Abstract
Den extracellulära matrix (ECM) är en komplex nätverket av tvärbundna proteiner som ger biofysikaliska och biokemiska signaler som är viktiga regulatorer av celltillväxt, överlevnad, migration, etc. ECM spelar en viktig roll i utvecklingen och i olika sjukdomar, inklusive hjärt-kärl och muskuloskeletala sjukdomar, fibros och cancer. Sålunda kunde karakterisera sammansättningen av ECM för normala och sjuka vävnader leda till identifiering av nya prognostiska och diagnostiska biomarkörer och potentiella nya terapeutiska mål. Men har mycket karaktär ECM-proteiner (stora storlek, tvärbundna och kovalent bundna, tungt glykosylerade) återges biokemiska analyser av ECM utmanande. För att övervinna denna utmaning har vi utvecklat en metod för att berika ECM från färska eller frysta vävnader och tumörer som drar nytta av olöslighet ECM-proteiner. Vi beskriver här i detalj decellularisering förfarande som består av sekventiellt incubations i buffertar med olika pH och salt och tvättmedelskoncentrationer och som resulterar i 1) utvinning av intracellulära (cytosoliskt, kärnkraft, membran och cytoskeletal) proteiner och 2) anrikning av ECM-proteiner. Vi beskriver sedan hur man deglycosylate och smälta ECM berikad proteinpreparat till peptider för efterföljande analys genom masspektrometri.
Introduction
Den extracellulära matrix (ECM) är en komplex nätverket av tvärbunden och glykosylerade proteiner som ger arkitektonisk stöd och förankring för celler och definieras delvis, vävnader "biomekaniska egenskaper 1,2. ECM-proteiner signalerar också till cellerna antingen direkt genom deras receptorer (t.ex. integriner, syndecans, etc.) eller genom att modulera tillväxtfaktor signalering 3. ECM tillhandahåller således biofysikaliska och biokemiska signaler som är stora regulatorer för cellulära processer såsom proliferation, överlevnad, polarisation, differentiering, migration, etc.
ECM spelar nyckelroller i fysiologi, utveckling och åldrande 4. Dessutom är flera sjukdomar, såsom hjärt-kärlsjukdomar, fibros, muskel- och skelettsjukdomar, cancer, som orsakas av, eller resultera i, ECM förändringar. Dessutom bidrar ECM till upprätthållandet av stamcells nischer och identifiera viktiga ECM-molekyler thpå stöd stemness kommer att ha direkt tillämpning i tissue engineering och regenerativ medicin 5. Men trots dess betydelse har ECM kvar, tills nyligen, underexplored 6.
I silico analys har visat att matrisome, definierad som ensemble av ECM och ECM-associerade proteiner, omfattar produkterna från flera hundra gener i både mänskliga och mus genomen 1,7,8. Emellertid har olöslighet av ECM-proteiner hindras systematisk karaktärisering av kompositionen in vivo extracellulära matriser av normala och patologiska prov. Vi visade nyligen att denna olöslighet kan vändas till en fördel och kan användas för att berika ECM-proteiner 8 - 10. Vi och andra visade vidare att masspektrometri var en metod för val för att karakterisera sammansättningen av ECM 8 - 10, 13.
Vibeskriver här en decellularisering förfarande som består av sekventiella inkubationer i buffertar med olika pH och salt och tvättmedelskoncentrationer. Denna procedur resulterar i utvinning (eller utarmning) av cytosola, kärnkraft, membran och cytoskelettproteiner och anrikningen av ECM-proteiner. Vi beskriver sedan hur man smälta ECM berikad proteinpreparat till peptider för efterföljande analys genom masspektrometri.
Under användning av procedurerna detaljerade och illustrerade här, har vi framgångsrikt berikas och kännetecknas av masspektrometri de extracellulära matriser från tio olika vävnader och tumörtyper: normal murin lunga 8, människa och mus kolon 8,9, human lever 9, humana kolorektala tumörer och härrör levermetastaser 9, melanom xenotransplantat 8, mammary tumörxenografter 10, murina pankreasöar och murina insulinom (Naba et al., opublicerade). Jämförelse av de olika matrisomes avslöjade vävnads- och tumörspecifika ECM signaturer som ytterligare skulle kunna användas som potentiella diagnostiska eller prognostiska biomarkörer.
Vi anser att detta förfarande kan tillämpas på andra prover med ingen eller relativt små modifieringar.
Protocol
OBS: Förfarandet kan utföras på färska eller snabbfrystes vävnader. Vi rekommenderar perfusion starkt vaskulariserade vävnader med PBS vid tidpunkten för dissekering för att eliminera röda blodkroppar och plasmaproteiner. Vi rekommenderar inte att utföra proceduren på fasta vävnader som fixering (dvs kemisk tvärbindning) stör decellularisering och kan också avsevärt äventyra efterföljande analys masspektrometri. För hela förfarandet, rekommenderar vi att du använder låg retention rör och pipettspetsar för att maximera protein och peptid återhämtning.
1. decellularisering av vävnader eller tumörer
OBS: Innan du börjar, förbereda reagenser och lägg proteashämmare (medföljer Fack Protein Extraction kit) till önskad volym av varje buffert. Alla buffertar och prover bör hållas på is under hela experimentet utom buffert CS som måste hållas vid RT för att förhindra SDS nederbörditation.
OBS: Protokollet använder en serie av inkubation i buffertar med olika pH och som innehåller olika mängder av salter och rengöringsmedel för att sekventiellt extrahera intracellulära proteiner och berikar för olösliga ECM-proteiner (Figur 1, Tabell 1, se även diskussion för alternativ till användningen av kommersiell kit detalj här). Volymerna av reagens som anges nedan är för 100 mg av vävnader eller tumörer (se tabell 1) och måste justeras på lämpligt sätt.
- Homogenisera 100 mg vävnad i 500 pl av Buffert C innehållande proteasinhibitorer med användning av en vävnadshomogenisator tills vävnaden är fullständigt upplöst och en homogen suspension erhålls.
OBS: Lägg deoxiribonukleas I (slutkoncentration: 200 mikrogram / ml, bereds enligt tillverkarens anvisningar) och ribonukleas A (slutlig koncentration: 20 mikrogram / ml, bereds enligt tillverkarens anvisningar) tillBuffert N. - Sekventiell extraktion av intracellulära lösliga proteiner
- Utvinning av cytosoliska proteiner. Inkubera homogenatet på ett rör rotator under 20 min vid 4 ° C. Spara en liten alikvot (10 | il till 20 pl) av homogenatet för efterföljande Western blot-analys (se Förväntade resultat sektion och figur 2).
- Centrifugera homogenatet vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Samla upp supernatanten i ett rent rör, kommer detta att utgöra cytosoliska (C) fraktion av Western blot-analys. Flash frysa denna fraktion och förvara vid -80 ° C.
- Att tvätta, återsuspendera pelleten i 400 | il buffert W innehållande proteasinhibitorer och inkubera provet på en tub rotator under 20 min vid 4 ° C. Centrifugera homogenatet vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten.
- För att extrahera, nukleära proteiner, resuspendera pelleten i 150 | il buffert N innehållande proteasinhibitorer, deoxyribonuclease I och ribonukleas A och inkubera provet på en tub rotator under 30 min vid 4 ° C.
- Centrifugera provet vid 16.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C och samla supernatanten i ett rent rör. Upprepa det här steget en gång: efter centrifugering av provet för andra gången, lägger supernatanten till föregående vätskan: detta kommer att utgöra kärn (N) del av Western blot-analys. Flash frysa denna fraktion och förvara vid -80 ° C. Sedan utför tvätt enligt steg 1.2.3.
- För att extrahera membranproteiner, återsuspendera pelleten i 100 | il buffert M innehållande proteasinhibitorer och inkubera provet på en tub rotator under 30 min vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 16.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C
- Samla upp supernatanten i ett rent rör: detta kommer att utgöra membranet (M) del av Western blot-analys. Flash frysa denna fraktion och förvara vid -80 ° C.
- För att extrahera cytoskelettproteiner, suspendera pelleten i 200 pl av Buffert CS innehållande proteasinhibitorer och inkubera provet på en tub rotator under 30 min vid RT.
Observera att pelleten inte fullt ut kommer att lösas upp. Vi föreslår att störa pelleten genom att pipettera upp och ner tills observera störning av pelleten. - Centrifugera provet vid 16.000 xg under 30 min vid RT. Samla upp supernatanten i ett rent rör. Notera vid denna punkt ytterligare en markant minskning av storleken av pelleten (se video).
- Återsuspendera pelleten i 150 | il buffert C innehållande proteasinhibitorer och inkubera provet på en tub rotator under 20 min vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
- Samla supernatanten och lägga till den i föregående vätskan: detta kommer att utgöra cytoskelettala (CS) del av Western blot-analys. Flash frysa denna fraktion och förvara vid -80 ° C.
- Utför ytterligare tvättar. Återsuspendera pelleten i 500 fil PBS innehållande proteasinhibitorer and inkubera provet på en tub rotator under 5 minuter vid 4 ° C. Centrifugera provet vid 16.000 xg under 5 min vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten. Upprepa detta steg tre gånger.
OBS: Alla spår av tvättmedel måste avlägsnas genom omfattande tvättar innan nedbrytning av proteinerna till peptider (se avsnitt 3). Vid denna punkt, kan ECM-anrikade pelleten vara blixtfrystes och hölls vid -80 ° C. Notera att storleken av pelleten kommer att bero på mängden av olösliga (ECM) proteiner i utgångsmaterialet och effektivitet decellulariseringen.
2. Övervakning av Kvaliteten på decellulariseringen / ECM Berikning av SDS-PAGE och Western Blöt
- Blanda 10-20 il portion av den totala vävnadsextrakt och 50 pl portioner av mellanliggande fraktioner med Laemmli buffert innehållande 100 mM DTT. Resuspendera ECM-anrikade, olöslig fraktion i 3x Laemmli buffert innehållande 100 mM DTT.
Obs: han förhöjda koncentrationerDTT och SDS bistå vid solubilisering av ECM-proteiner som är relativt olösliga. - Separera proteinerna genom SDS-PAGE och överfördes på nitrocellulosamembran.
- Utför immun-blottar med användning av antikroppar för att övervaka proteiner representant för envar av de cytosoliska, kärnkraft, membran, cytoskelettala och ECM fraktioner (se representativa resultat avsnitt, Tabell 2 och Figur 2).
3. I-lösning nedbrytning av proteiner till peptider för masspektrometri analys
OBS: Pelleten som erhölls efter decellularisering förfarandet och avlägsnande av SDS är höganrikat i olösliga ECM-proteiner för vidare analys med masspektrometri dessa proteiner måste brytas ned till peptider. Notera att, som en konsekvens av ECM-protein olöslighet, är det inte möjligt i detta steg för att mäta proteinkoncentrationen i provet. Vi erbjuder därför volymer av reagens för att smälta ECM-EnriCHED prover till peptider baserade på storleken (mm) eller torr vikt av ECM-anrikade pelleten (tabell 3). Lösningarna av ammoniumbikarbonat, urea, DTT, jodacetamid och trifluorättiksyra alla måste vara nygjord.
- Resuspendera ECM-anrikade provet genom tillsats av lämplig volym av 8 M karbamid till ECM-anrikade pelleten och tillsätt DTT vid en slutlig koncentration av 10 mM (se tabell 3). Inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 rpm under 2 h vid 37 ° C.
OBS: på denna punkt ECM-proteiner inte kommer att vara fullständigt upplöst och synligt stora proteinpartiklar bör inte kasseras genom centrifugering eller filtrering. Upphävandet kommer att klara på deglykosylering och matsmältning (se video). - Alkylering
- Förbered iodoacetamide lösningen i HPLC-kvalitet vatten. Får provet svalna till RT och tillsätt jodacetamid till en slutlig koncentration av 25 mM. För fullständig alkylering, DTT: ska jodoacetamid förhållandet vara mellan 1: 2.5 och 1: 3.
- Inkubera i mörker i 30 minuter vid RT.
- Deglykosylering:
Det behövs deglykosylering att avlägsna kolhydratsidokedjor som stör identifiering av peptider modifierade genom N-kopplad glykosylering: Anm.- Späd till 2 M urea med 100 mM ammoniumbikarbonat pH 8,0 och tillsätt en lämplig mängd av PNGasF (se tabell 3). Inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 rpm under 2 h vid 37 ° C.
- Digerering
- Lägg Lys-C och inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 rpm under 2 h vid 37 ° C. Tillsätt trypsin och inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 rpm O / N vid 37 ° C.
OBS: ECM rika suspensionen som började molnigt vid första beredning i 8M urea verkar klart efter O / N rötning (se video). - Lägg till en andra alikvot av trypsin till provet och inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 varv per minut under ytterligare 2 h vid 37 ° C. </ Li>
- Lägg Lys-C och inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 rpm under 2 h vid 37 ° C. Tillsätt trypsin och inkubera med kontinuerlig omrörning vid 1400 rpm O / N vid 37 ° C.
- Surgöring
- Vid slutförandet av matsmältningen, inaktivera trypsinet genom att surgöra provet med nyframställd 50% trifluor-ättiksyra (TFA). Provet bör nå pH <2. Vi föreslår tillsats 1-1,5 il 50% TFA vid en tid och med användning av en fil av peptidlösningen för att mäta pH för lösningen med användning av pH-papper (se video).
- Centrifugera den surgjorda provet vid 16.000 xg under 5 min vid RT. Samla supernatanten i en ren låg retentionsrör. Vid denna punkt, kan peptidlösningen förvaras vid -20 ° C.
- Avsaltning
Notera: att detta sista steget utförs vanligen vid en mass anläggning spektrometri enligt sina egna föredragna metoder.- Före proteomik analys, avsalta proverna och peptider eluerades med nyframställd 60% acetonitril, 0,1% trifluorättiksyra, följt av koncentration i en vakuum koncentrator. Resuspendera peptiderna i nyberedd 3% acetonitrile, 0,1% trifluorättiksyra 8.
OBS: att efter avsaltning, kan koncentrationen av peptidlösningen mätas genom spektrofotometri (se förväntade resultat avsnitt). - Nu analysera provet genom masspektrometri, återigen enligt de optimala förfaranden för mass anläggningen spektrometri.
OBS: Vi uppmuntrar forskare som är intresserade av att karakterisera sammansättningen av ECM med hjälp av masspektrometri för att hänvisa till våra övriga publikationer 8 - 10 och webbplats som ger ytterligare detaljerad förklaring, inklusive LC-MS / MS-parametrar, mass sökning spektrometridata för identifiering och uppgifter proteinanalys med hjälp av kisel matrisome anteckning verktyg vi utvecklat 8.
- Före proteomik analys, avsalta proverna och peptider eluerades med nyframställd 60% acetonitril, 0,1% trifluorättiksyra, följt av koncentration i en vakuum koncentrator. Resuspendera peptiderna i nyberedd 3% acetonitrile, 0,1% trifluorättiksyra 8.
Representative Results
Kvalitetskontroll av decellularisering förfarandet
Effektiviteten hos decellulariseringen kan övervakas genom att analysera innehållet i varje fraktion protein genom western blöt. Tabell 2 listar proteiner av diagnostiskt värde för att bedöma kvaliteten på decellulariseringen förfarandet. Figur 2A visar den effektiva utvinningen i mellan fraktioner av cytosoliskt (GAPDH ), nukleära (histoner), membran (β1 integrin) och cytoskelettala (aktin) proteiner, medan inga ECM-proteiner (kollagen I) detekteras i dessa fraktioner (Fig 2). I sin tur är den slutliga pelleten anrikade för ECM-proteiner och till stor del utarmat av intracellulära proteiner (Figur 2A). Figur 2B visar tillfredsställande intracellulärt protein utarmning (ingen histon detekteras i ECM-rika fraktionen), även om, aktin fortfarande kan detekteras i ECM-rik fraktion och utarmning av monomert kollagen I- Skenbar molekylvikt ~ 110 kd, presumptively motsvarar omonterad kollagen I - kan observeras i CS-fraktionen.
Vi har också rutinmässigt övervaka ytterligare ECM-proteiner, såsom fibronektin och laminin, även om i vissa vävnader dessa komponenter kan delvis solubiliseras i tidigare fraktionerna 8-10. Exempelvis fibronektin uppträder även som lösligt plasmafibronektin som inte är införlivad i ECM. Perfusion av vävnaden före extraktion reducerar plasmafibronektin koncentrationen men inte alltid eliminera den. I vissa vävnader är lamininer hittade löst associerade med cellytan eller ECM och extrahera i mellan fraktioner. Om detta inträffar kan det lösas genom att förändra utvinningsförhållanden (se diskussion).
Notera att anrikningen av ECM-proteiner och åtföljande utarmning av intracellulära komponenter är baserad på den relativa lösligheten av proteiner i de olika buffertarna. Thär skiljer sig mellan olika vävnader - i vissa fall histonerna och aktin är lättare utvinns än i andra. Observera också att, även om histoner förväntas tas ut i N-fraktionen (Figur 2B), ofta ser vi en mer komplett utarmning av histoner i M eller CS-fraktionen (Figur 2A och B).
Preliminär peptidkoncentration förväntas
Koncentrationen av peptidlösningen erhållen efter spjälkning, försurning och avsaltning kan mätas genom spektrofotometri antingen genom mätning av absorbansen av peptidlösningen med användning av 280 nm våglängd som motsvarar tryptofan, tyrosin, eller med användning av 205 nm våglängd som motsvarar absorbansen hos peptiden obligationer.
Vi mätte koncentrationen av peptidlösningar erhållna från decellularisering av tre murina lungor prover (82 mg, 100 mg och 100 mg, respektive) preparött parallellt och från varje: 424 ng / l, 450 ng / l, och 580 ng / l av peptider respektive.
Identifiering av ECM peptider genom masspektrometri
Masspektrometrisk analys av sammansättningen av ECM berikad proteinprover, framställda såsom beskrivs här, visade att> 70% av signalintensiteten motsvarar ECM och ECM-associerade proteiner 8-10.
Tabell 1. Volym av reagens från kompartment Extraction kit för att decellularize 100 mg (våt vikt) av vävnad eller tumör. Denna tabell visar sammansättningen och volymen av varje buffert som används för att genomföra decellularisering av 100 mg av vävnad eller tumör. En cocktail av proteasinhibitorer tillhandahålls som en 50x lösning och behöver läggas till varje buffert 2.
| Reagens från fack Protein Extraction Kit | Volymen för 100 mg av vävnad | Sammansättning (baserad på Millipore datablad cat # 2145 1) |
| Buffert C | 500 | il | HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, EDT 4, sackaros, glycerol, natriumortovanadat 5 |
| Buffert W | 400 | il | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sackaros, glycerol, natriumortovanadat |
| Buffert N | 150 | j, l x 2 | HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glycerol, natriumortovanadat |
| Buffert W | 400 | il | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sackaros, glycerol, natriumortovanadat |
| Buffert M | 100 | il | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCI, EDTA, sackaros, glycerol, Natriumdeoxikolat (DOC) 6, NP-40 6 |
| Buffert CS | 200 | il | PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sackaros, natriumdodecylsulfat (SDS) 7, natriumortovanadat |
| Buffert C | 150 | il | HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sackaros, glycerol, natriumortovanadat |
| 1 x PBS | 500 | j, l / tvätt | - |
Anmärkningar:
1 För egna skäl, kunde vi inte få den exakta sammansättningen av buffertarna från leverantören av utrustningen, men vi inkluderar här några anteckningar på grundval av vår egen erfarenhet av att använda hemmagjorda buffertar för att genomföra liknande extraktioner.
2 Proteashämmare: det är lämpligt att inkludera en mängd olika inhibitorer mot cystein, serin och treonin peptidaser, serin esteraser, divalenta katjoner beroende metalloproteinaser etc.Många kommersiellt tillgängliga cocktails proteashämmare finns.
3 pH över 7,0 är en effektiv hämmare av lysosomala proteaser.
4 EDTA (vanligtvis används vid 2 mM) är en effektiv inhibitor av divalenta katjoner beroende proteaser.
5 natriumortovanadat är en fosfatasinhibitor. En typisk effektiv koncentration skulle vara 0,5-5 mM.
6 NP40 på 0,1% -0,5% är tillräcklig för att lösa de membranlipider. Kombinationen av NP40 och DOC - ofta används vid lika koncentrationer (t.ex. 0,5% av vardera) - används ofta som en strängare utvinning som fortfarande lämnar många protein-proteininteraktioner intakt.
7 SDS är ett strängare jonisk detergent (CMC 0,1%). Den kan även användas i kombination med de andra två detergenter SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% som en intermediär stringens buffert.
Tabell 2. Diagnostiska proteiner tillövervaka kvaliteten på decellulariseringen förfarandet. Denna tabell visar exempel på proteiner som är egenskaperna för varje subcellulära fack (cytosolen, kärnan, plasmamembranet, cytoskelettet och ECM) som kan användas för att övervaka kvaliteten på decellularisering förfarandet och effektiviteten i ECM-anrikning.
| Intracellulärt | Diagnostiska Proteiner |
| Cytosoliska proteiner | Glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) |
| Nukleära proteiner | Histoner, laminer Nucleoporin |
| Membranproteiner | Integriner, transferrinreceptorn |
| Cytoskelettproteiner | Actin, tubulin, Vimentin |
| Basalmembran ECM-proteiner | Kollagen IV, Nidogens, Lamininer |
| Interstitial ECM-proteiner (interstitiell) | Kollagen I, kollagen III kollagen VI, fibronektin |
För rekommendation om antikroppar, se våra publikationer 8-10.
Tabell 3. Volym av reagens för att smälta ECM-berikade prover i peptider. Den här tabellen visar de reagenser som används för att resuspendera ECM berikad proteinprover och minska alkylat, deglycosylate och smälta proteiner prover till peptider före masspektrometrianalys.
| Reagens | Framställning | Slutlig koncentration / Belopp för 1 mm tjock pellet (~ 5-10 mg torrvikt) | Volym 1 mm tjock pellet (~ 5-10 mg torrvikt) |
| Ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) | 100 mM lösning i HPLC-kvalitet vatten | - | - |
| Urea | 8 M lösning i 100 mM ammoniumbikarbonat | 8 M | 50 | il |
| Ditiotreitol | Bered i HPLC-kvalitet vatten vid 500 mM | 10 mM | 1 il |
| Jodacetamid | Bered i HPLC-kvalitet vatten vid 500 mM | 25 mM | 2,5 ^ il |
| Peptid- N -Glycosidase F (PNGasF) | Kommersiell lösning vid 500 U / ^ il | 1000 U | 2 | il |
| Endoproteinas LysC, masspektrometri kvalitet | Bered i HPLC-kvalitet vatten vid 0,5 mikrogram / l | 1 ^ g | 2 | il |
| Trypsin, masspektrometri kvalitet (runt 1) | Kommersiell lösning vid 0,5 mikrogram / l | 3 ^ g | 6 | il |
| Trypsin, masspektrometri kvalitet (omgång 2) | Kommersiell lösning vid 0,5 mikrogram / l | 1,5 ^ g | 3 il |
| Trifluor-ättiksyra (TFA) | 50% lösning i HPLC-kvalitet vatten | - | 2-5 ^ il |
| Acetonitril (eluering) | 60% lösning med 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vatten | - | 500 | il |
| Acetonitril (beredning) | 3% lösning med 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vatten | - | 100 | il |
Figur 1. Scheme of den experimentella proceduren. Schematisk arbetsflöde av protocol att decellularize vävnader (§ 1), kontrollera kvaliteten på decellularisering och utvärdera ECM anrikningen (avsnitt 2) och smälta ECM berikad proteinprover till peptider före masspektrometrianalys (§ 3).
Figur 2. Kvalitetskontroll av decellularisering förfarandet genom western blöt Western blöts utfördes på murin lunga (A) och humant bröstkarcinom-xenotransplantat (B) prover med användning av följande antikroppar:. Kanin-anti-aktin (klon 14-1) och kanin-anti -β1 grin antikroppar producerade i vårt laboratorium; kanin anti-kollagen I, mus anti-GAPDH och kanin anti-pan-histoner antikroppar var från Millipore. Efter primär antikropp inkubation tvättades membranen och inkuberades i närvaro av HRP-konjugerad get anti-kanin eller get-anti-mouse sekundär antikropp från Jackson ImmunoResearch Laboratory. Slutligen tvättades membranen och inkuberades i västra Blixt ™ Kemiluminiscens reagens (PerkinElmer LAS). * Indikerar minimal kvarvarande kontaminering av ECM-fraktion histon. ** Indikerar partiell utarmning av monomer (presumtivt omonterad) kollagen jag i CS-fraktionen. *** Anger kvarvarande kontaminering av ECM-fraktion aktin. Utstryket detekterades med anti-kollagen-antikropp representerar olika nivåer av posttranslationella modifikationer (t.ex., tvärbindning, glykosylering).
Discussion
Modifieringar
Även om vi användes denna specifika procedur för att berika ECM från tio vävnader och tumörtyper 8 - 10, bör ändringar av protokollet anses i följande fall:
1) Detektion av ECM-proteiner i de mellanliggande fraktionerna.
Extracellulära matriser från olika vävnader eller tumörtyper kan skilja sig i deras extraherbarhet / olöslighet, som diskuterats ovan för fibronektin och lamininer. Till exempel, är det tänkt att ECM av fibrotiska vävnader eller ombyggnad vävnader omsätter mycket dynamiskt och därmed kan man observera en högre andel av ECM-proteiner i dessa vävnader att bli lättare kan extraheras 12. Beroende på den del där ECM-proteiner detekteras, föreslår vi att minska inkubationstiden för steg orsakar utvinning av ECM-proteiner eller utelämna det steget.
2) Detection av en betydande andel av intracellulära komponenter i ECM-anrikade pelleten. I vissa vävnader eller tumörtyper förhållande celler: ECM är särskilt höga (t.ex. lever, mjälte, icke-desmoplastic tumörer). I det fallet kan observeras en betydande förorening av ECM-anrikade fraktionen genom intracellulära proteiner (särskilt cytoskelettproteiner och / eller histoner). För att utarma intracellulära proteiner effektivt föreslår vi upprepade gånger inkubation i buffert M och / eller buffert CS (båda innehåller tvättmedel, detta utarmar vanligtvis rikliga intracellulära proteiner). Ett annat alternativ skulle vara att använda alternativa buffertar med högre koncentrationer tvättmedels, med förbehållet att detta kan leda till utarmning av relativt mer lösliga ECM-proteiner samt (se nästa stycke).
3) Alternativ till användning av ett kommersiellt kit.
Vi kunde inte, för farmaceutiska skäl, för att erhålla den exakta sammansättningen av buffertarna from leverantören av compartmental Protein Extraction kit. Men vi har i tabell 1 noter på grundval av vår egen erfarenhet av att använda hemmagjorda buffertar med definierade tvättmedel (NP-40, natriumdeoxikolat och SDS) koncentrationer att genomföra liknande extraktioner. En nyligen genomförd studie betonade också vikten av att pH-värdet i decellularisering buffertar för att behålla ECM-proteiner 13.
Begränsningar av tekniken
Den metod som presenteras här förlitar sig på det faktum att ECM-proteiner är i sig själva mer olösliga än de flesta intracellulära proteiner. Men beskrev decellularisering metoden här verkligen extraherar lösliga komponenter som finns inom ECM, såsom vissa tillväxtfaktorer eller ECM-ombyggnad enzymer. Även om ECM associerade proteiner tätt bundna till ECM-proteiner detekterades genom proteomik i prover framställda såsom beskrivits, kan denna metod vara alltför stränga för att profilera fullt sammansättningen av matrisome associeradeproteiner.
Betydelsen av tekniken med avseende på andra metoder
Fördelen med den metod som presenteras här jämfört med andra metoder är att den kan anpassas till arten av ECM av intresse: mellanliggande steg kan uteslutas eller upprepas för att förhindra förlust av ECM-proteiner eller öka förbrukningen av kontaminerande intracellulära proteiner respektive. Denna metod även använder endast minimala mängder av detergenter som sköljs av för att förhindra deras interferens med efterföljande peptidberedning och masspektrometri. Slutligen har den metod som beskrivs här för att smälta ECM rika proteinberedningar till peptider också fördelen av att inte kräva proteiner vara löslig och kan utföras på "råa" ECM-anrikade fraktioner.
Alternativa decellularisering metoder som utnyttjar kaotroper (såsom guanidinhydroklorid) att studera sammansättningen av ECM genom masspektrometri har been rapporterats i litteraturen (översikt i 14) och har använts i kombination med masspektrometri för att karakterisera ECM sammansättning brosk 15,16, hjärta 17, bröstkörtel 18 och vaskulära 19 och glomerulära 20 basalmembran.
Rekommendationer
Decellularisering metoder som använder trypsin att smälta ut celler bör inte användas om ECM anrikas för efterföljande proteomik analyser trypsinering kommer att resultera i partiell ECM nedbrytning och förlust av ECM-proteiner och peptider. Likaså om kollagenasspjälkning skulle användas för att underlätta avbrott vävnad, skulle det måste övervakas noga eftersom det orsakar ECM nedbrytning och förlust av ECM-proteiner och peptider.
I-lösning kontra in-gel matsmältningen? ECM-proteiner är tvärbundna och mycket olösliga och, även när återsuspenderades i 3x Laemmli-buffert (innehållande 6% SDS) och 100 mM DTT, separat poorly på SDS-geler. Således in-gel digestion är inte en föredragen metod.
Framtida tillämpningar
Det är värt att notera att även om de inte diskuteras här, sammansättningen av vart och ett av de mellanliggande fraktionerna som samlats in under decellulariseringen skulle också kunna analyseras med masspektrometri. Detta kan vara särskilt värdefullt när man studerar mycket små prover (dvs. mänskliga biopsier) eller när information önskas på andra cellulära fraktioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | |
| Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | |
| HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | |
| Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | |
| Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | |
| Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | |
| Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 |
References
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
- Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).
- Wilson, R. The extracellular matrix: an underexplored but important proteome. Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).
- Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories. Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).
- Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver. BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, e01308 (2014).
- Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. Defining the extracellular matrix using proteomics. Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).
- Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage. Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In. Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).
- Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage. Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Lennon, R., Byron, A., et al. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).
