Abstract
세포 외 기질 (ECM)는 ECM이 심장 혈관을 포함하여 개발 및 다양한 병리에서 중요한 역할을한다 세포 증식, 생존, 마이그레이션 등의 주요 규제이다 생물 물리학 및 생화학 적 신호를 제공 가교 단백질의 복잡한 메쉬 작업입니다 및 근골격계 질환, 섬유증, 암. 따라서, 정상과 병에 걸린 조직의 ECM의의 구성을 특징 짓는 것은 새로운 예후 및 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 새로운 치료 대상의 식별로 이어질 수있다. 그러나, ECM 단백질의 본질 (크기가 큰 가교과 공유 결합, 크게 당화)가 도전하는 ECM의 생화학 적 분석을 렌더링하고있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 ECM 단백질의 용해성을 활용 신선하거나 동결 된 조직 및 종양으로부터 ECM의 농축 방법을 개발 하였다. 우리는 여기에서 상세 순차 I로 구성 탈세 포화 절차를 설명다른 pH와 소금과 세제 농도의 버퍼에 ncubations하고 1 결과) 세포 (세포질, 핵, 막과 세포 골격) 단백질과 ECM 단백질의 2) 농축 추출. 우리는 다음 deglycosylate 및 질량 분석에 의한 이후의 분석을위한 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 준비를 소화하는 방법을 설명합니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM)는 부분적으로 세포와 정의에 대한 건축 지원 및 고정을 제공 가교 및 당화 단백질, 조직 '생 역학적 특성 1, 2의 복잡한 메쉬 작업입니다. ECM 단백질은 또한 세포에 직접적으로 그들의 수용체 (예를 들어, 인테그린, syndecans 등)을 통해 또는 3 시그널링 성장 인자를 변조함으로써 신호. ECM 따라서 등 증식, 생존, 편광, 분화, 이동, 같은 세포 과정의 주요 규제이다 생물 물리학 및 생화학 적 신호를 제공합니다
ECM은 생리학, 개발 및 4 노화에 중요한 역할을한다. 또한, 같은 심장 혈관 질환, 섬유증, 근골격계 질환, 암 등 여러 가지 병리,에 의해 발생하거나, ECM의 변경을 초래. 또한, ECM은 줄기 세포 틈새의 유지에 기여 번째 키 ECM 분자 식별지원 stemness에서 조직 공학 및 재생 의학 (5)에 직접 응용 프로그램을해야합니다. 그러나, 그것의 중요성에도 불구하고, ECM이 남아있다 최근까지 6 underexplored.
실리에서 분석은 ECM과 ECM 관련 단백질의 앙상블로 정의 matrisome는, 인간 및 마우스 모두 게놈 -1,7,8,8-에서 수백 유전자의 제품을 포함하는 것을 밝혔다. 그러나, ECM 단백질의 불용성은 정상 및 병리학 표본 생체 내 세포 외 기질의 조성물의 특성을 체계적 방해했다. (10) - 우리는 최근이 불용성이 유리하게 설정 될 수 있고, ECM 단백질 8을 풍부하게하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다. 10, 13 - 우리 등은 상기 질량 분석기는 ECM들 (8)의 조성물의 특성을 선택하는 방법 이었다는 것을 보여 주었다.
우리여기에 다른 pH와 소금과 세제 농도의 버퍼에 순차적 배양으로 구성 탈세 포화 절차를 설명합니다. 추출 (또는 고갈) 세포질, 핵, 막과 세포 골격 단백질과 ECM 단백질의 농축이 프로 시저의 결과로. 우리는 그 다음 질량 분석에 의한 이후의 분석을위한 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 준비를 소화하는 방법을 설명합니다.
자세한 여기에 설명 된 절차를 사용하여, 우리는 성공적으로 농축 및 질량 분석을 특징으로 10 개의 다른 조직과 종양 유형의 세포 외 매트릭스 한 정상 쥐의 폐 (8), 인간과 쥐의 대장 8, 9, 인간의 간 (9), 인간의 대장 종양과 파생 간 전이 (9), 흑색 종 이종 이식 (8), (게시되지 않은 나바 등.) 유방 종양 이종 이식 (10), 쥐의 췌장 섬과 쥐 insulinomas. 다른 matrisom의 비교ES는 더 잠재적 인 진단이나 예후 바이오 마커로 사용될 수있는 조직 - 및 종양 특이 ECM 서명 한 것으로 밝혀졌습니다.
우리는이 절차가 없거나 상대적으로 약간의 수정과 다른 시료에 적용 할 수 있다고 믿는다.
Protocol
주 : 절차는 신선하거나 냉동 플래시 조직에서 수행 될 수있다. 우리는 혈구와 혈장 단백질 적색을 제거하기 위해 박리시 PBS 매우 혈관 조직 관류를 권장합니다. 우리는 고정으로 고정 된 조직의 절차를 수행하지 않는 것이 좋습니다 (예, 화학 가교) 탈세 포화를 방해하고도 크게 후속 질량 분석 분석을 손상시킬 수 있습니다. 전체 절차를 위해, 우리는 단백질과 펩타이드 회복을 극대화하기 위해 낮은 유지 튜브 및 피펫 팁의 사용을 권장합니다.
조직 또는 종양의 1 탈세 포화
참고 : 시작하기 전에, 시약을 준비하고 각 버퍼의 원하는 볼륨 (구획 단백질 추출 키트와 함께 제공) 프로테아제 억제제를 추가합니다. 모든 샘플은 버퍼 및 SDS의 강수량을 방지 RT에서 유지 될 필요가 버퍼 CS 제외한 실험 기간 동안 얼음에 보관해야itation.
주 : 프로토콜은 상이한 pH 및 추출물의 세포 내 단백질을 순차적 불용성 ECM 단백질 (도 1, 표 1 농축 염 및 세제의 다른 양을 함유 완충액에서 인큐베이션 시리즈를 사용하여 상기의 사용에 대한 대안에 대해서도 논의 참조 상업 키트) 여기에 자세한. 아래에 주어진 시약의 볼륨은 조직 또는 종양 (표 1 참조) 100mg을위한 것이며, 적절히 조정할 필요가있다.
- 조직이 완전히 파괴되어 균일 한 현탁액이 얻어 질 때까지 조직 균질화기를 사용하여, 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액 C의 500 μL에 100 mg의 조직을 균질화.
주 : 추가 디옥시리보 뉴 클레아 제 I (최종 농도 200 μg의 / ㎖, 제조업체의 지시에 따라 재구성)와 A (20 ㎍ / ㎖, 제조업체의 지시에 따라 재구성 된 최종 농도) 리보 뉴 클레아버퍼 N. - 세포 용해 단백질의 연속 추출
- 세포질 단백질의 추출. 4 ° C에서 20 분 동안 튜브 회전에 균질을 품어. 이후 웨스턴 블롯 분석 (예상 결과 섹션과 그림 2 참조) 균질의 작은 나누어지는 (20 μL 10 μL)를 저장합니다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 균질을 원심 분리기. 깨끗한 튜브에 뜨는을 수집,이 웨스턴 블롯 분석의 세포질 (C) 부분을 구성하는 것입니다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결.
- 세척하기 위해, 프로테아제 억제제를 함유하는 W 완충액 400 μL에 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양한다. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 균질을 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- 추출하려면, 핵 단백질, 버퍼 N 150 μL 단백질 분해 효소 억제제를 함유하는 펠렛을 재현 탁, deoxyribonucleaSE 및 리보 뉴 클레아 제 I과 4 ℃에서 30 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양한다.
- 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 깨끗한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 일단이 단계를 반복 : 두 번째로 샘플을 원심 분리 한 후, 이전 뜨는로 뜨는을 추가 :이 웨스턴 블롯 분석의 핵 (N)의 일부를 구성한다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결. 그런 다음, 단계 1.2.3에 따라 세척을 수행합니다.
- 막 단백질을 추출하기 위해, M 완충액 100 ㎕ 프로테아제 억제제를 함유하는 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 30 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양한다. 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기
- 깨끗한 튜브에 뜨는을 수집 :이 웨스턴 블롯 분석의 막 (M) 부분을 구성하는 것입니다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결.
- 2 펠렛을 재현 탁, 세포 골격 단백질을 추출하려면프로테아제 억제제를 함유하고 RT에서 30 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양 완충액 CS 00 μL.
펠렛가 완전히 용해되지 않습니다. 우리는 펠렛의 중단을 관찰까지 피펫 팅에 의해 아래로 펠렛을 방해하는 것이 좋습니다. - RT에서 30 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 깨끗한 튜브에 뜨는을 수집합니다. 이 시점에서 펠릿 (비디오 참조)의 크기를 더 감소를 표시합니다.
- 버퍼 C 포함 된 단백질 분해 효소 억제제의 150 μL에 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 튜브 회전에 샘플을 품어. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 상층 액을 수집하고 이전 상층 액에 추가 :이 웨스턴 블롯 분석의 세포 골격 (CS) 부분을 구성하는 것입니다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결.
- 추가 세척을 수행합니다. PBS 500 ㎕의 프로테아제 억제제를 함유하는 펠렛을 재현 탁차 4 ℃에서 5 분 동안 튜브 회전에 샘플을 품어. 4 ℃에서 5 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 상층 액을 버린다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
참고 : 세제의 모든 흔적은 펩타이드 (제 3 장 참조)에 이전에 단백질의 소화에 광범위한 세척에 의해 제거 될 필요가있다. 이 시점에서, ECM 강화 펠렛 플래시 냉동 할 수 있고, -80 ° C에 보관. 펠릿의 크기는 출발 물질에 불용성 (ECM) 단백질의 양과 탈세 포화의 효율에 의존하는 것에주의.
2. SDS-PAGE와 서양의 얼룩에 의해 탈세 포화 / ECM 농축 품질 모니터링
- 전체 조직 추출물의 10 ~ 20 μL 나누어지는 및 램 믈리 버퍼 100 mM의 DTT를 포함와 중간 분수 50 μL 분취 액을 섞는다. 100 mM의 DTT를 함유 3X 램리 완충액 ECM 풍부한 불용성 분획을 재현 탁.
주 : 그는 농도를 상승DTT 및 SDS 비교적 불용성 ECM 단백질의 가용화에 도움. - SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리하고 니트로 셀룰로오스 막에 전사.
- 세포질, 핵, 막, 세포 골격과 ECM 분수의 각각의 단백질 담당자를 모니터링하는 항체를 사용하여 면역 블롯을 수행 (대표 결과 섹션, 표 2 및 그림 2 참조).
질량 분석기 분석을위한 펩티드 단백질의 3 인 - 솔루션 소화
참고 : SDS의 탈세 포화 절차 및 제거 후 얻어진 펠렛은이 단백질이 펩타이드로 분해 될 필요가 질량 분석에 의해 추가 분석을 위해 불용성 ECM 단백질에 매우 충실. 이 단계는 샘플의 단백질 농도를 측정하기에 ECM 단백질 불용성의 결과, 그것이 가능하지 않은 것처럼, 그 참고. 우리는 따라서 ECM-enri을 소화 시약의 볼륨을 제공ECM 강화 펠렛 (표 3)의 크기 (mm) 또는 건조 중량을 기준으로 펩타이드 CHED 샘플. 중탄산 암모늄, 우레아, DTT, 요오도 아세트 아미드와 트리 플루오로 아세트산 용액 모두 새로 제조 할 필요가있다.
- ECM 강화 펠렛 8 M 우레아의 적절한 양을 첨가함으로써 ECM 농축 샘플을 재현 탁 10mm의 최종 농도를 추가 DTT (표 3 참조). 37 ° C에서 2 시간 동안 1400 rpm으로 연속 교반하면서 인큐베이션.
주 :이 시점에서 ECM 단백질이 완전히 용해되지 않고 가시적 큰 단백질 입자를 원심 분리 또는 여과에 의해 폐기되지 않아야한다. 서스펜션은 탈 글리코 실화와 소화 (동영상 참조)에 따라 삭제됩니다. - 알킬화
- HPLC 등급 물에 요오도 아세트 아미드 솔루션을 준비합니다. RT로 냉각시키고, 샘플을 25 mM의 최종 농도 요오도 아세트 아미드를 추가한다. 완전한 알킬화, DTT : 요오도 아세트 아미드의 비율이 1 사이 여야 : 2이다.5, 1 : 3이다.
- RT에서 30 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션.
- 탈 글리코 실화 :
참고 : 탈 글리코 실화는 탄수화물 측 N에 의해 수정 된 펩티드의 식별을 방해 체인 글리코 실화를 -linked을 제거하기 위해 필요합니다.- 100 mM 중탄산 암모늄 pH가 8.0이 M 우레아로 희석 PNGaseF 적당량 추가 (표 3 참조). 37 ° C에서 2 시간 동안 1400 rpm으로 연속 교반하면서 인큐베이션.
- 소화
- 리스-C를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 1,400 rpm에서 연속 교반 배양한다. 트립신을 추가하고 37 ℃에서 1,400 rpm으로 O / N에서 연속 교반 배양한다.
참고 : 8M 우레아의 초기 재구성시 흐린 시작 ECM 풍부한 서스펜션은 O / N 소화 (동영상 참조) 한 후에도 나타납니다. - 37 ° C에서 추가로 2 시간 동안 1,400 rpm에서 연속 교반 샘플에 트립신의 두 번째 나누어지는을 추가하고 품어. </ 리>
- 리스-C를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 1,400 rpm에서 연속 교반 배양한다. 트립신을 추가하고 37 ℃에서 1,400 rpm으로 O / N에서 연속 교반 배양한다.
- 산성화
- 소화가 완료되면, 새로 제조 한 50 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)와 함께 샘플을 산성화하여 트립신을 불 활성화. 샘플 우리는 시간에 50 % TFA의 1.5 μl를 첨가하고 (동영상을 참조)의 pH 페이퍼를 이용하여 용액의 pH를 측정하는 펩티드 액 1 μl를 사용하여 제안의 pH <2에 도달한다.
- 실온에서 5 분 동안 16,000 XG에서 산성화 샘플을 원심 분리기. 깨끗한 낮은 유지 관에 뜨는을 수집합니다. 이 시점에서, 펩티드 용액을 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 탈염
주 :이 마지막 단계는 일반적으로 자신의 바람직한 방법에있어서 질량 분석 설비에서 수행된다.- 이전 단백질 체학 분석, 진공 농축기에서 농축하여 새로 제조 된 60 % 아세토 니트릴, 0.1 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출 샘플 및 펩티드는 탈염. 갓 준비한 3 % acetonitr에서 펩티드를 재현 탁ILE, 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (8).
주 : 탈염 후, 펩티드 용액의 농도 측정법에 의해 측정 될 수 있음을 (예상 결과 섹션을 참조). - 이제 다시 질량 분석 기능의 최적의 절차에 따라, 질량 분광기 시료를 분석한다.
주 : 우리는 출판물 8을 참조 질량 분석법을 사용하는 ECM의 조성물을 특성화 관심 연구자 장려 - LC-MS / MS 매개 단백질 식별 정보 및 데이터 분석을위한 질량 분석 데이터 검색을 포함한 더 상세한 설명을 제공한다 (10) 및 웹 사이트 우리가 8 경제력에 실리 matrisome 주석 도구를 사용하여.
- 이전 단백질 체학 분석, 진공 농축기에서 농축하여 새로 제조 된 60 % 아세토 니트릴, 0.1 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출 샘플 및 펩티드는 탈염. 갓 준비한 3 % acetonitr에서 펩티드를 재현 탁ILE, 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (8).
Representative Results
탈세 포화 과정의 품질 관리
탈세 포화의 효율을 웨스턴 블롯에 의해 각 분획의 단백질 함량을 분석함으로써 모니터링 될 수있다. 진단 값이 나열 단백질 표 탈세 포화 과정의 품질을 평가.도 2a는 세포질의 중간 분획의 효율적인 추출 (GAPDH를 도시 ), 원자력 (히스톤), 막 (β1의 인테그린)과 세포 골격 (액틴) 단백질, 더 ECM 단백질 (콜라겐 내가)이 분수에서 검출되지 않은 반면 (그림 2). 차례로, 최종 펠릿 ECM 단백질에 대해 충실 크게 세포 내 단백질 (도 2A). 액틴 여전히 검출 할 수 있지만,도 2b는, 양호한 세포 내 단백질 고갈 (에는 히스톤이 ECM - 풍부 분획에서 검출되지 않는다) 선물 고갈 ECM - 풍부 분획 및 모노머 콜라겐 I의 고갈- 겉보기 분자량 ~ 110 kDa의, 추정하여 내가 조립되지 않은 콜라겐에 해당 - 연사 부분에서 관찰 할 수있다.
일부 조직에서 이들 성분이 부분적으로 이전 분획 8-10 가용화 할 수 있지만, 우리는 또한 통상적으로, 피브로넥틴 및 라미닌 등의 부가적인 ECM 단백질을 모니터링한다. 예를 들어, 피브로넥틴도 ECM에 포함되지 않는 수용성 플라즈마 피브로넥틴을 발생한다. 추출하기 전에 조직의 관류 플라즈마 피브로넥틴 농도를 줄일 수 있지만, 항상 그것을 제거하지 않습니다. 일부 조직에서, 라미닌이 발견 느슨하게 세포 표면 또는 중간 분수에서 전자 재료 및 추출물과 연결되어 있습니다. 이런 일이 발생하면이를 추출 조건 (논의 참조) 변경함으로써 해결할 수있다.
ECM 단백질과 세포 내 구성 요소의 수반 고갈의 농축이 다른 버퍼에서 단백질의 상대적인 용해도를 기반으로합니다. 목다른 조직들 사이 다릅니다이다 - 어떤 경우에는 히스톤과 액틴은 더 쉽게 다른 사람에 비해 추출된다. 또한 히스톤은 N 분획 (도 2B)에서 추출 될 것으로 예상되지만, 우리가 흔히 M 또는 CS 분획 (도 2A와 B)에서 히스톤의 더 완전한 공핍을 관찰, 참고.
지표 펩타이드 농도 예상
소화, 산성화하고, 탈염 후의 펩티드 용액의 농도를 분광 광도법에 의해 어느 트립토판, 티로신에 상당하는 280 nm 파장을 사용하여 펩티드 용액의 흡광도를 측정, 또는 펩티드의 흡광도에 상응하는 205 nm 파장을 사용하여 측정 할 수있다 채권.
우리는 (각각, 82 ㎎, 100 ㎎, 100 ㎎)을 세 뮤린 폐 샘플 탈세 포화로부터 얻어지는 펩티드 용액의 농도를 측정 처리장424 NG / μL, 450 NG / μL, 각각 펩티드의 580 NG / μL : 레드 병렬로 각에서 얻을.
질량 분광기 ECM 펩티드 동정
여기에 기술 된 바와 같이 제조 된 ECM 풍부한 단백질 시료의 조성의 질량 분석은, 신호 강도의> 70 %가 ECM과 관련된 ECM 단백질 8-10에 해당 하였다.
조직 또는 종양의 100 mg의 (습 중량)을 decellularize하는 구획되지 추출 키트 시약의 표 1. 볼륨.이 표는 구성과 조직 또는 종양의 100 mg을 탈세 포화를 수행하는 데 사용되는 각 버퍼의 양을 보여줍니다. 프로테아제 억제제의 칵테일 50X 용액으로서 제공되고, 각 버퍼 (2)에 첨가 할 필요가있다.
| 구획 단백질 추출 키트 시약 | 조직 100 mg을위한 양 | 구성 (밀리 포아 데이터 시트 고양이 #을 기반으로 2145 1) |
| 버퍼 C | 500 μL | HEPES (pH를 7.9 3)의 MgCl 2의 KCl, EDT 4, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 (5) |
| 버퍼 W | 400 μL | HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 |
| 버퍼 N | 150 μL × 2 | HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2, 염화나트륨, EDTA, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 |
| 버퍼 W | 400 μL | HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 |
| 버퍼 M | 100 μL | HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 소듐 데 옥시 콜레이트 (DOC) 6, NP-40 6 |
| 버퍼 (CS) | 200 μL | 파이프 (PH 6.8)의 MgCl 2, 염화나트륨, EDTA, 자당, 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 7, 나트륨 오르토 바나 데이트 |
| 버퍼 C | 150 μL | HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 |
| 1X PBS | 500 μL / 세척 | - |
참고 :
1 독점 이유로, 우리는 키트의 공급 업체에서 버퍼의 정확한 구성을 얻을 수 없습니다, 그러나 우리는 여기에 유사한 추출을 수행하는 집에서 만든 버퍼를 사용하여 우리 자신의 경험을 바탕으로 몇 가지 메모를 포함한다.
2 프로테아제 억제제 : 그것은 등 시스테인, 세린 및 트레오닌 펩 티다 제, 세린 에스 테라 제, 가의 양이온 의존 메탈에 대한 억제제의 다양한 포함하는 것이 바람직하다많은 상업적으로 이용 가능한 단백 분해 효소 억제제 칵테일이 존재한다.
7.0 위의 3 pH는 리소좀 단백질 분해 효소의 효과적인 억제제이다.
(2 mM의 일반적으로 사용되는)은 EDTA 4 가의 양이온 의존적 프로테아제의 효과적인 억제제이다.
5 나트륨 오르토 바나 데이트는 포스 파타 아제 억제제이다. 일반적인 유효 농도는 0.5 mm 이상이어야한다.
0.1 % -0.5 %로 6 NP40 대부분 막 지질을 용해하기에 충분하다. NP40 및 DOC의 조합 - 종종 그대로 여러 단백질 - 단백질 상호 작용을 잎 추출 엄격한로서 사용된다 - 자주 (예를 들어, 각각의 0.5 %)이 동일한 농도에서 사용 하였다.
SDS는 7보다 엄격한 온성 세정제 (0.1 % CMC)이다. 또한 다른 두 세제 SDS / NP40 / DOC 중간 엄중 버퍼로서 0.1 / 0.5 / 0.5 %와 조합하여 사용할 수있다.
표 2. 진단 단백질에탈세 포화 과정의 품질을 감시한다.이 표는 탈세 포화 과정의 품질과 효율을 모니터링하기 위해 사용될 수있는 각각의 세포 내 구획 (세포질, 핵, 세포막, 세포 골격과 ECM)의 특성이다 단백질의 예를 보여 ECM-농축.
| 세포 내 구획 | 진단 단백질 |
| 세포질 단백질 | 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) |
| 핵 단백질 | 히스톤, 라민, Nucleoporin |
| 막 단백질 | 인테그린, 트랜스페린 수용체 |
| 세포 골격 단백질 | 액틴, 튜 불린, 멘틴 |
| 기저막 ECM 단백질 | 콜라겐 IV, Nidogens, 라미닌 |
| 간질 ECM 단백질 (간질) | 콜라겐 I, III 콜라겐, 콜라겐 VI, 피브로넥틴 |
항체에 추천을 위해, 우리의 출판물 8-10를 참조하십시오.
펩타이드에 ECM 풍부한 샘플을 소화 시약의 표 3. 볼륨.이 테이블은 ECM 풍부한 단백질 샘플을 재현 탁하고 감소, 킬레이트, deglycosylate 및 질량 분석 분석에 앞서 펩티드로 단백질 샘플을 소화하는 데 사용되는 시약을 보여줍니다.
| 시약 | 준비하기 | 1mm 두께의 펠릿에 대한 최종 농도 / 금액 (~ 5 ~ 10 mg의 건조 중량) | 1mm 두께의 펠릿을위한 양 (~ 5 ~ 10 mg의 건조 중량) |
| 중탄산 암모늄 (NH 4 HCO 3) | HPLC 급 물 100 mM의 솔루션 | - | - |
| 요소 | 100 mM의 중탄산 암모늄 용액에 8 M | 8 M | 50 μL |
| 디티 오 트레이 톨 | 500 mM의에서 HPLC 등급 물에 복원합니다 | 10 mM의 | 1 μL |
| 요오도 아세트 아미드 | 500 mM의에서 HPLC 등급 물에 복원합니다 | 25 mM의 | 2.5 μL |
| 펩티드 - N 글리코시다 제 F (PNGaseF) | 500 U / μL에서 상용 솔루션 | 1000 U | 2 μL |
| 엔도 프로의 lysC, 질량 분석 급 | 0.5 μg의 / μL에서 HPLC 등급 물에 복원합니다 | 1 μg의 | 2 μL |
| 트립신, 질량 분석 급 (1 라운드) | 0.5 μg의 / μL에서 상용 솔루션 | 3 μg의 | 6 μL |
| 트립신, 질량 분석 급 (2 라운드) | 0.5 μg의 / μL에서 상용 솔루션 | 1.5 μg의 | 3 μL |
| 트라이 플루오로 아세트산 (TFA) | HPLC 등급의 물 중의 50 % 용액 | - | 2-5 μL |
| 아세토 니트릴 (용출) | HPLC 등급의 물 중 0.1 % TFA 60 % 용액 | - | 500 μL |
| 아세토 니트릴 (재구성) | HPLC 등급의 물 중 0.1 % TFA 3 % 용액 | - | 100 μL |
실험 절차의 그림 1. 계획. protoco의 도식 워크 플로우L은 조직 (제 1) decellularize 탈세 포화의 품질을 제어하고 ECM 농축 (제 2) 평가 및 질량 분석 분석 (제 3 장) 이전에 펩타이드로 ECM 풍부한 단백질 샘플을 소화한다.
웨스턴 블롯에 의해 탈세 포화 과정의도 2 품질 관리 웨스턴 블롯 뮤린 폐 (A) 및 인간 유방 암종 이종 이식 (B) 다음의 항체를 사용하여 시료에 대해 수행 하였다 :. 토끼 항 - 액틴 (클론 14-1) 및 토끼 항 -β1 우리 실험실에서 생산 된 항체를 인테그린; 토끼 항 - 콜라겐 I, 마우스 항 GAPDH 및 토끼 항 팬 히스톤 항체는 밀리 포어로부터 있었다. 일차 항체 인큐베이션 후, 막을 세척하고, HRP 접합 된 염소 항 - 토끼 또는 염소 항 - 각서의 존재하에 인큐베이션잭슨이 뮤노 연구소에서 자체 이차 항체. 마지막으로, 막 세정과 서양의 번개 ™ 화학 발광 시약 (퍼킨 엘머 LAS)에서 배양 하였다. * ECM이 풍부한 부분의 최소한의 잔류 히스톤 오염을 나타냅니다. ** CS 분획에서 단량체 (추정하여 미 조립) 콜라겐 나는 부분 고갈을 나타냅니다. *** ECM이 풍부한 부분의 잔류 굴지의 오염을 나타냅니다. 항 - 콜라겐 항체에 의해 검출 스미어 번역 후 변형 (예를 들면, 가교 결합, 글리코 실화)의 다양한 수준을 나타낸다.
Discussion
수정
우리는 8 열 조직 및 종양 유형에서 ECM 농축이 정확한 순서를 채용하더라도 - (10)는, 프로토콜의 수정은 다음의 경우에 고려되어야한다 :
중간 분획 ECM 단백질 1) 검출.
피브로넥틴과 라미닌을 위해 전술 한 바와 같이, 서로 다른 조직이나 종양 유형의 세포 외 매트릭스는, 자신의 추출율 / 불용성 다를 수 있습니다. 예를 들어, 섬유 성 조직 또는 조직의 리모델링 ECM 매우 동적 뒤집 것으로 생각되며, 따라서 하나는 12보다 쉽게 추출 될 그 조직 ECM 단백질의 높은 비율을 관찰하는 것이다. ECM 단백질이 검출 된 분획에 따라, 우리는 ECM 단백질의 추출을 야기하거나 공정을 생략하는 단계의 배양 시간을 줄이는 것을 제안.
2) DECM 강화 펠렛 세포 내 성분의 상당한 부분의 금 속 탐. 일부 조직 또는 종양 유형 비 세포 : ECM은 특히 높은 (예, 간, 비장, 비 종양 조직 형성)이다. 이 경우에는 (특히 세포 골격 단백질 및 / 또는 히스톤)에 의한 세포 내 단백질 ECM 풍부한 분획의 상당한 오염이 관찰 될 수있다. 효율적으로, 우리는 버퍼 M 및 / 또는 버퍼 CS (모두 포함하는 세제,이 일반적으로 풍부한 세포 내 단백질을 소모)에 두 번 배양을 반복하는 것이 좋습니다 세포 내 단백질을 소모합니다. 또 다른 대안은 (다음 문단 참조)이 아니라 상대적으로 더 가용성 ECM 단백질의 고갈을 초래할 수 있음을주의하여 높은 세제 농도가 다른 버퍼를 사용하는 것이다.
상업용 키트를 사용하여 3) 대체.
우리는 이리저리 버퍼의 정확한 조성물을 얻었다 독점적 이유로 못했다구획되지 단백질 추출 키트의 공급 업체를 해요. 그러나, 우리는 표에 유사한 추출을 수행하기 위해 정의 된 세제와 집에서 만든 버퍼 (NP-40, 나트륨 데 옥시 콜레이트와 SDS)의 농도를 사용하여 우리 자신의 경험을 바탕으로 한 노트를 포함했다. 최근의 연구는 또한 ECM 단백질 13 탈세 포화를 유지하는 버퍼의 pH의 중요성을 강조 하였다.
기술의 한계
여기에 제시된 방법은 ECM 단백질이 본질적으로 더 불용성 가장 세포 내 단백질보다 사실에 의존한다. 그러나, 탈세 포화 방법은 여기에서 설명 확실히 같은 일부 성장 인자 또는 ECM-리모델링 효소로서 ECM 내에 존재하는 수용성 성분을 추출한다. 설명 된 바와 같이 단단히 ECM 단백질에 결합 ECM 관련 단백질이 준비 시료에서 단백질 체학에서 검출되었지만,이 방법은 완전히의 구성을 프로파일 너무 엄격 할 수 matrisome 관련단백질.
다른 방법에 대해 기술의 중요성
중간 단계를 생략 할 수 있거나 ECM 단백질의 손실을 방지하거나 각각 세포 내 단백질 오염의 고갈을 증가 반복 : 다른 방법을 통해 여기에 제시된 방법의 장점은 관심 ECM의 성질에 맞게 될 수 있다는 것이다. 이 방법은 단지 후속 펩타이드 제제 및 질량 분석계와의 간섭을 방지하기 위해 오프 린스 세제의 최소량을 사용한다. 마지막으로, 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 제제를 소화하기 위해 여기에 설명 된 방법은 또한 단백질이 용해 될와 "조"ECM - 풍부 분획에서 수행 될 수 요구하지 않는 장점을 갖는다.
(예를 들어 구아니딘 하이드로 클로라이드와 같은)를 이용하는 대안 chaotropes 탈세 포화 방법 질량 분광기하는 ECM의 구성을 연구 한 ㄴEEN은 (14에서 검토) 문헌에보고 된 15, 16 및 연골, 심장 (17), 유선 (18) 및 혈관 (19) 및 (20) 사구체 기저막의 ECM 조성물의 특성을 질량 분석기와 결합하여 사용되어왔다.
추천
ECM의 분석 이후의 단백질 체학에 대한 충실 경우 트립신이 부분 ECM의 소화와 ECM 단백질과 펩티드의 손실이 발생할 것으로 세포를 소화 트립신을 사용 탈세 포화 방법은 사용할 수 없습니다. 콜라게나 제 소화 조직 중단을 돕기 위해 사용되는 것 인 경우가 ECM 분해 및 ECM 단백질 및 펩티드의 상실을 초래 마찬가지로,주의 깊게 감시 할 필요가있다.
인 - 솔루션 대에서 젤 소화? ECM 단백질 3X 램리 완충액 때에도 100mm의 DTT, 분리 PO (6 % SDS를 함유), 가교 매우 불용성이며SDS 겔에 오를리. 따라서에서 젤 소화 바람직한 방법이 아니다.
미래의 응용 프로그램
또한 여기서 설명하지는 않지만, 탈세 포화 동안 수집 중간 분획의 각각의 조성물은 또한 질량 분석에 의해 분석 될 수 있음을 주목할 필요가있다. 아주 작은 샘플 (즉, 인간의 생체 검사) 또는 공부를 할 때 특히 도움이 될 수있는 정보가 다른 세포 분수에 요구 될 때.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
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