Abstract
Внеклеточный матрикс (ЕСМ) является комплекс сетчатая сшитых белков, которые предоставляет биофизических и биохимических сигналы, которые являются основными регуляторами клеточной пролиферации, выживания, миграции и т.д. ЕСМ играет важную роль в развитии и в различных патологий, включая сердечно-сосудистые и опорно-двигательного аппарата заболевания, фиброз и рак. Таким образом, характеризуя состав ЕСМ нормальных и больных тканей может привести к идентификации новых прогностических и диагностических биомаркеров и потенциальных новых терапевтических мишеней. Тем не менее, сама природа ECM белков (больших размеров, сшитых и ковалентно связанных, в значительной степени гликозилированный) оказал биохимические анализы ЕСМ сложной. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали метод обогащения ЕСМ из свежих или замороженных тканей и опухолей, которая воспользуется преимуществами неразрешимости ECM белков. Мы опишем здесь подробно процедуру decellularization, который состоит из последовательного вводаncubations в буферах различных рН и соли и моющих концентрации и что результаты в 1) добыча внутриклеточным (цитозольного, ядерного, цитоскелета мембраны и белков) и 2) обогащение ECM белков. Затем мы опишем, как deglycosylate и переварить ECM обогащенного белковых препаратов в пептиды для последующего анализа методом масс-спектрометрии.
Introduction
Внеклеточный матрикс (ЕСМ) является комплекс сетчатая из сшитого и гликозилированного белков, что обеспечивает архитектурную поддержку и закрепление для клеток и определяет, в частности, биомеханических свойств тканей "1,2. ECM белки также сигнализировать клеток либо непосредственно через свои рецепторы (например, интегрины, синдеканами и т.д.) или путем модуляции фактор роста сигнализации 3. ЕСМ обеспечивает, таким образом биофизических и биохимических сигналы, которые являются основными регуляторами клеточных процессов, таких как пролиферация, выживание, поляризации, дифференциации, миграции и т.д.
ЕСМ играет ключевую роль в физиологии, развития и старения 4. Кроме того, несколько патологий, таких как сердечно-сосудистых заболеваний, фиброза, мышечно-скелетные заболевания, рак, вызваны, или приводить к ECM изменения. Кроме того, ECM способствует поддержанию стволовых клеток ниш и определение основных молекул ECM-йна поддержку стволовости будет непосредственное применение в тканевой инженерии и регенеративной медицины 5. Тем не менее, несмотря на его важность, ЕСМ осталась, до недавнего времени, акваториям 6.
В кремнии анализ показал, что matrisome, определяется как совокупность ECM и ECM-белков, ассоциированных, включает продукты в несколько сотен генов в обоих человеческих и мышиных геномов 1,7,8. Тем не менее, неразрешимость ECM белков препятствует систематическому характеристику состава в естественных условиях внеклеточного матрикса нормальных и патологических образцов. Мы недавно показали, что это неразрешимость может быть превращен с успехом использоваться и для обогащения белков ЕСМ 8 - 10. Мы и другие показали, что дальнейшее масс-спектрометрии было методом выбора для характеристики состава ЕСМ 8 - 10, 13.
Мыздесь описывать процедуру decellularization, который состоит из последовательных инкубации в буферах различных рН и соли и моющих концентрациях. Эта процедура приводит к добыче (или истощения) цитозольных, ядерных, мембранных и белков цитоскелета и обогащения ECM белков. Затем мы опишем, как переварить ECM обогащенного белковых препаратов в пептиды для последующего анализа методом масс-спектрометрии.
При применении описанных здесь, и показано, мы успешно обогащается и характеризуются масс-спектрометрии внеклеточные матрицы из десяти различных тканей и типов опухолей: нормальный мышиный легких 8, человеческий и мышиный толстой кишки 8,9, печени человека 9, толстого кишечника человека и производные метастазы в печень, 9 ксенотрансплантатов меланомы 8, молочные ксенотрансплантатов опухоли 10, мышиные панкреатических островков и мышиные инсулиномы (Наба и др., неопубликованные). Сравнение различных matrisomES показал ткани, так и специфические опухолевые подписи ECM, что дополнительно могут быть использованы в качестве потенциальных диагностических или прогностических биомаркеров.
Мы считаем, что эта процедура может быть применена к другим образцов с отсутствием или относительно незначительных модификаций.
Protocol
Примечание: Эта процедура может быть проведена на свежих или замороженных флэш тканей. Мы рекомендуем перфузии тканей высоко васкуляризированных с PBS в момент вскрытия устранить эритроциты и белки плазмы. Мы не рекомендуем проводить процедуру на фиксированных тканей, как фиксации (т.е., химическое сшивание) мешает decellularization, а также может значительно компромисс последующее масс-спектрометрического анализа. Для всей процедуры, мы рекомендуем использовать недорогим хранения труб и наконечники пипеток, чтобы максимизировать белка и пептид восстановление.
1. Decellularization тканей или опухолей
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом подготовки реагентов и добавить ингибиторы протеазы (поставляется с комплектом белка Добыча ящиком) до желаемого объема каждого буфера. Все буферы и образцы должны храниться на льду в течение всего срока эксперимента, за исключением буфера CS, которая должна быть при комнатной температуре, чтобы предотвратить SDS осадковitation.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол использует ряд инкубации в буферах различных рН и содержащий различное количество солей и моющих средств, чтобы последовательно извлекать внутриклеточные белки и обогащают для нерастворимых белков ECM (рисунок 1, таблица 1; см также обсуждение альтернатив с использованием коммерческий набор подробно здесь). Объемы реагентов, приведенные ниже, могут быть 100 мг тканей или опухолей (таблица 1) и должны быть скорректированы соответствующим образом.
- Однородный 100 мг ткани в 500 мкл буфера C, содержащих ингибиторы протеазы с использованием гомогенизатора тканей, пока ткань не полностью нарушена, и гомогенную суспензию получают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить дезоксирибонуклеаза я (конечная концентрация: 200 мкг / мл, восстановленный в соответствии с инструкциями завода-изготовителя) и рибонуклеазы A (конечная концентрация: 20 мкг / мл, восстановленный в соответствии с инструкциями завода-изготовителя) наБуфер Н. - Последовательное извлечение внутриклеточных растворимых белков
- Добыча цитозольными белков. Инкубируйте гомогената на трубке ротатора в течение 20 мин при 4 ° С. Сохранить небольшую аликвоту (10 мкл до 20 мкл) гомогената для последующего Вестерн-блот-анализа (см раздел ожидаемых результатов и рисунок 2).
- Центрифуга гомогената при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Собирают супернатант в чистую пробирку, это будет означать цитозольной (C) фракцию Вестерн-блот-анализа. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C.
- Мыть, ресуспендируют осадок в 400 мкл буфера, содержащего W ингибиторы протеазы и инкубируют образец на трубке ротатора в течение 20 мин при 4 ° С. Центрифуга гомогената при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Удалите супернатант.
- Чтобы извлечь, ядерные белки, ресуспендируют осадок в 150 мкл буфера N, содержащих ингибиторы протеазы, deoxyribonucleaсебе я и рибонуклеазы и инкубировать образец на трубке ротатора в течение 30 мин при 4 ° С.
- Центрифуга образца при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и собирают супернатант в чистую пробирку. Повторите этот шаг один раз: после центрифугирования образца во второй раз, добавить супернатант с предыдущим супернатанта: это будет представлять собой ядерный (N) фракцию Вестерн-блот-анализа. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C. Затем выполните стирок, как за шагом 1.2.3.
- Чтобы извлечь мембранные белки, ресуспендируют осадок в 100 мкл буфера M, содержащих ингибиторы протеазы и инкубируют образец на трубке ротатора в течение 30 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° C
- Собирают супернатант в чистую пробирку: это будет представлять собой мембрану (М) фракцию Вестерн-блот-анализа. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C.
- Чтобы извлечь белки цитоскелета, ресуспендируют осадок в 200 мкл буфера CS, содержащие ингибиторы протеазы и инкубируют образец на трубке ротатора в течение 30 мин при комнатной температуре.
Следует отметить, что осадок не будет полностью растворяются. Мы не рекомендуем нарушая гранул с помощью пипетки вверх и вниз до тех пор, наблюдая разрушение гранул. - Центрифуга образца при 16000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Собирают супернатант в чистую пробирку. Примечание в этот момент на дальнейшее заметное снижение размера гранул (см видео).
- Ресуспендируют осадок в 150 мкл буфера C, содержащего ингибиторы протеаз и инкубировать образец в трубке ротатора в течение 20 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
- Соберите супернатант и добавить его к предыдущему супернатанта: это будет представлять собой цитоскелета (CS) часть западной блоттинга. Вспышка заморозить эту долю и хранить при температуре -80 ° C.
- Выполнение дополнительных моет. Ресуспендируют осадок в 500 мкл PBS, содержащим ингибиторы протеазй инкубировать образец на трубке ротатора в течение 5 мин при 4 ° С. Центрифуга образца при 16000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Повторите этот шаг три раза.
Примечание: Все следы моющих средств должны быть удалены путем промывки обширных до переваривания белков до пептидов (см раздел 3). В этот момент, ЭБУ обогащенного осадок может быть быстро замораживали и хранили при -80 ° С. Обратите внимание, что размер гранул зависит от количества нерастворимых (ECM) белков в исходном материале и эффективности decellularization.
2. Мониторинг качества Decellularization / ECM обогащение SDS-PAGE и вестерн-блоттинга
- Смешайте 10-20 мкл аликвоты общей экстракта ткани и 50 мкл аликвоты промежуточных фракций с буфера Лэммли, содержащим 100 мМ ДТТ. Ресуспендируют ECM-обогащенный, нерастворимой фракции в 3х Laemmli буфер, содержащий 100 мМ DTT.
Примечание: он повышенные концентрацииДТТ и SDS помочь в солюбилизации белков ЕСМ, которые относительно нерастворимы. - Отдельные белки электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны.
- Выполните иммунные пятна с использованием антител для мониторинга белки представителя каждого из цитоплазмы, ядерные, мембранных, цитоскелета и ECM фракций (см представителя раздел результаты, таблица 2 и рисунок 2).
3. В-решения Переваривание белков в пептидов для анализа масс-спектрометрии
Примечание: Осадок, полученный после процедуры decellularization и удалени ДДС является сильно обогащены нерастворимых белков ЕСМ для дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии эти белки должны быть переварены в пептидов. Следует отметить, что, как следствие ECM белок нерастворимости, это не возможно на этом этапе, чтобы измерить концентрации белка в пробе. Таким образом, мы предоставляем объемы реагентов, чтобы переварить ECM-ЭнриCHED образцы пептидов в зависимости от размера (мм) или сухого веса ECM обогащенного гранулы (таблица 3). Растворы бикарбоната аммония, мочевины, DTT, иодацетамидом и трифторуксусной кислоты все должны быть свежеприготовленным.
- Ресуспендируют ECM обогащенного образца добавлением соответствующего объема 8 М мочевины с ECM обогащенного гранулы и добавить DTT при конечной концентрации 10 мМ (таблица 3). Инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С.
Примечание: в этой точке белков ЕСМ не будет полностью растворяется и заметно большие белковые частицы не должны быть отброшены центрифугированием или фильтрацией. Подвеска будет очистить от дегликозилирования и пищеварения (см видео). - Алкилирование
- Подготовка иодацетамидом решение в ВЭЖХ-класса воды. Охлаждают образец до комнатной температуры и добавить иодацетамида до конечной концентрации 25 мМ. Для полного алкилирования, ДТТ: Отношение иодацетамид должно быть от 1: 2.5 и 1: 3.
- Инкубируют в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Дегликозилирование:
Примечание: дегликозилирование нужно удалить углеводные боковые цепи, которые мешают идентификации пептидов, модифицированных N -связанной гликозилирование.- Развести до 2 М мочевины с 100 мМ бикарбоната аммония рН 8,0 и добавляют соответствующее количество помощью PNGазы F (таблица 3). Инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С.
- Пищеварение
- Добавить Lys-C и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С. Добавить трипсина и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту O / N при 37 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECM-богатых подвеска, которая стала облачно при первоначальном восстановлении в 8М мочевины становится ясно после вывода / N пищеварения (см видео). - Добавить вторую аликвоту трипсина на образец и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение дополнительных 2 ч при 37 ° С. </ LI>
- Добавить Lys-C и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту в течение 2 ч при 37 ° С. Добавить трипсина и инкубируют при непрерывном перемешивании при 1400 оборотах в минуту O / N при 37 ° С.
- Подкисление
- После завершения пищеварения, инактивации трипсина путем подкисления образца с свежеприготовленного 50% трифторуксусной кислоты (TFA). Образец должен достичь рН <2. Мы предлагаем добавить 1-1,5 мкл 50% ТФК в то время, и с помощью 1 мкл раствора пептида, чтобы измерить рН раствора с помощью рН бумаги (см видео).
- Центрифуга подкисленного образца при 16000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Соберите супернатант в чистую низкой удерживающей трубы. В этот момент, пептидный раствор можно хранить при -20 ° С.
- Обессоливание
Примечание: что этот последний шаг, как правило, проводится при массовом учреждении спектрометрии в соответствии с их собственными предпочтительных способах.- Перед анализом протеомики, обессоливания образцы и пептиды элюировали свежеприготовленного 60% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты, с последующим концентрированием в вакууме концентратора. Ресуспендируют пептидов в свежеприготовленный 3% acetonitrIle, 0,1% трифторуксусной кислоты 8.
Примечание: что после обессоливания, концентрация раствора пептида может быть измерена с помощью спектрофотометрии (см раздел ожидаемых результатов). - Теперь анализировать образец методом масс-спектрометрии, снова в соответствии с процедурами, оптимальных средств массовой спектрометрии объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем исследователей, заинтересованных в характеризующая состав ЕСМ с помощью масс-спектрометрии для обозначения других наших публикаций 8 - 10 и веб-сайт, которые обеспечивают дальнейшее подробное объяснение, в том числе параметров LC-MS / MS, масс-спектрометрия поиска данных для идентификации белков и анализа данных используя в кремнии matrisome аннотации инструмент, который мы разработаны 8.
- Перед анализом протеомики, обессоливания образцы и пептиды элюировали свежеприготовленного 60% ацетонитрила, 0,1% трифторуксусной кислоты, с последующим концентрированием в вакууме концентратора. Ресуспендируют пептидов в свежеприготовленный 3% acetonitrIle, 0,1% трифторуксусной кислоты 8.
Representative Results
Контроль качества процедуры decellularization
Эффективность decellularization можно контролировать с помощью анализа на содержание белка в каждой фракции с помощью вестерн-блоттинга. В таблице 2 перечислены белки диагностическое значение для оценки качества процедуры decellularization. 2А показывает эффективную экстракцию в промежуточных фракций цитозольного (GAPDH ), ядерные (гистоны), мембрана (β1 интегрина) и цитоскелета (актин) белки, тогда как нет ECM белки (коллаген I) не обнаружено в этих фракций (рисунок 2). В свою очередь, конечный осадок, обогащенный по белкам ЕСМ и в значительной степени обеднена внутриклеточных белков (Фигура 2А). 2В представляет удовлетворительную истощение внутриклеточного белка (не гистонов не обнаружено в ECM фракцию, обогащенную), хотя, актин-прежнему могут быть обнаружены в ECM-фракцию, обогащенную и истощение мономерного коллагена I- Кажущаяся молекулярная масса ~ 110 кДа, предположительно, соответствующий несобранном коллагена I - можно наблюдать во фракции CS.
Мы также постоянно контролировать дополнительные ECM белков, таких как фибронектин и ламинин, хотя в некоторых тканях эти компоненты могут быть частично солюбилизируют в более ранних фракций 8-10. Например, фибронектин происходит также растворимый в плазме фибронектин, не включенного в ECM. Перфузии ткани до извлечения уменьшает концентрацию фибронектина в плазме, но не всегда его ликвидации. В некоторых тканях, ламинины найдены свободно связаны с поверхностью клеток или ECM и экстракта в промежуточных фракций. Если это происходит, может быть решена путем изменения условий добычи (см Обсуждение).
Следует отметить, что обогащение белков ЕСМ и сопутствующей истощению внутриклеточных компонентов основан на относительной растворимости белков в различных буферах. Чтэто отличается среди различных тканей - в некоторых случаях гистоны и актин более легко извлекается, чем в других. Также обратите внимание, что, хотя гистоны, как ожидается, должны быть извлечены в N фракции (рис 2B), мы часто наблюдаем более полное истощение гистонов в М или CS фракции (рис 2А и В).
Ориентировочный концентрация пептида ожидается
Концентрация раствора пептида, полученного после варки, подкисление и обессоливания может быть измерена с помощью спектрофотометрии либо путем измерения оптической плотности раствора пептида с использованием длины волны 280 нм, соответствующей триптофан, тирозин, или с использованием длины волны 205 нм, соответствующей оптической плотности пептида облигации.
Мы измерили концентрацию растворов пептидов, полученных из трех decellularization мышиных легких образцов (82 мг, 100 мг и 100 мг, соответственно) прекрасный параллельно и получают друг от 424 нг / мкл, 450 нг / мкл, и 580 нг / мкл пептидов соответственно.
Идентификация ECM пептидов методом масс-спектрометрии
Масс-спектрометрический анализ состава образцов белка ECM обогащенный, полученных, как описано здесь, показывают, что> 70% интенсивности сигнала соответствует ECM и ECM белков, ассоциированных с 8-10.
Таблица 1. Объем реагентов из Менажницы извлечения комплекта decellularize 100 мг (влажная масса) ткани или опухоли. В этой таблице перечислены состав и объем каждого буфера, используемого для проведения decellularization 100 мг ткани или опухоли. Коктейль ингибиторов протеазы получают в виде раствора 50x и должна быть добавлена к каждому буфере 2.
| Реагенты из отсека белка Extraction Kit | Объем на 100 мг ткани | Состав (на основе Millipore Cat # техническое описание 2145 1) |
| Буфер С | 500 мкл | HEPES (рН 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, сахароза, глицерин, натрия ортованадата 5 |
| Буфер Вт | 400 мкл | HEPES (рН 7,9), MgCl 2, KCl, ЭДТА, сахароза, глицерин, натрия ортованадата |
| Буфер N | 150 мкл х 2 | HEPES (рН 7,9), MgCl 2, NaCl, ЭДТА, глицерин, натрия ортованадата |
| Буфер Вт | 400 мкл | HEPES (рН 7,9), MgCl 2, KCl, ЭДТА, сахароза, глицерин, натрия ортованадата |
| Буфер М | 100 мкл | HEPES (рН 7,9), MgCl 2, KCl, ЭДТА, сахароза, глицерин, дезоксихолат натрия (DOC) 6, NP-40 6 |
| Буфер CS | 200 мкл | Труб (рН 6,8), MgCl 2, NaCl, ЭДТА, сахароза, додецилсульфата натрия (SDS) 7, натрия ортованадата |
| Буфер С | 150 мкл | HEPES (рН 7,9), MgCl 2, KCl, ЭДТА, сахароза, глицерин, натрия ортованадата |
| 1x PBS, | 500 мкл / стирки | - |
Примечания:
1 Для собственных причин, мы не смогли получить точный состав буферов с поставщиком комплекта, но мы включаем сюда некоторые заметки, основанные на собственном опыте использования самодельных буферов проводить подобные экстракции.
2 ингибитор протеазы: целесообразно включать в себя различные ингибиторы против цистеин, серин и треонин, серин пептидазы эстераз, двухвалентный катион-зависимые металлопротеиназ и т.д.Существует множество коммерчески доступных ингибиторов протеазы коктейли.
3 рН выше 7,0 является эффективным ингибитором лизосомальных протеаз.
4 ЭДТА (обычно используется в 2 мм) является эффективным ингибитором двухвалентный катион-зависимой протеазы.
5 ортованадата натрия ингибитор фосфатазы. Типичный эффективная концентрация будет 0,5-5 мм.
6 NP40 на уровне 0,1% -0,5% достаточно для растворения наиболее мембранные липиды. Сочетание NP40 и DOC - часто используется при равных концентрациях (например, 0,5% каждого) - часто используется в качестве более строгого добычи, что по-прежнему оставляет много белок-белковых взаимодействий нетронутыми.
7 SDS является более жестким неионного детергента (0,1% КМЦ). Он также может быть использован в сочетании с двумя другими моющими средствами SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% в качестве промежуточного буфера жесткости.
Таблица 2. Диагностические белки вконтролировать качество процедуры decellularization. В этой таблице перечислены примеры белков, которые характеристики каждого субклеточном отсека (цитозоль, ядра, плазматической мембраны, цитоскелета и ECM), которые могут быть использованы для мониторинга качества процедуры decellularization и эффективность ECM-обогащение.
| Внутриклеточное | Диагностические Белки |
| Цитозольные белки | Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) |
| Ядерные белки | Гистоны, Ламины, Нуклеопорин |
| Мембранные белки | Интегрины, рецептор трансферрина |
| Белков цитоскелета | Актина, тубулина, Виментин |
| Базальная мембрана ECM белки | Коллаген IV, Nidogens, ламининов |
| Промежуточные белки ECM (интерстициальные) | Коллаген я, коллаген III, коллаген В.И., Фибронектин |
Для рекомендации на антитела, увидеть наши публикации 8-10.
Таблица 3. Объем реагентов переварить образцы ECM обогащенного до пептидов. В этой таблице перечислены реагенты, используемые для ресуспендирования образцы белка ECM обогащенного и уменьшить, алкилирования, deglycosylate и переварить белки образцы в пептиды до масс-спектрометрического анализа.
| Реагенты | Подготовка | Конечная концентрация / Объем за 1 мм толщиной гранул (~ 5-10 мг сухого веса) | Объем за 1 мм толщиной гранулы (~ 5-10 мг сухого веса) |
| Бикарбонат аммония (NH 4 HCO 3) | 100 мМ раствора в ВЭЖХ-класса водой | - | - |
| Мочевина | 8 М раствор в 100 мМ бикарбоната аммония | 8 М | 50 мкл |
| Дитиотреитол | Восстановить в ВЭЖХ-класса воды на 500 мм | 10 мм | 1 мкл |
| Йодацетамид | Восстановить в ВЭЖХ-класса воды на 500 мм | 25 мм | 2,5 мкл |
| Пептидные N -Glycosidase F (помощью PNGазы F) | Коммерческий раствор при 500 U / мкл | 1000 U | 2 мкл |
| Эндопротеиназой LysC, масс-спектрометрия-класса | Восстановить в ВЭЖХ-класса воды на 0,5 мкг / мкл | 1 мкг | 2 мкл |
| Трипсин, масс-спектрометрия класса (раунд 1) | Коммерческий раствор при 0,5 мкг / мкл | 3 мкг | 6 мкл |
| Трипсин, масс-спектрометрия класса (раунд 2) | Коммерческий раствор при 0,5 мкг / мкл | 1,5 мкг | 3 мкл |
| Трифтор-уксусную кислоту (ТФК) | 50% раствор в ВЭЖХ-класса водой | - | 2-5 мкл |
| Ацетонитрил (элюирование) | 60% раствор с 0,1% TFA в ВЭЖХ-сорт воды | - | 500 мкл |
| Ацетонитрил (восстановление) | 3% раствор с 0,1% TFA в ВЭЖХ-сорт воды | - | 100 мкл |
Рисунок 1. Схема экспериментальной процедуры. Принципиальная рабочий процесс в Protocoл до decellularize тканей (раздел 1), контролировать качество decellularization и оценить обогащение ECM (раздел 2) и переварить образцы белка ECM обогащенного до пептидов до масс-спектрометрического анализа (раздел 3).
Рисунок 2. Контроль качества процедуры decellularization помощью Вестерн-блоттинга Вестерн-блоттинг проводили на мышах легких (А) и карциномы молочной железы человека ксенотрансплантата (B) образцов с использованием следующих антител:. Кроличьей анти-актина (клон 14-1) и кроличьи антитела -β1 интегриновых антитела, вырабатываемые в нашей лаборатории; кролика против коллагена I, мыши анти-GAPDH и кролик анти-пан-гистоны антитела были из Millipore. После первичной инкубации антитела, мембраны промывали и инкубировали в присутствии ПХ-конъюгированного козьего антитела против кроличьего или козьего антитела против моуSE вторичным антителом Джексона Immunoresearch лаборатории. Наконец, мембраны промывали и инкубировали в Западной Lightning ™ Хемилюминесцентный реагент (PerkinElmer LAS). * Указывает минимальное остаточное загрязнение гистонов в ECM-богатых фракции. ** Указывает на частичную, истощение мономерной (предположительно несобранном) коллагена I в фракции CS. *** Указывает остаточное загрязнение актина в ECM-богатых фракции. Мазок обнаружены с анти-антитела коллагена представляет различные уровни пост-трансляционных модификаций (например, сшивание, гликозилирования).
Discussion
Изменения
Хотя мы использовали именно этот порядок, чтобы обогатить ECM от десяти тканей и типов опухолей 8 - 10, модификации протокола следует рассматривать в следующих случаях:
1) Обнаружение белков ЕСМ в промежуточных фракций.
Внеклеточного матрикса из различных тканей или типов опухолей могут отличаться по своей нерастворимости выделяемости /, как описано выше для фибронектина и ламининами. Например, считается, что ЕСМ фиброзных тканей или тканей ремоделирования переворачивает очень динамично и, таким образом, можно было бы наблюдать более высокую пропорцию белков ЕСМ в этих тканях, чтобы быть более легко экстрагируемые 12. В зависимости от фракции, в которых обнаружены белки ECM, мы предлагаем сокращения времени инкубации шаг вызывает извлечение белков ЕСМ или опуская этот шаг.
2) Detection значительной доли внутриклеточных компонентов в ECM обогащенного таблетки. В некоторых тканях или типах опухолей в отношение клеток: ECM особенно высокие (например, печени, селезенки, не десмопластической опухоли). В этом случае, значительное загрязнение ECM-фракции, обогащенной по внутриклеточных белков (в частности, белков цитоскелета и / или гистонов) можно наблюдать. Для истощению внутриклеточных белков эффективно, мы предлагаем повторяющиеся дважды инкубации в буфере М и / или буфера CS (как содержащих моющих средств, это, как правило, истощает обильные внутриклеточных белков). Другой альтернативой было бы использовать альтернативные буферы с более высокими концентрациями детергентов, с оговоркой, что это может привести к истощению относительно более растворимых белков ЕСМ, а также (смотрите следующий абзац).
3) Альтернатива использованием коммерческого набора.
Мы были не в состоянии, для собственных причин, чтобы получить точный состав буферов сюдам поставщика белка извлечения комплекта на отсеки. Тем не менее, мы включили в таблице 1 примечания, основанные на собственном опыте использования самодельных буферы с определенным моющим средством (NP-40, дезоксихолат натрия и SDS) концентраций проводить подобные экстракции. Недавнее исследование также подчеркнул важность рН decellularization буферов, чтобы сохранить ECM белков 13.
Ограничения метода
Способ, представленный здесь основана на том факте, что ECM белки обладают более высокой, чем у большинства нерастворимые внутриклеточные белки. Однако метод decellularization описано здесь, конечно, извлекает растворимые компоненты, присутствующие в ECM, такие как некоторые факторы роста или ECM ремоделирования ферментов. Несмотря на то, ECM-ассоциированных белков тесно связан с ECM белков были обнаружены протеомики в образцах, приготовленных, как описано, этот способ может быть слишком жесткими, чтобы полностью профиль состава matrisome ассоциированныхбелки.
Значение техники по отношению к другим методам
Преимущество метода, изложенного здесь, по сравнению с другими методами является то, что она может быть приспособлена к характеру ЕСМ интереса: промежуточные стадии могут быть опущены или повторяется, чтобы предотвратить потерю белков ЕСМ, либо увеличить истощение загрязняющих внутриклеточных белков, соответственно. Этот метод также использует только минимальные суммы моющих средств, которые смываются с целью предотвращения их вмешательства с последующим пептидный препарат и масс-спектрометрии. Наконец, способ, описанный здесь, чтобы переварить ECM богатых белковых препаратов в пептиды также имеет то преимущество, что они не требуют, чтобы белки быть растворимыми и могут быть проведены на «сырой» ECM обогащенного фракций.
Альтернативные методы, использующие decellularization хаотропы (например, гидрохлорид гуанидина) изучить состав ЕСМ по масс-спектрометрии были бееп сообщалось в литературе (обзор в 14) и были использованы в сочетании с масс-спектрометрией, чтобы характеризовать ECM состав хряща 15,16, сердце 17, молочной железы 18 и 19 и сосудистых клубочков 20 базальных мембран.
Рекомендации
Методы, использующие Decellularization трипсин, чтобы переварить из клетки не должны использоваться, если ЕСМ обогащены для последующих анализов протеомики, а трипсинизации приведет к частичному перевариванию ECM и потери ECM белков и пептидов. Аналогичным образом, если коллагеназы пищеварения должны были быть использованы, чтобы помочь нарушению тканей, то ему необходимо будет тщательно контролироваться, так как вызывает ECM пищеварение и потеря ECM белков и пептидов.
В-решения против в геле пищеварения? ECM белки сшиты и практически нерастворим и, даже когда ресуспендировали в буфере Лэммли 3x (содержащей 6% SDS) и 100 мМ DTT, отдельный пероральноOrly на SDS гелях. Таким образом, в геле пищеварения не является предпочтительным методом.
Будущие приложения
Стоит отметить, что, в то время здесь не обсуждается, в состав каждого из промежуточных фракций, собранных в ходе decellularization также может быть проанализирована с помощью масс-спектрометрии. Это может быть особенно ценным при изучении очень небольшие образцы (т.е. Человеческий биопсийный материал), или когда информация о желании других клеточных фракций.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
