भाग में, कोशिकाओं और परिभाषित के लिए वास्तु समर्थन और लंगर प्रदान करता है कि पार से लिंक और ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन, ऊतकों 'बायोमैकेनिकल गुण 1,2 की एक जटिल meshwork है। ईसीएम प्रोटीन भी कोशिकाओं को या तो सीधे उनके रिसेप्टर्स (जैसे, integrins, syndecans, आदि) के माध्यम से या 3 संकेत वृद्धि कारक modulating के संकेत। ईसीएम इस प्रकार आदि के प्रसार, अस्तित्व, ध्रुवीकरण, भेदभाव, प्रवास, के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं के प्रमुख नियामकों हैं कि biophysical और जैव रासायनिक संकेतों प्रदान करता है

ईसीएम शरीर क्रिया विज्ञान, विकास और 4 उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, इस तरह के कारणों से हृदय रोग, फाइब्रोसिस, पेशीय-कंकाल रोग, कैंसर, के रूप में कई विकृतियों, के कारण होता है, या, ईसीएम परिवर्तन में परिणाम। इसके अलावा, ईसीएम स्टेम सेल आलों के रखरखाव के लिए योगदान देता है और वें कुंजी ईसीएम अणुओं की पहचानसमर्थन stemness पर ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 5 में सीधे आवेदन करना होगा। हालांकि, इसके महत्व के बावजूद, ईसीएम रह गया है, हाल ही में जब तक, 6 underexplored।

सिलिको विश्लेषण ईसीएम और ईसीएम जुड़े प्रोटीन के कलाकारों की टुकड़ी के रूप में परिभाषित matrisome, मानव और माउस दोनों जीनोम 1,7,8 में कई सौ जीनों के उत्पादों में शामिल हैं कि पता चला है। हालांकि, ईसीएम प्रोटीन की जटिलता सामान्य और रोग नमूनों के vivo कोशिकी matrices की रचना की व्यवस्थित लक्षण वर्णन रुकावट है। 10 - हम हाल ही में इस जटिलता लाभ के लिए दिया जा सकता है और ईसीएम प्रोटीन 8 को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा है कि प्रदर्शन किया। 10, 13 - हम और दूसरों को आगे मास स्पेक्ट्रोमेट्री ECMs 8 की रचना चिह्नित करने के लिए पसंद का एक तरीका था कि प्रदर्शन किया।

हमयहां विभिन्न पीएच और नमक और डिटर्जेंट सांद्रता के buffers में अनुक्रमिक incubations के होते हैं कि एक decellularization प्रक्रिया का वर्णन। निष्कर्षण (या कमी) साइटोसोलिक, परमाणु, झिल्ली और cytoskeletal प्रोटीन की और ईसीएम प्रोटीन के संवर्धन में इस प्रक्रिया का परिणाम है। हम तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ईसीएम समृद्ध प्रोटीन की तैयारियों को पचाने के लिए क्या करते हैं।

विस्तृत और यहाँ सचित्र प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक समृद्ध और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विशेषता दस विभिन्न ऊतकों और ट्यूमर प्रकार से कोशिकी मेट्रिसेस है: सामान्य murine फेफड़ों 8, मानव और murine पेट के 8,9, मानव यकृत 9, मानव कोलोरेक्टल ट्यूमर और व्युत्पन्न जिगर metastases 9, मेलेनोमा xenografts 8, (अप्रकाशित नब एट अल।,) स्तन ट्यूमर xenografts 10, murine अग्नाशय टापू और murine insulinomas। अलग matrisom की तुलनातों आगे संभावित निदान या शकुन बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि ऊतक और ट्यूमर विशेष ईसीएम हस्ताक्षरों का पता चला।

हम इस प्रक्रिया नहीं है या अपेक्षाकृत मामूली संशोधनों के साथ अन्य नमूनों को लागू किया जा सकता है।

Protocol

नोट: प्रक्रिया ताजा या फ़्लैश जमे हुए ऊतकों पर आयोजित किया जा सकता है। हम रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा प्रोटीन लाल को खत्म करने विच्छेदन के समय में पीबीएस के साथ अत्यधिक vascularized ऊतकों perfusing सलाह देते हैं। हम निर्धारण के रूप में तय ऊतकों पर प्रक्रिया के संचालन की सिफारिश नहीं है (यानी, रासायनिक crosslinking) decellularization के साथ हस्तक्षेप और भी काफी बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण समझौता कर सकते हैं। पूरी प्रक्रिया के लिए, हम प्रोटीन और पेप्टाइड वसूली को अधिकतम करने के लिए कम-प्रतिधारण ट्यूब और पिपेट सुझावों का उपयोग करें।

ऊतकों या ट्यूमर की 1. Decellularization

नोट: शुरू करने से पहले, अभिकर्मकों तैयार करने और प्रत्येक बफर के वांछित मात्रा करने के लिए (कम्पार्टमेंट प्रोटीन निष्कर्षण किट के साथ प्रदान की) प्रोटीज इनहिबिटर्स जोड़ें। सभी buffers और नमूने एसडीएस precip को रोकने के लिए आरटी पर रखा जाना चाहिए कि बफर सीएस को छोड़कर प्रयोग की अवधि के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिएitation।
नोट: प्रोटोकॉल अलग पीएच और निकालने intracellular प्रोटीन sequentially और अघुलनशील ईसीएम प्रोटीन (चित्रा 1, 1 टेबल के लिए समृद्ध करने के लिए नमक और डिटर्जेंट के विभिन्न राशि युक्त बफ़र्स में ऊष्मायन की एक श्रृंखला का उपयोग करता है, का उपयोग करने के लिए विकल्प के लिए भी चर्चा देखें वाणिज्यिक किट) यहाँ विस्तृत। नीचे दिए गए अभिकर्मकों की मात्रा ऊतकों या ट्यूमर (देखें तालिका 1) के 100 मिलीग्राम के लिए कर रहे हैं और उचित रूप से समायोजित करने की जरूरत है।

  1. ऊतक पूरी तरह से बाधित है और एक समरूप निलंबन प्राप्त किया जाता है जब तक एक ऊतक homogenizer का उपयोग कर प्रोटीज इनहिबिटर्स युक्त बफर सी के 500 μl में ऊतक के 100 मिलीग्राम homogenize।
    नोट: जोड़ें deoxyribonuclease मैं (अंतिम एकाग्रता: 200 माइक्रोग्राम / एमएल, निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन): के लिए और एक (20 माइक्रोग्राम / एमएल, निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठन अंतिम एकाग्रता) ribonucleaseबफर एन
  2. इंट्रासेल्युलर घुलनशील प्रोटीन की अनुक्रमिक निकासी
    1. साइटोसोलिक प्रोटीन के निष्कर्षण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर homogenate सेते हैं। बाद में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (अपेक्षित परिणाम अनुभाग और देखें चित्र 2) के लिए homogenate के एक छोटे से विभाज्य (20 μl के लिए 10 μl) को बचाओ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर homogenate अपकेंद्रित्र। एक साफ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए, इस पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के साइटोसोलिक (सी) अंश का गठन होगा। फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर इस अंश और दुकान फ्रीज।
    3. धोने के लिए प्रोटीज इनहिबिटर्स युक्त डब्ल्यू बफर के 400 μl में गोली resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर नमूना सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर homogenate अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. निकालने के लिए, परमाणु प्रोटीन, बफर एन के 150 μl प्रोटीज अवरोधकों को नियंत्रित करने में गोली resuspend, deoxyribonucleaएसई मैं और ribonuclease ए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर नमूना सेते हैं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र और एक स्वच्छ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। एक बार इस चरण को दोहराएँ: दूसरी बार के लिए नमूना centrifuging के बाद, पिछले सतह पर तैरनेवाला करने के लिए सतह पर तैरनेवाला जोड़ें: इस पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के परमाणु (एन) के अंश का गठन होगा। फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर इस अंश और दुकान फ्रीज। फिर, कदम 1.2.3 के अनुसार धोने प्रदर्शन करते हैं।
    6. झिल्ली प्रोटीन निकालने के लिए, बफर एम के 100 μl प्रोटीज अवरोधकों को नियंत्रित करने में गोली resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर नमूना सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र
    7. एक साफ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए: इस पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की झिल्ली (एम) के अंश का गठन होगा। फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर इस अंश और दुकान फ्रीज।
    8. 2 में गोली resuspend, cytoskeletal प्रोटीन निकालने के लिएप्रोटीज इनहिबिटर्स युक्त और आरटी पर 30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर नमूना सेते बफर सीएस के 00 μl।
      गोली पूरी तरह से भंग नहीं करेंगे कि ध्यान दें। हम गोली के विघटन को देख जब तक ऊपर और नीचे pipetting द्वारा गोली में खलल न डालें का सुझाव देते हैं।
    9. आरटी पर 30 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। एक साफ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए। इस बिंदु पर गोली (वीडियो देखें) के आकार में एक और उल्लेखनीय कमी पर ध्यान दें।
    10. बफर सी युक्त प्रोटीज अवरोधकों के 150 μl में गोली Resuspend और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर नमूना सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र।
    11. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और पिछले सतह पर तैरनेवाला में जोड़ें: इस पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के cytoskeletal (सीएस) अंश का गठन होगा। फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर इस अंश और दुकान फ्रीज।
    12. अतिरिक्त washes के प्रदर्शन करना। पीबीएस के 500 μl प्रोटीज इनहिबिटर्स एक को नियंत्रित करने में गोली Resuspendएन डी 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर नमूना सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इस चरण में तीन बार दोहराएँ।
      नोट: डिटर्जेंट के सभी निशान पेप्टाइड्स (धारा 3 देखें) में पूर्व प्रोटीन के पाचन के लिए व्यापक washes के द्वारा हटा दिया जाना चाहिए। इस बिंदु पर, ईसीएम समृद्ध गोली फ़्लैश जमी हो सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा। गोली के आकार सामग्री शुरू में अघुलनशील (ईसीएम) प्रोटीन की मात्रा और decellularization की क्षमता पर निर्भर करेगा कि ध्यान दें।

2. एसडीएस पृष्ठ और वेस्टर्न ब्लाट द्वारा Decellularization / ईसीएम संवर्धन की गुणवत्ता की निगरानी

  1. कुल ऊतक निकालने के 10-20 μl विभाज्य और Laemmli बफर 100 मिमी डीटीटी को रोकने के साथ मध्यवर्ती भागों का 50 μl aliquots मिलाएं। 100 मिमी डीटीटी युक्त 3x Laemmli बफर में ईसीएम समृद्ध, अघुलनशील अंश Resuspend।
    नोट: वह सांद्रता बुलंदडीटीटी और एसडीएस के अपेक्षाकृत अघुलनशील हैं कि ईसीएम प्रोटीन के solubilization में सहायता करते हैं।
  2. एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन को अलग करें और nitrocellulose झिल्ली पर स्थानांतरित कर दिया।
  3. साइटोसोलिक, परमाणु, झिल्ली, cytoskeletal और ईसीएम भिन्न के प्रत्येक के प्रोटीन प्रतिनिधि नजर रखने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग प्रतिरक्षा-दाग प्रदर्शन करना (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग, 2 टेबल और चित्र 2 देखें)।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पेप्टाइड्स के लिए प्रोटीन की 3. इन-समाधान पाचन

नोट: एसडीएस की decellularization प्रक्रिया और हटाने के बाद प्राप्त गोली ये प्रोटीन पेप्टाइड में पच होने की जरूरत मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा और विश्लेषण के लिए अघुलनशील ईसीएम प्रोटीन में अत्यधिक समृद्ध है। इस कदम के नमूने के प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए कम से ईसीएम प्रोटीन जटिलता का एक परिणाम है, यह संभव नहीं है, के रूप में ध्यान दें। हम इस प्रकार ईसीएम-enri को पचाने के लिए अभिकर्मकों की मात्रा प्रदानईसीएम समृद्ध गोली (3 टेबल) के आकार (मिमी) या सूखी वजन के आधार पर पेप्टाइड में Ched, नमूने हैं। अमोनियम बाइकार्बोनेट, यूरिया, डीटीटी, iodoacetamide और trifluoroacetic एसिड का समाधान सभी हौसले से तैयार रहने की जरूरत है।

  1. ईसीएम समृद्ध गोली से 8 एम यूरिया की उचित मात्रा जोड़कर ईसीएम समृद्ध नमूना Resuspend और 10mm की एक अंतिम एकाग्रता में डीटीटी जोड़ने (3 टेबल देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1400 rpm पर निरंतर आंदोलन के साथ सेते हैं।
    नोट: इस बिंदु पर ईसीएम प्रोटीन पूरी तरह से भंग नहीं किया जाएगा और जाहिरा तौर पर बड़े प्रोटीन कणों centrifugation या निस्पंदन द्वारा खारिज नहीं किया जाना चाहिए। निलंबन deglycosylation और पाचन (वीडियो देखें) पर साफ हो जाएगा।
  2. Alkylation
    1. एचपीएलसी ग्रेड पानी में iodoacetamide समाधान तैयार है। आरटी के लिए नमूना कूल और 25 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए iodoacetamide जोड़ें। पूरा alkylation के लिए, डीटीटी: iodoacetamide अनुपात 1 के बीच होना चाहिए: 2।5 और 1: 3।
    2. आरटी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं।
  3. Deglycosylation:
    नोट: deglycosylation कार्बोहाइड्रेट पक्ष एन द्वारा संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान के साथ हस्तक्षेप है कि चेन ग्लाइकोसिलेशन -linked को दूर करने की जरूरत है।
    1. 100 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट पीएच 8.0 के साथ 2 एम यूरिया के लिए पतला और PNGaseF की उचित मात्रा में जोड़ने (3 टेबल देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1400 rpm पर निरंतर आंदोलन के साथ सेते हैं।
  4. पाचन
    1. लिस-सी जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1400 rpm पर निरंतर आंदोलन के साथ सेते हैं। ट्रिप्सिन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1400 आरपीएम हे / एन पर निरंतर आंदोलन के साथ सेते हैं।
      नोट: 8M यूरिया में प्रारंभिक पुनर्गठन पर बादल छाए रहेंगे शुरू किया कि ईसीएम युक्त निलंबन हे / एन पाचन (वीडियो देखें) के बाद स्पष्ट दिखाई देता है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 2 घंटे के लिए 1400 rpm पर निरंतर आंदोलन के साथ नमूना करने के लिए trypsin के एक दूसरे विभाज्य जोड़ें और सेते हैं। </ ली>
  5. अम्लीकरण
    1. पाचन के पूरा होने पर, हौसले से तैयार 50% trifluoro-एसिटिक एसिड (TFA) के साथ नमूना acidifying द्वारा ट्रिप्सिन निष्क्रिय। नमूना हम एक समय में 50% TFA के 1-1.5 μl जोड़ने और (वीडियो देखें) पीएच कागज का उपयोग कर समाधान के पीएच को मापने के लिए पेप्टाइड समाधान के 1 μl उपयोग करने का सुझाव पीएच <2. तक पहुँचना चाहिए।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर अम्लीकृत नमूना अपकेंद्रित्र। एक साफ कम प्रतिधारण ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए। इस बिंदु पर, पेप्टाइड समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  6. Desalting
    नोट: यह अंतिम कदम आमतौर पर अपने पसंदीदा तरीकों के हिसाब से एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा में आयोजित किया जाता है कि।
    1. पहले प्रोटिओमिक्स विश्लेषण करने के लिए, एक वैक्यूम concentrator में एकाग्रता द्वारा पीछा हौसले से तैयार 60% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic एसिड, साथ eluted नमूने और पेप्टाइड्स फीका बनाना। हौसले से तैयार 3% acetonitr में पेप्टाइड्स Resuspendइले, 0.1% trifluoroacetic एसिड 8।
      नोट: desalting के बाद, पेप्टाइड समाधान की एकाग्रता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री से मापा जा सकता है कि (अपेक्षित परिणाम अनुभाग देखें)।
    2. अब फिर से मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा का इष्टतम प्रक्रियाओं के अनुसार, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नमूना विश्लेषण।
      नोट: हम अपने अन्य प्रकाशनों 8 का उल्लेख करने के मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग ECMs की संरचना निस्र्पक में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करते हैं - नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस पैरामीटर, प्रोटीन की पहचान और डेटा विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा खोज सहित आगे विस्तृत विवरण, प्रदान करते हैं कि 10 और वेबसाइट हम 8 विकसित में सिलिको matrisome एनोटेशन उपकरण का उपयोग कर।

Representative Results

Decellularization प्रक्रिया की गुणवत्ता नियंत्रण

decellularization की दक्षता पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रत्येक अंश में प्रोटीन की मात्रा का विश्लेषण द्वारा नजर रखी जा सकती है। नैदानिक ​​मूल्य के 2 सूचियों प्रोटीन तालिका decellularization प्रक्रिया की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए। 2A चित्रा साइटोसोलिक के मध्यवर्ती भागों में कुशल निष्कर्षण (GAPDH से पता चलता है ), परमाणु (हिस्टोन), झिल्ली (β1 Integrin) और cytoskeletal (एक्टिन) प्रोटीन, कोई ईसीएम प्रोटीन (कोलेजन आई) इन भागों में पता चला है, जबकि (चित्रा 2)। बदले में, अंतिम गोली ईसीएम प्रोटीन के लिए समृद्ध है और काफी हद तक intracellular प्रोटीन (2A चित्रा)। एक्टिन में अभी भी पता लगाया जा सकता है, हालांकि चित्रा 2B, संतोषजनक इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की कमी (कोई हिस्टोन ईसीएम अमीर अंश में पाया जाता है) को प्रस्तुत करता है के समाप्त ईसीएम अमीर अंश और मोनोमेरिक कोलेजन मैं की कमी- स्पष्ट आणविक भार ~ 110 केडीए, संभावित या अनुमानित मैं unassembled कोलेजन के लिए इसी - सीएस अंश में मनाया जा सकता है।

कुछ ऊतकों में इन घटकों को आंशिक रूप से पहले भिन्नों 8-10 में solubilized किया जा सकता है, हालांकि हम यह भी नियमित रूप से इस तरह के फ़ाइब्रोनेक्टिन और laminin के रूप में अतिरिक्त ईसीएम प्रोटीन की निगरानी। उदाहरण के लिए, फ़ाइब्रोनेक्टिन भी ईसीएम में शामिल नहीं किया गया है कि के रूप में घुलनशील प्लाज्मा फ़ाइब्रोनेक्टिन होता है। निकासी के लिए पहले ऊतक के छिड़काव प्लाज्मा फ़ाइब्रोनेक्टिन एकाग्रता कम कर देता है, लेकिन हमेशा यह खत्म नहीं करता है। कुछ ऊतकों में, laminins पाया शिथिल कोशिका की सतह या मध्यवर्ती भागों में ईसीएम और निकालने के साथ जुड़े रहे हैं। यदि ऐसा होता है यह निकासी की स्थिति (चर्चा देखें) फेरबदल ने संबोधित किया जा सकता है।

ईसीएम प्रोटीन और intracellular घटकों के सहवर्ती कमी के संवर्धन के विभिन्न बफ़र्स में प्रोटीन के रिश्तेदार घुलनशीलता पर आधारित है कि ध्यान दें। गुविभिन्न ऊतकों के बीच अलग है - कुछ मामलों में हिस्टोन और actin और अधिक आसानी से दूसरों की तुलना में निकाले जाते हैं। इसके अलावा हिस्टोन एन अंश (चित्रा 2B) में निकाले जाने की संभावना है, हालांकि, हम अक्सर एम या सीएस अंश (2A चित्रा और बी) में हिस्टोन की एक और पूरी कमी महसूस करते हैं, उस पर ध्यान दें।

सांकेतिक पेप्टाइड एकाग्रता की उम्मीद

पाचन, अम्लीकरण और desalting बाद प्राप्त पेप्टाइड समाधान की एकाग्रता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा या तो नियासिन, टाइरोसीन करने के लिए इसी 280 एनएम तरंगदैर्ध्य का उपयोग कर पेप्टाइड समाधान के absorbance मापने, या पेप्टाइड के absorbance के लिए इसी 205 एनएम तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके मापा जा सकता है बांड।

हम (क्रमश: 82 मिलीग्राम, 100 मिलीग्राम और 100 मिलीग्राम) तीन murine फेफड़ों के नमूनों की decellularization से प्राप्त पेप्टाइड समाधान की एकाग्रता मापा prepa424 एनजी / μl, 450 एनजी / μl, और क्रमशः पेप्टाइड्स के 580 एनजी / μl: लाल समानांतर में और प्रत्येक से प्राप्त की।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ईसीएम पेप्टाइड्स की पहचान

यहाँ वर्णित के रूप में तैयार ईसीएम समृद्ध प्रोटीन के नमूने की रचना की बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण, संकेत तीव्रता के> 70% ईसीएम और ईसीएम जुड़े प्रोटीन 8-10 से मेल खाती है कि पता चला है।

ऊतक या ट्यूमर की 100 मिलीग्राम (गीला वजन) decellularize करने के लिए पूरक निकासी किट से अभिकर्मकों की तालिका 1 वॉल्यूम। इस तालिका संरचना और ऊतक या ट्यूमर की 100 मिलीग्राम की decellularization संचालन करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रत्येक बफर की मात्रा को सूचीबद्ध करता है। प्रोटीज अवरोधकों का कॉकटेल एक 50x समाधान के रूप में प्रदान की जाती है और प्रत्येक बफर 2 के लिए जोड़ा जा करने की जरूरत है।

कम्पार्टमेंट प्रोटीन निष्कर्षण किट से अभिकर्मकों ऊतक के 100 मिलीग्राम के लिए वॉल्यूम संगठन (Millipore पत्रक बिल्ली # के आधार पर 2145 1)
बफर सी 500 μl HEPES (पीएच 7.9 3), 2 MgCl, KCl, EDT 4, सुक्रोज, ग्लिसरॉल, सोडियम Orthovanadate 5
बफर डब्ल्यू 400 μl HEPES (पीएच 7.9), 2 MgCl, KCl, EDTA, सुक्रोज, ग्लिसरॉल, सोडियम Orthovanadate
बफर एन 150 μl एक्स 2 HEPES (पीएच 7.9), 2 MgCl, सोडियम क्लोराइड, EDTA, ग्लिसरॉल, सोडियम Orthovanadate
बफर डब्ल्यू 400 μl HEPES (पीएच 7.9), 2 MgCl, KCl, EDTA, सुक्रोज, ग्लिसरॉल, सोडियम Orthovanadate
बफर एम 100 μl HEPES (पीएच 7.9), 2 MgCl, KCl, EDTA, सुक्रोज, ग्लिसरॉल, सोडियम deoxycholate (डॉक्टर) 6, एनपी 40 6
बफर सीएस 200 μl पाइप (पीएच 6.8), 2 MgCl, सोडियम क्लोराइड, EDTA, सुक्रोज, सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) 7, सोडियम Orthovanadate
बफर सी 150 μl HEPES (पीएच 7.9), 2 MgCl, KCl, EDTA, सुक्रोज, ग्लिसरॉल, सोडियम Orthovanadate
1x पीबीएस 500 μl / धोने -

नोट्स:
1 मालिकाना कारणों से, हम किट के आपूर्तिकर्ता से buffers की सटीक संरचना प्राप्त करने में असमर्थ थे, लेकिन हम यहाँ भी इसी एक्सट्रेक्शन संचालन करने के लिए घर का बना buffers का उपयोग अपने स्वयं के अनुभव के आधार पर कुछ नोट शामिल हैं।
2 protease अवरोध करनेवाला: यह आदि सिस्टीन, सेरीन और threonine peptidases, सेरीन esterases, द्विसंयोजक कटियन निर्भर metalloproteinases के खिलाफ अवरोधकों की एक किस्म को शामिल करने की सलाह दी जाती हैकई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल मौजूद हैं।
7.0 से ऊपर 3 पीएच लाइसोसोमल प्रोटिएजों का एक प्रभावी अवरोध करनेवाला है।
(आमतौर पर 2 मिमी में प्रयुक्त) 4 EDTA के द्विसंयोजक कटियन निर्भर प्रोटिएजों का एक प्रभावी अवरोध करनेवाला है।
5 सोडियम orthovanadate एक फॉस्फेट अवरोध करनेवाला है। एक ठेठ प्रभावी एकाग्रता 0.5-5 मिमी होगा।
0.1% -0.5% से कम 6 NP40 सबसे झिल्ली लिपिड solubilize करने के लिए पर्याप्त है। NP40 और डॉक्टर के संयोजन - अक्सर अभी भी बरकरार कई प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत छोड़ देता है कि एक और अधिक कठोर निकासी के रूप में प्रयोग किया जाता है - अक्सर (जैसे, प्रत्येक के 0.5%) बराबर मात्रा में प्रयोग किया जाता है।
7 एसडीएस एक और अधिक कठोर आयनिक डिटर्जेंट (सीएमसी 0.1%) है। यह भी अन्य दो डिटर्जेंट एसडीएस / NP40 / डॉक्टर एक मध्यवर्ती तंगी बफर के रूप में 0.1 / 0.5 / 0.5% के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है।

तालिका 2 डायग्नोस्टिक प्रोटीन के लिएdecellularization प्रक्रिया की गुणवत्ता की निगरानी। इस तालिका decellularization प्रक्रिया की गुणवत्ता और दक्षता पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रत्येक subcellular कम्पार्टमेंट (साइटोसॉल, नाभिक, प्लाज्मा झिल्ली, cytoskeleton है और ईसीएम) के लक्षण हैं कि प्रोटीन के उदाहरण को सूची बद्ध ईसीएम-संवर्धन।

Intracellular कम्पार्टमेंट डायग्नोस्टिक प्रोटीन
साइटोसोलिक प्रोटीन Glyceraldehyde 3-फास्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH)
परमाणु प्रोटीन हिस्टोन, Lamins, Nucleoporin
झिल्ली प्रोटीन Integrins, transferrin रिसेप्टर
Cytoskeletal प्रोटीन Actin, ट्यूबिलिन, vimentin
तहखाने झिल्ली ईसीएम प्रोटीन कोलेजन चतुर्थ, Nidogens, Laminins
मध्यवर्ती ईसीएम प्रोटीन (मध्य) कोलेजन मैं, मज्जा तृतीय, कोलेजन छठी, फ़ाइब्रोनेक्टिन

एंटीबॉडी पर सिफारिश के लिए, हमारे प्रकाशनों 8-10 देखते हैं।

पेप्टाइड में ईसीएम समृद्ध नमूने को पचाने के लिए अभिकर्मकों की तालिका 3. वॉल्यूम। इस तालिका ईसीएम समृद्ध प्रोटीन के नमूने resuspend और कम करने, alkylate, deglycosylate और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने से पहले पेप्टाइड में प्रोटीन के नमूने को पचाने के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों सूचीबद्ध करता है।

अभिकर्मकों तैयारी 1 मिमी मोटी गोली के लिए अंतिम एकाग्रता / राशि (~ 5-10 मिलीग्राम सूखी वजन) 1 मिमी मोटी गोली के लिए वॉल्यूम (~ 5-10 मिलीग्राम सूखी वजन)
अमोनियम बाइकार्बोनेट (एनएच 4 HCO 3) एचपीएलसी ग्रेड पानी में 100 मिमी समाधान - -
यूरिया 100 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट में 8 एम समाधान 8 मीटर 50 μl
Dithiothreitol 500 मिमी एचपीएलसी ग्रेड पानी में पुनर्गठित 10 मिमी 1 μl
Iodoacetamide 500 मिमी एचपीएलसी ग्रेड पानी में पुनर्गठित 25 मिमी 2.5 μl
Peptide- एन -Glycosidase एफ (PNGaseF) 500 यू / μl में वाणिज्यिक समाधान 1,000 यू 2 μl
Endoproteinase LysC, मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड 0.5 माइक्रोग्राम / μl में एचपीएलसी ग्रेड पानी में पुनर्गठित 1 माइक्रोग्राम 2 μl
Trypsin, मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड (गोल 1) 0.5 माइक्रोग्राम / μl में वाणिज्यिक समाधान 3 माइक्रोग्राम 6 μl
Trypsin, मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड (गोल 2) 0.5 माइक्रोग्राम / μl में वाणिज्यिक समाधान 1.5 माइक्रोग्राम 3 μl
Trifluoro-एसिटिक एसिड (TFA) एचपीएलसी ग्रेड पानी में 50% समाधान - 2-5 μl
Acetonitrile (क्षालन) एचपीएलसी ग्रेड पानी में 0.1% TFA के साथ 60% समाधान - 500 μl
Acetonitrile (पुनर्गठन) एचपीएलसी ग्रेड पानी में 0.1% TFA के साथ 3% समाधान - 100 μl

चित्र 1
प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्रा 1. योजना। Protoco के योजनाबद्ध कार्यप्रवाहएल, ऊतकों (खंड 1) decellularize decellularization की गुणवत्ता नियंत्रण और ईसीएम संवर्धन (धारा 2) का मूल्यांकन करने और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (धारा 3) के लिए पहले पेप्टाइड में ईसीएम समृद्ध प्रोटीन के नमूने को पचाने के लिए।

चित्र 2
पश्चिमी धब्बा द्वारा decellularization प्रक्रिया चित्रा 2. गुणवत्ता नियंत्रण पश्चिमी blots murine फेफड़ों (ए) और मानव स्तन कार्सिनोमा xenograft (बी) निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग नमूनों पर प्रदर्शन किया गया। खरगोश विरोधी एक्टिन (क्लोन 14-1) और खरगोश विरोधी -β1 हमारी प्रयोगशाला में उत्पादित एंटीबॉडी Integrin; खरगोश विरोधी कोलेजन मैं, माउस विरोधी GAPDH और खरगोश विरोधी अखिल हिस्टोन एंटीबॉडी Millipore से थे। प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, झिल्ली धोया गया और एचआरपी संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश या बकरी विरोधी समझौता ज्ञापन की उपस्थिति में incubatedजैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशाला से एसई माध्यमिक एंटीबॉडी। अंत में, झिल्ली धोया और पश्चिमी लाइटनिंग ™ Chemiluminescence अभिकर्मक (PerkinElmer लास) में incubated रहे थे। * ईसीएम अमीर अंश का न्यूनतम अवशिष्ट हिस्टोन संदूषण इंगित करता है। ** सीएस अंश में मोनोमेरिक (संभावित या अनुमानित unassembled) कोलेजन मैं का आंशिक कमी को इंगित करता है। *** ईसीएम अमीर अंश का अवशिष्ट एक्टिन संदूषण इंगित करता है। विरोधी कोलेजन एंटीबॉडी के साथ पाया धब्बा बाद translational संशोधनों (जैसे, पार से जोड़ने, ग्लाइकोसिलेशन) के विभिन्न स्तरों का प्रतिनिधित्व करता है।

Discussion

संशोधन

हम 8 दस ऊतकों और ट्यूमर प्रकार से ईसीएम को समृद्ध करने के लिए इस सटीक प्रक्रिया कार्यरत हालांकि - 10, प्रोटोकॉल के संशोधनों को निम्नलिखित मामलों में विचार किया जाना चाहिए:

मध्यवर्ती भागों में ईसीएम प्रोटीन का 1) जांच।

फ़ाइब्रोनेक्टिन और laminins के लिए ऊपर चर्चा के रूप में विभिन्न ऊतकों या ट्यूमर प्रकार से कोशिकी मेट्रिसेस, उनके extractability / जटिलता में भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, यह तंतुमय ऊतकों या remodeling के ऊतकों के ईसीएम बहुत गतिशील रूप से खत्म हो जाता है कि ऐसा माना जाता है और इस तरह एक और अधिक आसानी से 12 निष्कर्षण होने के लिए उन ऊतकों में ईसीएम प्रोटीन की एक उच्च अनुपात का निरीक्षण कर सकते हैं। ईसीएम प्रोटीन पाया जाता है, जिसमें अंश के आधार पर हम ईसीएम प्रोटीन की निकासी के कारण या उस कदम को छोड़ते हुए कदम की ऊष्मायन समय को कम करने का सुझाव देते हैं।

2) डीईसीएम समृद्ध गोली में intracellular घटकों का एक महत्वपूर्ण अनुपात की etection। कुछ ऊतकों या ट्यूमर प्रकार के अनुपात कोशिकाओं में: ईसीएम विशेष रूप से उच्च (जैसे, जिगर, तिल्ली, गैर desmoplastic ट्यूमर) है। उस मामले में, (विशेष रूप से cytoskeletal प्रोटीन और / या हिस्टोन में) intracellular प्रोटीन से ईसीएम समृद्ध अंश की एक महत्वपूर्ण संदूषण मनाया जा सकता है। कुशलतापूर्वक, हम बफर एम और / या बफर सीएस (दोनों युक्त डिटर्जेंट, यह आमतौर पर प्रचुर मात्रा में intracellular प्रोटीन depletes) में दो बार ऊष्मायन दोहरा करने का सुझाव intracellular प्रोटीन व्यय करना। एक अन्य विकल्प (अगले पैराग्राफ को देखें) के रूप में यह अच्छी तरह से अपेक्षाकृत अधिक घुलनशील ईसीएम प्रोटीन की कमी को जन्म दे सकती है कि चेतावनी के साथ, उच्च डिटर्जेंट सांद्रता के साथ वैकल्पिक बफ़र्स का उपयोग करने के लिए किया जाएगा।

एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करने के लिए 3) वैकल्पिक।

हम fro buffers की सटीक संरचना प्राप्त करने के लिए, मालिकाना कारणों के लिए, असमर्थ थेपूरक प्रोटीन निष्कर्षण किट के आपूर्तिकर्ता हूँ। हालांकि, हम तालिका में इसी प्रकार के एक्सट्रेक्शन संचालन करने के लिए परिभाषित साबुन के साथ घर का बना बफ़र्स (एनपी-40, सोडियम deoxycholate और एसडीएस) सांद्रता का उपयोग कर अपने स्वयं के अनुभव के आधार पर 1 नोटों को शामिल किया है। हाल के एक अध्ययन में यह भी ईसीएम प्रोटीन 13 बनाए रखने के लिए decellularization बफ़र्स के पीएच के महत्व पर प्रकाश डाला।

तकनीक की सीमाएं

यहाँ प्रस्तुत विधि ईसीएम प्रोटीन आंतरिक रूप से अधिक अघुलनशील सबसे intracellular प्रोटीन की तुलना में कर रहे हैं कि इस तथ्य पर निर्भर करता है। हालांकि, decellularization विधि यहाँ वर्णित निश्चित रूप से इस तरह के कुछ वृद्धि कारकों या ईसीएम-remodeling एंजाइमों के रूप में ईसीएम के भीतर मौजूद घुलनशील घटक निकालता है। के रूप में वर्णित कसकर ईसीएम प्रोटीन के लिए बाध्य ईसीएम जुड़े प्रोटीन तैयार नमूनों में प्रोटिओमिक्स द्वारा पता लगाया गया है, इस पद्धति पूरी तरह से रचना प्रोफ़ाइल करने के लिए भी कठोर हो सकता है matrisome जुड़ेप्रोटीन।

अन्य तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व

मध्यवर्ती कदम छोड़ा जा सकता है या ईसीएम प्रोटीन की हानि को रोकने या क्रमशः intracellular प्रोटीन contaminating की कमी को बढ़ाने के लिए दोहराया: अन्य तरीकों पर यहाँ प्रस्तुत विधि का लाभ यह है कि ब्याज की ईसीएम की प्रकृति के आधार पर किया जा सकता है। इस विधि को भी बाद ही संभव पेप्टाइड तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ उनके हस्तक्षेप को रोकने के लिए बंद rinsed हैं कि डिटर्जेंट की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करता है। अंत में, पेप्टाइड में ईसीएम युक्त प्रोटीन की तैयारियों को पचाने के लिए यहाँ वर्णित विधि भी प्रोटीन घुलनशील होने के लिए और "कच्चे" ईसीएम समृद्ध भागों पर आयोजित किया जा सकता की जरूरत नहीं है का लाभ दिया है।

(जैसे guanidine हाइड्रोक्लोराइड के रूप में) chaotropes उपयोग वैकल्पिक decellularization विधियों मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ECMs की संरचना का अध्ययन करने के लिए ख हैeen (14 में समीक्षा) साहित्य में सूचना दी और उपास्थि 15,16, दिल 17, स्तन ग्रंथि 18 और नाड़ी 19 और केशिकागुच्छीय 20 तहखाने झिल्ली के ईसीएम रचना चिह्नित करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है।

अनुशंसाएँ

ECMs का विश्लेषण करती है बाद में प्रोटिओमिक्स के लिए समृद्ध कर रहे हैं अगर trypsinization आंशिक ईसीएम पाचन और ईसीएम प्रोटीन और पेप्टाइड्स के नुकसान में परिणाम देगा के रूप में कोशिकाओं बाहर पचाने में ट्रिप्सिन रोजगार Decellularization तरीकों, नहीं किया जाना चाहिए। Collagenase पाचन ऊतक व्यवधान सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहे थे कि यह ईसीएम पाचन और ईसीएम प्रोटीन और पेप्टाइड्स की हानि का कारण बनता है के रूप में इसी तरह, यह सावधानी से नजर रखी जा करने की आवश्यकता होगी।

इन-समाधान बनाम में जेल पाचन? ईसीएम प्रोटीन 3x Laemmli बफर में resuspended जब भी और 100mm डीटीटी, अलग पीओ (6% एसडीएस युक्त),-पार जुड़ा हुआ है और अत्यधिक अघुलनशील हैं औरएसडीएस जैल पर Orly। इस प्रकार में जेल पाचन एक पसंदीदा तरीका नहीं है।

भविष्य अनुप्रयोगों

यह यहाँ पर चर्चा नहीं है, जबकि decellularization के दौरान एकत्र मध्यवर्ती भागों का प्रत्येक की रचना भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, कि ध्यान देने योग्य है। बहुत छोटे नमूने (यानी, मानव बायोप्सी) या अध्ययन करते हैं तो यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है जानकारी के अन्य सेलुलर भागों पर यात्रा की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads Next Advance BB24-AU
Compartmental Extraction kit Millipore 2145
Deoxyribonuclease I Sigma-Aldrich DN25
Ribonuclease A Qiagen 19101
HPLC-grade water Sigma-Aldrich 34877
Urea Sigma-Aldrich U4883
Dithiotreitol (DTT) Thermo Scientific 20291
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 9830
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) New England Biolabs P0704S
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade  Wako 125-05061
Trypsin, mass spectrometry-grade  Promega V5111
Trifluoro-acetic Acid Sigma-Aldrich T6508
Acetonitrile, mass spectrometry-grade  Thermo Scientific 51101
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge Waters 186000383

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References

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Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (101), e53057, doi:10.3791/53057 (2015).

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