Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar

doi: 10.3791/53058 Published: September 5, 2015

ERRATUM NOTICE

Protocol

Bu çalışma sıkı Heinrich-Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya kurumsal kurallarına uygun, hem de Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi (86/609 / EEC) yürütülmüştür. (: Ø52 / 05 kurumsal hareket sayısı) Tüm deneyler Heinrich-Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya Hayvan Bakım ve Kullanım Tesisi'nde Hayvan Refahı Ofisi tarafından tebliğ ve onaylanmıştır. Alman Hayvan Refahı Yasası uyarınca (Tierschutzgesetz, Madde 4 ve 7), beyin dokusunun ölüm sonrası çıkarılması için resmi ek onay gerekliydi.

Çift namlulu iyon seçici Mikroelektrotlardaki hazırlanması 1.

  1. Filament iki borosilikat cam kılcal hazırlayın: 7,5 cm uzunluğunda ve 1,5 mm arasında bir dış çapa sahip bir 6,5 cm'lik bir uzunluk ve daha sonra 1.0 mm'lik bir dış çapı olan iyona duyarlı bir varil için kullanılır ve bir edilmesi Referans varil.
  2. Capil temizleyin Daha sonra 12 saat ve aseton içinde laries abs ile birkaç kez yıkayın. etanol ve kurumaya bırakın. Elektrotlar hemen kurutucuda saklanabilir.
  3. Her iki uçta da birlikte uzun ve kısa bir kılcal düzeltmek için iki-bileşenli yapıştırıcı ya da alüminyum folyo küçük şerit kullanın. 1 saat süre ile 60 ° C'de bir fırın içinde çift kılcal ısıtın. Bu kür sürecini hızlandırır. Desikatörde şimdi elektrotlar saklayın.
  4. Bir dönebilir mandren ile dikey çektirmenin içine çift kılcal ortalayın. Cam 180 ° dönebilir aynasının yatay dönmesine izin verecek kadar yumuşak olana kadar yavaşça bobin ısıtın. Bu adım sırasında, ayna altında takoz kılcal uzama engeller.
  5. Soğuduktan sonra, mekanik mola kaldırmak ve iki sivri, çift namlulu kılcal damarlar (Şekil 1) sonuçlanan kılcal çekin ikinci bir ısıtma protokolü uygulayın. Tek, çift kılcal uç çapı 1 mm yakın olmalıdır.
ve_content "> Figür 1
Şekil iyon seçici Mikroelektronlar 1. Mimarlık. Bir çift namlulu mikroelektrot (A) Fotoğraf. Gösterim amacıyla ve daha iyi görüş için, referans varil içindeki sıvı renkli oldu. Konsantrik mikroelektrot ve karşılık gelen bir referans elektrot (B) fotoğrafı. Konsantrik mikroelektrot ucu onun solunda büyütülmüş gösterilmektedir. (A) ve (B), pipet uçları iyon sensörü tarafından işgal sonrası renkli olduğunu. En altta, hem elektrot tipleri ucu düzenlemesi şematik olarak gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Dönebilir mandren ile dikey çektirmenin mevcut değilse, bir çift namlulu iyon seçimini hazırlamakteta camını kullanarak yatay çektirmenin tive mikroelektrot.
    1. Bu amaçla, teta camı, iki varil her biri iki elektrot ile sonuçlanması (1.5 mm, uzunluk: 7.5 cm, dış çapı) çekin. Bunlardan birini işaretleyin gelecekteki referans varil olarak hizmet vermektedir. Gelecekteki iyon seçici varil olarak hizmet etmek için, aşağıda tarif edilen prosedüre benzer silanize.
      NOT: Çift namlulu teta-cam elektrotların hazırlanması bükülmüş çift namlulu elektrotların hazırlanması çok daha kolay iken, aralarında ince ayırıcı cam duvar gözenekli olma eğilimi gibi, her ikisi de varil arasında çapraz eylem daha yatkındır ellerinden geleni ipucu.
      Not: Sensör kokteyli (aşağıya bakınız), hidrofobik olduğu için, daha sonra, iyona duyarlı bir haznenin iç yüzeyi silanizasyon adı verilen bir işlem ile hem de hidrofobik hale gerekir. Bir sonraki aşamada tarif edildiği gibi, bu için, heksametildisilazan (HMDS) (Şekil 2) kullanılmaktadır.

"Şekil Şekil 2. pipetler Silanizasyon, (A). Heksametildisilazan (HMDS) iç cam yüzeyinin Si-OH grupları ile reaksiyona giren ve hidrofobik sayılmaktadır. (B) sol fotoğraf, tüm silanizasyon birimini göstermektedir. HMDS 'yi ihtiva eden bir geniş ağız şişe 40 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirilir. Şişenin üzerine, kılcal (Cap) taşıyan bir taşıyıcı (PH) monte edilir. Sağ fotoğraf kılcal (Cap) taşıyan pipet tutucu (PH) büyütülmüş bir halini göstermektedir. (C) Geniş ağız şişe üzerine monte edilmiş olarak çift namlulu (sol) veya konsantrik (sağ) kılcal damarlar (Cap) için ısmarlama pipet sahipleri (PH) şematik yan görünüm. Daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.

  1. Sadece pu öncedolum elektrotlar yakl. Geniş ağızlı şişeye 20 ml HMDS. Dikkat: HMDS sadece davlumbaz kullanım içindir, buharlar sağlığa zararlı! Şişe kapatın ve 40 ° C'ye kadar bir ısıtma plakası üzerine bir ön ayar koydu. 200 ° C'ye kadar, hem de başlık altına yerleştirilmiş olan bir fırını, önceden ısıtın.
  2. Aşağıdaki prosedür sırasında silanizasyondan bilmek damıtılmış su ile ucu referans varil kadar doldurun.
  3. Özel, ısmarlama tutucu (Şekil 2B, 2C) üzerine ucu kadar olan çift namlulu kılcal koyun. Künt open end tutucu (Şekil 2C, sol) altından geçerek serbestçe ulaşması gerekir. Daha sonra, 70 dakika için önceden ısıtılmış HMDS 'yi ihtiva eden geniş ağızlı bir şişe üzerine bu tutucu yerleştirin.
    NOT: HMDS buharı serbestçe kılcal damarlar yoluyla akabilir emin olun. Tek silanizasyon sürecinde HMDS'nin 20 ml tamamen buharlaşması yoktur ve şişe böylece birden çok kez kullanılabilir.
  4. Afterwards, iki saat boyunca ısıtılmış fırının metal stand ve içine kılcal aktarın. Bu, her iki varil kurur.
  5. Silanizasyon sonra kullanıma kadar kuru kılcal tutun. Eski işlem toplam olarak yaklaşık 3,5 saat gerektirir, elektrotlar şimdi birkaç hafta içinde bir desikatör içinde saklanabilir.
  6. Deneysel kullanım gününde, iyon seçici sensör (Şekil 1A) 1-2 ul silanize namlu ucu doldurarak iyon seçici elektrotlar hazırlar. Potasyum duyarlı Mikroelektronlar için, taşıyıcı Valinomycin kullanımı; ve sodyum duyarlı mikro elektrod taşıyıcı olarak ETH 157 kullanır.
  7. Ucu düzgün doldurmak için iyon seçici sensör zor yapmak oldukça viskoz olduğunu gözlemleyin.
  8. HEPES-tamponlu tuzlu su ile bir referans varil doldurun (aşağıya bakınız).
    NOT: Diğer, daha basit izo-ozmotik bir tuz da kullanılabilir olsa da, bir tuzlu su kullanmayı tercih bileşimi esas olarak benzerperfüzyon serum fizyolojik (ACSF, 3.6 bkz.), dışarı sızıntı ve deneyler sırasında dokuya nüfuz edebilir çünkü. Bu nedenle, bu tuz iyonu daha yüksek bir konsantrasyonu kullanılabilir ACSF daha belirlenecek içermediğini de gereklidir.
  9. Iyonunun yüksek bir konsantrasyon tespit ihtiva tuzlu su ile sensör Dolgu. Böylece, (sodyum duyarlı Mikroelektronlar için) 100 mMNaCl tuzlu su ya da (potasyum duyarlı Mikroelektronlar için) 100 mM KCl ile sensörü dolduramaz. Bu işlem sırasında ilave hava kabarcıkları eklemek için emin olun.
  10. Silanizasyon başarılı oldu ve sensör düzgün dolu ise, dolgu (Şekil 1A) karşı açıkça görülebilen içbükey yüzeyi oluşturan sensör yüzeyini gözlemlemek. Aksi takdirde, sensör kapiller duvarından geri olabilir ve ucu dolu olmayacak. Bu gibi elektrotlar, işlevsel olmayacaktır.
  11. (Her iki varil içine klorlu gümüş teller takın sen dokunmamaya dikkatsor) ve) diş balmumu (Şekil 1A her varil mühür.

2. Konsantrik Hazırlanması Ion seçici Mikroelektronlar

  1. Dış kovanın için, filamanın (dış çapı 2,0 mm) ve 7.5 sm arasında bir uzunluğa sahip ince çeperli bir cam kılcal kullanımı. Iç hazne için, filament ile 1,2 mm arasında bir dış çapa ve 10 cm'lik bir uzunluğa ince duvarlı kılcal alır.
  2. 12 saat süre ile, aseton içinde kılcal temizleyin. ve daha sonra abs ile birkaç kez yıkayın. etanol ve kurumaya bırakın. Elektrotlar hemen kurutucuda saklanabilir.
  3. Yaklaşık doldurun. Geniş ağızlı şişeye 20 ml HMDS. DİKKAT! HMDS sadece bir davlumbaz kullanmak içindir, buharlar sağlığa zararlıdır. Şişe kapatın ve 40 ° C'ye kadar bir ısıtma plakası üzerine bir ön ayar koydu. 200 ° C'ye kadar, hem de başlık altına yerleştirilmiş olan bir fırını, önceden ısıtın.
  4. Yatay çektirmesi içine 2,0 mm kılcal yerleştirin ve kısa daralan ve uç Diame ile kılcal damarlar sonuçlanması çekin~ 4 um (Şekil 1B) ter.
  5. Bir ısmarlama, özel tutucu (Şekil 2B, Şekil 2C) onun künt ucu (sağ, Şekil 2C) şişenin boşluğuna açılır, böylece üzerine ucu kadar birlikte çekti-out 2,0 mm kılcal koyun. Daha sonra 70 dakika boyunca önceden ısıtılmış HMDS 'yi ihtiva eden geniş ağızlı bir şişe üzerine bu tutucu yerleştirin. HMDS buharı tüm kılcal damarlar akmaya emin olun.
  6. Daha sonra, iki saat boyunca ısıtılmış fırının metal stand ve içine kılcal aktarın.
  7. Silanizasyon sonra kullanıma kadar kuru kılcal tutun. Eski usul toplamda yaklaşık 3,5 saat gerektirirken, şimdi birkaç hafta için bir desikatörde elektrotlar saklayın.
  8. Kullanımdan hemen önce, silanize kılcal (Şekil 1B) içine sensör (0,2 ul) bir miktar dolgu.
  9. İç kılcal hazırlamak için, çektirmenin içine küçük çaplı kılcal yerleştirin ve iki sonuçlanması çekinUzun daralan ve keskin uçları (Şekil 1B) ile kılcal damarlar. 100 mM NaCl (sodyum duyarlı Mikroelektronlar) ya da 100 mM KCl (potasyum duyarlı Mikroelektronlar) tuzlu su ile doldurun.
  10. Sensörü dolu ve lamelleri yapılan özel bir yapı stoper üzerine birbirleri ile paralel olarak, doğrudan tuzlu dolu kılcal yerleştirin. Büyük kılcal içine küçük kılcal kısa bir şekilde yerleştirin.
  11. Modelleme kil kullanarak başka lamel üzerine kılcal Fix mikroskop aşamasında transfer ve 100x büyütme kullanarak görselleştirmek. Kendi ipuçları arasındaki mesafe yaklaşık 5 mikron (Şekil 1B) kadar bir mikromanipülatör ve mikroskop aşamasında ince sürücü çevirerek monte edilmiş bir cam çubuk yardımıyla, yavaş yavaş iç kapiller üzerinde dış kılcal ilerlemek.
  12. Diş balmumu kullanarak iç kılcal üzerine dış kılcal açık ucunu sabitleyin. Alternatif olarak, siyanoakrilat küçük bir damla (Crazy Tutkal) ins uygulamakbalmumu tead.
    NOT: küçük bir su damlasının eklenmesi tutkal polimerize ve yerinde elektrotları çözecektir. İç varil içine klorlu gümüş tel takın ve diş mumu (Şekil 1B) ile mühür.
  13. Referans elektrot hazırlamak için, filamanın ile 7.5 cm uzunluğunda kılcal ve 1.5 mm dış çapı almak ve dikey çektirmenin ile çekin. Ipuçları oldukça uzun ama (uç çapı ~ 1 mikron) değil çok keskin olduğundan emin olun.
  14. Üst pipet atın alt mandreni açın ve yaklaşık 5 mm alt pipet kaldırın. Tekrar Chuck kapatın ve ısıtma bobini üzerinde 5 mm ilgili konumlandırılmış alt elektrotun ucu kadar kaldırın. Bobin ısıtın ve yaklaşık 45 ° tarafa tarafından ucu bükmek için forseps kullanabilir. Alt pipet yaklaşık 1-2 mm. Bend yine yaklaşık -45 ° ana mil (Şekil 1B) geri paralel olarak ucu doğrudan. Bu prosedür refere ucunun yakınında konumlandırılmasını mümkün kılmak için gerekli olankonsantrik elektrot nce elektrot.
  15. HEPES-tamponlu tuz (aşağıya bakınız) ile referans namlu doldurun, klorlu gümüş tel takmak ve diş mumu (Şekil 1B) ile namlu mühür.

3. Salines

  1. 100 mM KCl oluşan potasyum duyarlı elektrotlar (1.15 bkz.) Ve dolgusu için tuzlu su hazırlayın. Sodyum-duyarlı elektrot dolgusu Salin, 100 mM NaCl oluşmaktadır.
  2. , 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgSO 4, 1,25 NaH 2 PO 4 ve 25 HEPES titre: (. 1.16 bakınız, HEPES-tamponlu tuzlu su), bir referans varil dolgusu tuzlu su hazırlama (mM olarak) oluşmaktadır NaOH ile 7.4 arasında bir pH değerine neden olduğu.
  3. 25 mM HEPES oluşan potasyum duyarlı elektrotlar kalibrasyon ve 150 mM NaCI ve KCI toplam tuz hazırlama, pH NMDG-OH (N-metil-D-glukamin) ile 7.4'e ayarlanmıştır. Burada, kalibrasyon salines 1, 2, 4 ya da 10 mM ihtiva eden ile gerçekleştirilmiştirKCI; ACSF 2.5 mM KCI (Şekil 5) ihtiva etmiştir.
  4. Sodyum duyarlı elektrotlar aşağıdaki gibi kalibrasyonu için tuzlu su hazırlayın; 25 HEPES, 3 KCI, NMDG-OH ile 7.4'e ayarlanmıştır 160 NaCI ve NMDG-Cl, pH toplam (mM olarak). 70, 100, 130 ya da 160 NaCl (mM olarak) serum fizyolojik ile kalibrasyon yapın; ACSF 152 NaCl (Şekil 6) içeriyordu.
  5. Diğer iyonlar ile sensör, çapraz reaksiyonunun belirlenmesi için, örneğin., PH, sabit bir iyon konsantrasyonlarına sahip ek bir kalibrasyon Salines, ancak farklı pH hazırlar.
    NOT: Bu prosedür, mevcut çalışmada ortaya konamamış olsa da, bu sorunu (örneğin 11,12) adresleme önceki çalışmaları başvurmalıdır lütfen.
  6. % 95 O 2 ve 5, kabarmış 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 ve 20 glükoz: (mM olarak) oluşan tuz akut beyin dokusu dilimleri hazırlamak bir pH elde% CO2,7,4.
  7. 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 ve 20 glukoz, 95 ile fokurdatıldı: (mM olarak) oluşan yapay serebrospinal sıvı (ACSF) içerisinde beyin dilimleri deneyleri gerçekleştirmek 7.4 bir pH ortaya% O 2 ve% 5 CO2,.
  8. Nöron ve glial hücrelerin uyarılması için, ACSF içinde çözülmüş 0.2, 0.3, 0.4 ya da 0.5 mM glutamat ya da 10 mM L-aspartat içeren çözeltiler hazırlayın. Basınç uygulama için, HEPES-tamponlu tuzlu su içinde 10 mM glutamat çözülür.
  9. Basınç uygulaması için başvuru pipet hazırlayın. Filaman (dış çap 2.0 mm) ve yatay çektirmenin halinde 7,5 sm bir uzunluğa sahip ince çeperli bir cam kılcal yerleştirin ve ~ 1 uM bir uç çapı sonuçlanması çekin.
  10. Epileptiform aktivitesinin uyarılması için, 10 uM, bicuculline metiyodid içeren magnezyum içermeyen ACSF hazırlar.
  11. Aksiyon potansiyellerinin üretimini inhibe etmek için, bir 10 mM stok solut hazırlanmasıtetrodotoksin iyon damıtılmış su içinde (TTX). Deneyler sırasında, TTX şirketinden 0.5 uM'lik bir son konsantrasyon oluşturmak üzere ACSF eklenir.
  12. AMPA-reseptörlerinin aktivasyonunu önlemek için, siyano-nitrokuinoksalin-dion, dimetil sülfoksitte (CNKX) (DMSO) içindeki bir 50 mM stok solüsyonu hazırlanır. Deneyler sırasında, bu doğrudan 100 uM'lik bir son konsantrasyon elde sonuçlanması ACSF eklenir.
  13. NMDA reseptörlerinin aktivasyonunu bloke etmek için, 70 mM NaHCO 3 amino-phosphonopentanoate (APV) içindeki bir 50 mM stok solüsyonu hazırlanır. Deneyler sırasında, bu doğrudan 100 uM'lik bir son konsantrasyon elde sonuçlanması ACSF eklenir.

İyon seçici Mikroelektrotlardaki 4. Kalibrasyon

  1. Doğrudan öncesi ve her bir deney sonrası iyon seçici mikroelektrot kalibre.
  2. (Mikromanipülatörler elektrotları takın ve stereo mikroskop altında yerleştirilmiş bir ACSF-perfüze deneysel odasına, içine ekleyebilirsiniz Şekil 3 g> 4). Ön odacık (Şekil 4A, B) referans elektrot yerleştirin. Banyo perfüzyon açın akış yaklaşık 2 ml / dk olduğundan emin olun.

Şekil 3,
Şekil 3. Deneysel bir çalışma alanı. Kayıt teçhizat deneysel hamamı, mikromanipülatörler ve kaliteli optik bir stereo x / y-translasyonel sahne taşıyan bir titreşim sönümlü tablo oluşur. Stereo mikroskop da dokümantasyon amaçlı bir CCD kamera ile donatılmıştır. Buna ek olarak, fokal ilaç uygulaması için bir basınç uygulama cihazı kullanılır. Kayıt elektrotları, bir diferansiyel yükseltecin kafa kademesi yoluyla birleştirilir. Sayısallaştırılmış veriler (A / D dönüştürücü) bir bilgisayar ile kaydedilir. Banyo perfüzyonu bir peristaltik pompa ile mikro gerçekleştirilmiştir (gösterilmemiştir).> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Kayıt yazılımı A / D dönüştürücüsü, diferansiyel amplifikatör ve bilgisayarda geçin ve başlangıç ​​(Şekil 3, 4). İyon duyarlı varil direnci çok yüksek olduğundan (10-20 GΩ; aşağıya bakınız), yüksek giriş empedansına sahip özel bir elektrometre amplifikatörü kullanın (= 10 TΩ R) ve küçük bir önyargı akımı (I önyargı = 50 FA - 1 pA).

Şekil 4,
Şekil 4. Elektronik ve kurmak deneysel mekansal tasarım. (A) kayıt düzenlemesinin şematik görünümü. Iki namlulu bir mikroelektrot (mavi) ve bir eş-mikro-elektrot (kırmızı) uçları tuzlu su ile doldurulur deneysel banyosunda düzenlenmiştir. Banyo referans elektrot şematik gösterilir. Poten Referans varil oysa (V 2) Sadece V ref tespit iyon seçici varil (V 1) elektrik alanı potansiyel (V ref) ve iyon potansiyeli (V iyon) oluşmaktadır tespit TIAL. V iyonu izole edilmesi için, V ref bir diferansiyel yükselteç (DA) ile V 1 çıkartılır. Yerinde bir konsantrik mikroelektrot ile deneysel aşamada (B) Topoğrafya. Deneysel aşamada merkez dilim hazırlık içeren deneysel hamamdan oluşmaktadır. Banyo toprağa, referans banyo elektrot da perfüzyon girişini barındıran öncesi odasında batık. Sahne kendisi ayrı bir toprak konnektörü ile topraklanır. Konsantrik mikroelektrot ve referans elektrot mikromanipülatörler tarafından yönlendirilen ayrı pipet sahipleri tarafından yürütülmektedir. Mikroelektrod ve referans elektrotu, elektronik yükselticinin baş aşamasında birleştirilir.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Diferansiyel amplifikatör (Şekil 4) başkanı aşamasında ilgili girişlerine klorlu gümüş teller bağlayın. Elektrot dirençlerini belirleyiniz. Referans varil direnci 30-100 M? Ve iyon-duyarlı varil direnci 10-20 GΩ arasında arasında olduğundan emin olun.
  2. Sıfıra gerilim sinyallerini ayarlayın ve kaydetmeye başlayın.
  3. Referans varil ise iyon seçici varil (V 1) elektriksel alan potansiyel (V ref) oluşur ve iyon potansiyeli (V iyonu) tarafından tespit edilen potansiyel (V 2) Sadece V ref tespit unutmayın. V iyonu izole edilmesi için, V ref bir diferansiyel yükselteç (DA) (Şekil 4A) vasıtası ile V 1 çıkartılır.
  4. Istikrarlı bir temel elde ettikten sonra,iyon tanımlanan konsantrasyonları içeren kalibrasyon salines geçiş ölçülecek.
    NOT: Şekil 5A bir çift namlulu potasyum duyarlı mikroelektrot kalibrasyonunu gösterir. Şekil 6A, kalibrasyon her iki çift namlulu bir de konsantrik Na + -duyarlı mikroelektrot gösterildiği gibidir. Burada prosedürü tarif yok ederken, diğer iyonları ile olası müdahaleler belirli bir iyonoforu kullanmadan önce test edilmesi gerektiğini unutmayın (ayrıca 3.4 bkz.).

Şekil 5,
Şekil 5. çift namlulu potasyum seçici Mikroelektronlar Kalibrasyon. (A) referans varil (V ref) voltajı Değişim ve tepki K + -potansiyel (V K +) banyo K + konsantrasyonu değişikliklere ( [K +] b) gösterildiği gibi. (B) YarımV K + karşı b [K +] ve -logarithmic arsa. Verilerin doğrusal bir arsa yaklaşık 56 mV bir eğim göstermektedir. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtresi (genişlik 20) ile düzeltti bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Iyon konsantrasyonu bilinen bir değişikliğe yanıt olarak iyon seçici kovanın gerilim tepkisi belirler. Arsa, tek bir logaritmik arsa verileri (Şekil 5B, 6B) ve eğim belirler. İdeal sensör Nernst denklemi ile tanımlanan bir ilişki izler (örneğin 13 bakınız):

Denklem 1
V: elektrot potansiyeli ölçülür;
V 0: standart elektrot potansiyeli, AgCl telli örneğin 298,15 K sıcaklık ve 101,325 kPa kısmi basınçta (mutlak)
T: (Kelvin) mutlak sıcaklık
z: iyon üzerindeki yük (+ 1 potasyum ve sodyum için)
F: Faraday sabiti (96,500 coulomb)
c ': hücre dışı iyon konsantrasyonu
c ': hücre içi iyon konsantrasyonu

Pratik amaçlar ve doğal logaritma için verilen bir iyon ve sıcaklık için geçerli hale gelir Nernst yamaç s dönüştürülür:

Denklem 2
NOT: Potasyum ve sodyum elektrotlar için, sensör ideal gerilim tepkisi böylece oda sıcaklığında yaklaşık -58 mV doğrusal eğim sergilemektedir. Bu sapmalar (Şekil 5B, 6B) kabul edilebilir. Bu, belirli bir elektrodun tepki özellikleri önce ve deneyden sonra (en fazla% 10, aşağıya bakınız) anlamlı bir değişiklik yoktur, ancak, esastır.

Şekil 6, . Şekil 6. sodyum-seçici Mikroelektronlar ve (A) Üst izleri çift namlulu konsantrik elektrotlar ile karşılaştırılması Kalibrasyon: bir çift namlulu elektrodun referans varil (V ref) voltajı Değişim (siyah noktalı iz) ve Banyo, Na + konsantrasyonundaki değişimlere tepki olarak konsantrik bir elektrot (gri iz) ([Na +] + b) gösterildiği gibi. Her iki elektrot voltaj tepkileri hemen hemen aynı olduğuna dikkat edin. Alt izleri: iki namlulu bir elektrot (siyah iz) ve [Na +]; b değişikliklere karşılık olarak bir eş-elektrot (gri iz) Na + -potansiyel (V Na +) gerilim değişiklikler. Her iki elektrot V Na + karşısında B (b) [Na +], yan-logaritmik çizimleri. Verilerin Lineer araziler her iki elektrot için yaklaşık 48 mV eğim ortaya koymaktadır.70 mM 152 mM ila b çift namlulu (siyah iz) V Na + (C) Müdahale ve [Na +] hızlı bir değişime konsantrik elektrot (gri iz). Konsantrik elektrodun tepki süresi önemli ölçüde daha hızlı olduğunu unutmayın. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtresi (genişlik 20) ile düzeltti bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Elektrot ucu sensör fazının kalınlığına yanı sıra uç çapına ucu şeklini bağlıdır elektrotlar tepki süresi, belirleyin.
    NOT: Bu deneysel olarak kurmak ve (500 msn içinde elektrot ucunda tamamlanan değişim) farklı perfüzyon salines arasında hızlı bir değişim istihdam çift namlulu sodyum duyarlı Mikroelektronlar 9.7 ± 4.5 sn zaman içinde istikrarlı bir potansiyele ulaştı152 mM ila 70 mM [Na +] geçiş (n = 6). Aynı ayar içinde, eş sodyum duyarlı Mikroelektronlar 0.8 ± 0.3 sn (n = 6) (Şekil 6C) içinde stabil bir potansiyele ulaşmıştır. Bu çift namlulu Mikroelektronlar karşılaştırıldığında konsantrik üstün zaman çözünürlüğü vurguluyor.

Doku 5. Diseksiyon

  1. Deney hayvanlarının Ötenazi, Lüksemburg: Akut dilim nesil için, yayınlanan (decapitated Avrupa Komisyonu'nun önerisi aşağıdaki hızla CO 2 ile doğum sonrası gün 16-20 fareler uyuşturan ve Avrupa Toplulukları, 1997 Resmi Yayınlar Bürosu; ISBN 92-827-9694-9).
  2. Standart bir prosedür (bakınız, örneğin 14) Aşağıdaki hipokampal doku dilimleri (kalınlık 250 mikron), hazırlayın.

6. Deney Prosedürleri

  1. Deneysel odasına bir dilim aktarın ve bunu düzeltmekızgara.
  2. Dilim yüzeyine kalibre edilmiş iyon seçici mikroelektrot indirin ve yaklaşık 50 um elektrot ile bir derinliğe CA1 bölgesinde in stratum radiatumunun merkezi impale.
    NOT: mikroelektrot ile dilim yüzeyini dokunmak iyon duyarlı varil karakteristik dalgalanmalara yol açar. Bundan başka, doku Impalement sırasında hücrelere zarar da dalgalanmalara neden olur. Bazal stabilize kadar bekleyin.
  3. Verici agonistlerinin basınç uygulaması için, bileşik (örneğin, 0,5 mM glutamata) sahip bir uygulama pipet doldurun. Bir basınç uygulaması cihazına bir micromanipulator ve çift bunu için pipet takın.
  4. Dikkatli bir şekilde düşük bir uygulama doku içine pipetle iyon seçici mikroelektrot (~ 20-40 um) ucunun yakınına yerleştirin. Basınç uygulama (örneğin, 10 sn, 40 mbar) ile iyon seçici mikroelektrot ile gözlenmiş gibi bir kayıt gerilim değişiklikleri başlatın.
  5. İlaçların banyo uygulaması için, swTanımlanmış bir süre için farklı perfüzyon salines arasında kaşıntı.
  6. Denemeyi sona erdirmek için, dikkatlice dokudan iyon seçici mikroelektrot çekilme ve uzun süreli kayıt dönemlerinde meydana gelmiş olabilecek orijinal sıfır değeri potansiyelleri herhangi sapmayı kaydedin.
  7. Banyosundan dilim hazırlık çıkarın ve iyon seçici mikroelektrot ikinci kalibrasyonu yapın.
    NOT: elektrot ucu doku içinden hareketi sırasında tıkanmış alabilirsiniz çünkü bu gereklidir. Bu durumda, elektrot de iyon konsantrasyonu değişiklikleri düzgün bir şekilde yanıt sağlamak için gereklidir. Iyon konsantrasyonunu on kat değişime elektrot cevabı% 10'dan fazla düştü ise Deneyler reddedilmelidir. Kuyu çalışma elektrotları prensip olarak birçok deneyde yeniden kullanılabilir. Bu durum, birkaç gün sürebilir eş elektrotlar için de geçerlidir. Bu çok önemlidir, ancak, bu kalibrasyon prosedürleri yeniden vardırelektrotların düzgün işleyişini sağlamak için önce ve her bir deneyden sonra tekrarlanır.

7. Veri analizi

  1. Hücre-dışı iyon konsantrasyonundaki değişikliklere iyon seçici elektrot voltaj tepkisini dönüştürmek için, ilk olarak K + -duyarlı elektrotlar burada gösterilen potansiyel ΔV iyonu (mV) aşağıdaki gibi (değişikliği belirlemek için denklem 2 dönüştürmek analog prosedürü için de geçerlidir Na) -duyarlı elektrotlar +:

Denklem 3

V K +: Valinomycin namlunun potansiyeli değişimi (mV)

s: Nernst eğim

K +] B: potasyum bazal konsantrasyonu (bizim durumumuzda 2.5 mM K +)

K +] o: [K +] değişiklikler o deney sırasında

  1. Tek logaritmik araziler elde edilen yamaçlarında aritmetik ortalamasını hesaplayın odeney öncesi ve sonrası kalibrasyon f; "s" almak için (bkz Şekil 5B, 6B noktası 4.8).
  2. [K +] o (mM Δ [K +] o,), denklemi 3 yeniden düzenlemek değişiklikleri hesaplamak için:

Denklem 4

Representative Results

Izlemek için [K +] o ve oluşan değişimler uyarıcı aktiviteye karşılık olarak, iki namlulu bir potasyum seçici mikroelektrot CA1 stratum radiatum sokulmuştur. Birkaç dakika Impalement sonra elektrot iyon seçici varil yaklaşık 2,8 mM, kullanılan ACSF [K +] yakın bir değere (o kadar [K +] tekabül eden, kararlı bir taban çizgisi (Şekil 7A) ulaşıldığında 2,5 mM). 10 sn için 0,5 mM glutamata Banyo uygulaması ~ 0.7 mM (Şekil 7A) tutarında taban altında undershoot, sonra, 4 mM o [K +] bir döner artışa neden. 0.4, 0.3, glutamat konsantrasyonunun azaltılması, ve 0.2 mM geçici bir artış ve [K +] o (Şekil 7A) içinde undershoot iki genliği karşılık gelen bir azalmaya yol açtı.

OAD / 53058 / 53058fig7.jpg "/>
Şekil uyarıcı aktiviteye karşılık olarak 7. Hücre dışı potasyum geçici. (A): [K +] o geçici, gösterildiği gibi 10 sn için glutamat farklı konsantrasyonlarda banyo uygulaması ile uyarılan taban altında undershoot ardından bir artış, aşağıdakilerden oluşan. (B) glutamat reseptör blokerleri ile perfüzyon Etkisi (CNQX, 100 uM; APV, 100 uM) ile tetrodotoksine (TTX 0.5 uM) [K +] o geçici 10 sn için 0,5 mM glutamat banyo uygulaması ile uyarılan. 0mg 2 + / BIC varlığında (C) kendiliğinden [K +] o geçişler. Ac gösterilen deneyler çift namlulu elektrotlar kullanılarak yapıldı. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtresi (genişlik 20) ile düzeltti bulundu. Cl LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya ick.

Daha önce deneyler glutamat kaynaklı [K +] o sinyalleri belirgin TTX uygulama sırasında değişmiş olmadığını göstermiştir ve dolayısıyla voltaj kapılı sodyum kanalları ve nöronal aksiyon potansiyeli nesil 15,16 açılması büyük ölçüde bağımsız olması. Glutamata karşılık olarak gözlenen [K +] o değişikliklerin altında yatan mekanizmaları incelemek için, glutamat reseptör blokerleri, yani CNKX (100 uM; AMPA alıcılarının engelleyici) uygulanmış ve APV (100 uM; NMDA reseptörlerinin bloke) varlığında, TTX (0.5 uM). (Şekil 7B, örneğin 17), bu bloker banyo perfüzyon üzerine, glutamat kaynaklı [K +] değişikliklerden o önce bildirildiği gibi iyonotropik glutamat reseptör kanallarının açılması bağımlılığını teyit neredeyse mülga idi.

Bundan başka t göstermek içinhücre-dışı üretimi için glutamaterjik uyarma o ilgisi [K +] sinyalleri, dilimler nominal Mg2 + içermeyen salin 10 uM bicuculline metiyodid (0mg 2 + / BIC) içeren perfüze edildi. Bu NMDA reseptörlerinin voltaja bağımlı Mg2 + -blok azaltır ve (örneğin 18,19) ağ spontan tekrarlayan epileptiform activity neden GABA A reseptörleri bloke ederek inhibe azaltır. Beklendiği gibi 20, kendiliğinden, tekrarlayan [K +] o geçici, yaklaşık 1.5 mM tutarında 0mg 2 + / BIC salin (Şekil 7C) 'de tespit edilmiştir. 0.2 bir ortalama amplitüdü olan, bu tepkiler arasında, daha küçük bir [K +] o geçici olarak mM (Şekil 7C) oluştu.

Deneylerin ikinci setinde, biz uygulanması ile uyarılmış [Na +] o değişiklikleri belirlemek için [Na +] -duyarlı Mikroelektronlar kullanılanglutamat agonistleri. Burada, biz de iki farklı uygulama paradigmaları kullanan çift namlulu ve konsantrik Mikroelektronlar tepki özelliklerini karşılaştırdık. [Na +] -duyarlı Mikroelektronlar yaklaşık 50 uM'lik bir derinlikte stratum radiatum içine yerleştirilmiştir. Stabil bir temel çizgisi elde edildikten sonra, glutamat agonistinin L-aspartat (2,5 ml / dakika ile 10 mM, 120 saniye, Banyo perfüzyonu) Banyo perfüzyonu başına uygulanmıştır. Daha önce 21 gözlendiği gibi, aspartat uygulama yaklaşık 5 dakika sürmüş ve daha sonra taban çizgisine geri (Şekil 8A) kurtarmak için başladı yaklaşık 15 mM ile o [Na +] yavaş bir düşüşe neden olmuştur. Her iki elektrot ile belirlenir: [Na +] o sinyalleri zirve amplitüdleri ve kinetiği bu koşullar altında hemen hemen aynı ise Özellikle, konsantrik elektrotlar daha stabil bir taban çizgisi ve gürültü seviyesini azaltır (Şekil 8A) arzetmiştir.

R test etmek için Daha hızlı bir uygulama paradigma altında farklı elektrot özelliklerini esponse biz iyon seçici mikroelektrot ucundan 20-40 um'lik bir mesafe stratum radiatum yerleştirilmiş ince bir cam pipet ile glutamat uygulanan basınç. 21 Beklendiği gibi, 200 ms için glutamat uygulama (10 mM) [Na +] o (Şekil 8B) bir düşüşe neden oldu. [Na +] o düşüş zirve genlikleri elektrotların her iki tip için de aynı aralıkta idi (:;: 19.1 mM, n = 15 - - 2,0 konsantrik 13.5 mM, n = 14 4.5 çift namlulu). Ancak yavaş Banyo perfüzyonu (yukarıya bakınız), sinyal-gürültü oranı değil, aynı zamanda iki elektrot tip tespit [Na +] o sinyallerinin zaman tabii sadece elde edilen sonuçların aksine önemli ölçüde farklılık göstermiştir. Zirveye ortalama süre konsantrik Mikroelektronlar için namlulu çift ve sadece 1,3 saniye 3.5 saniye idi.

ve_content "> Bu nedenle, bu sonuçlar, ve genel eş çift namlulu Na + -seçici Mikroelektronlar hızlı tepki kinetikleri onaylamak (bakınız Şekil 6C ve 8B), aynı zamanda Ca + 2 ve not edildi pH-seçici muadilleri 10 . Kısa patlama sinaptik stimülasyonu hızlı sinaptik kaynaklı iyon transientleri uyandırmak için yapıldığı eski çalışmada, aksine, sadece bir eğilim, ama bizim uygulama ile konsantrik ve çift namlulu elektrotlar arasındaki ortalama pik amplitüdlerinde anlamlı bir fark yoktu paradigması. Bu nedeni muhtemelen sonuç olarak iki (20-40 um) 'in bir faktör ile farklılık iyon seçici mikroelektrot ucu ve uygulama pipet mesafe, hedef bölgede maksimum glutamat konsantrasyonu zirve amplitüdlerinde varolan herhangi bir fark tıkayan, farklı deneylerde aynı değildi.

(A) Üst izleri: volta DeğişimBir çift namlulu elektrodun (siyah noktalı iz) ve banyo Na + konsantrasyonu değişikliklere tepki olarak konsantrik elektrot (gri iz) referans varil (V ref) ve ge ([Na +] b) gösterildiği gibi. Her iki elektrot voltaj tepkileri hemen hemen aynı olduğuna dikkat edin. Alt izleri: iki namlulu bir elektrot (siyah iz) ve [Na +]; b değişikliklere karşılık olarak bir eş-elektrot (gri iz) Na + -potansiyel (V Na +) gerilim değişiklikler. Her iki elektrot V Na + karşısında B (b) [Na +], yan-logaritmik çizimleri. Verilerin Lineer araziler her iki elektrot için yaklaşık 48 mV eğim ortaya koymaktadır. 70 mM 152 mM ila b çift namlulu (siyah iz) V Na + (C) Müdahale ve [Na +] hızlı bir değişime konsantrik elektrot (gri iz). Konsantrik elektrodun tepki süresi önemli ölçüde fas olduğunu unutmayınter. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtre ile düzeltti edildi (genişlik 20).

Şekil 8
Şekil 8: çift namlulu ve konsantrik elektrotlar ile tespit edilen hücre dışı sodyum geçici.
(A) Geçici V ref değişiklikler ve [Na +] bar belirtildiği gibi o 120 saniye boyunca 10 mM aspartat ile banyo perfüzyon tarafından uyarılan. Üst izleri iki namlulu bir elektrot ile gerçekleştirilen bir kayıt, düşük değerli izleri eşmerkezli elektrot kullanılarak kaydedildi göstermektedir. (B) ok ile gösterilen şekilde 0.2 sn için 10 mM glutamat yerel basınç uygulaması ile uyarılan o V ref ve [Na +] Geçici değişir. Üst izleri iki namlulu bir elektrot ile gerçekleştirilen bir kayıt, düşük değerli izleri eşmerkezli elektrot kullanılarak kaydedildi göstermektedir.Noktalı kırmızı çizgiler onun maksimum sinyal başlangıcı arasındaki dönemde doğrusal uyuyor temsil etmektedir. Eşmerkezli elektrot yanıt süresi bu koşullar altında çok daha hızlı olduğunu not edin. Gösterim amacıyla, izleri Sawitzky-Golay filtresi (genişlik 20) ile düzeltti bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Sıvı taşıyıcı bazlı, iyon seçici elektrotlar on yıllardır başarıyla birçok iyonlar için kullanılmıştır, son derece spesifik sensörleri 22-26 mevcuttur. ECS genişliği sadece yaklaşık 20-50 nm, seçici iyon çapı ise: Omurgalı beyin hazırlıkları dışı boşluk (ECS) kullanıldığında, kimse bu oldukça invaziv bir tekniktir ki, akılda tutmak gerekir Mikroelektronlar yaklaşık 1 mikron (çift namlulu elektrotlar) veya daha büyük (konsantrik elektrotlar) 'dir. Iyon seçici Mikroelektronlar uçları bu nedenle, sadece doku kendi kazığa oturtma sırasında dokulara zarar değil, aynı zamanda iyon geçici bir azımsanmasını lehine ECS büyütmek olacaktır. Bu tuzaklara rağmen, nöronal aktivite cevaben dışı iyon geçici bu yöntemin güvenilirliği doğrulayan farklı laboratuvarlarda 7,8 arasında belirgin tutarlıdır.

Iyon seçici elektrot performansı ve uygunluğukullanılan sensor kokteyl ("sıvı membran iyonofor ') tarafından tanımlanan duyarlılık ve seçicilik, bağlıdır. Sensör kokteyller potasyum 27 için yüksek bir seçicilik gösterir K + -seçici mikro elektrod Valinomycin örneğin özel bir taşıyıcı molekül içerir. Rağmen, diğer iyonlar ile çapraz reaksiyon oluşabilir ve test edilmelidir. Valinomycin sonuçları değerlendirilirken göz önüne alınmalıdır amonyum için önemli çapraz reaktivite (örneğin 11,12) gösterir. Iyonoforlar gerilim-tepkisi Nernst davranışı (bakınız denklemi 1) takip ettiği başka, sinyal-gürültü oranı ve saptama eşiği ölçülecek iyonunun konsantrasyonuna bağlıdır. Böylece, ise küçük [K +] o geçici geçici çok daha zor hi karşı algılamak için vardır o alçak taban [K +] o, küçük [Na +] karşı büyük voltaj değişikliklerini uyandırmakGH bazal [Na +] o (bakınız Şekil 5 ve 6).

Iyon seçici elektrot performansı büyük ölçüde elektriksel zaman sabiti tarafından yönetilir zamansal çözünürlüğü ile belirlenir. Ikinci esas olarak sensör eksenel direnci ile belirlenir ve iç çözeltiler ve dış sıvısı arasındaki pipet uzunluğu boyunca dağıtılmış kapasitans kullanılarak verilir. Iki namlulu bir yapılandırmada, direnç backfilled iyon sensörünün uzunlukta sütun nedeniyle yüksektir. (Bu durumda borosilikat cam), belirli bir yalıtkan dielektrik için, kapasite dielektrik kalınlığı ile yönetilir. Çift namlulu elektrotlar ise, dielektrik genişlik pipet cam duvarın tutarlar. Cam ucu yakın incelir gibi, dielektrik genişlik düşer ve kapasitans artar. Bu faktörler birkaç yüz milisaniye birkaç değişir tepki süreleri ile elektrotlar üretmek için bir arayasaniye olarak bu faktörler çeşitlidir.

Konsantrik tasarımın en büyük avantajı eksenel direnci ve banyo kapasite hem büyük ölçüde azaltılmış olmasıdır. İpucu önce son birkaç mikrometre sadece bir kalıntısı bırakarak backfilled iyon değiştirici direnişin en konsantrik pipet şantlar. Buna ek olarak, konsantrik pipet içindeki dolgu çözümü fiziksel ölçüde kapasitansını azaltarak, iki cam duvar kalınlığı ile ayrılmış, banyo mesafeli edilir. 10 Daha önce gösterildiği gibi, daha az direnç ve kapasitans birleşik etkisi, iki büyük kertesine zamansal çözünürlüğü bir gelişmedir. Eş-Ca 2 + ve pH Mikroelektronlar halinde,% 90 tepki süreleri gibi düşük msn 10-20 olarak 10 idi. Eş-tasarımın bir avantajı, ilgili düşük ses seviyesi (bakınız Şekil 8). Herhangi bir Ambien gelen, büyük ölçüde azaltılmış direnci gerilim transientler sayesindet gürültü en aza indirilmiştir. Ayrıca, bu tür geçici kurtarma çünkü hızlı zaman sabitinin, hızlıdır. Bu tür eserler, bu nedenle küçük ve hızlı, ve fizyolojik kayıtları (bakınız Şekil 8) üzerinde daha az yıkıcı bir etkiye sahiptir.

Eş-tekniğin dezavantajları da vardır. İlk olarak, bunların montajı daha karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. İkinci bir dezavantaj, ayrı bir mikromanipülatör veya özel bir çift manipülatör ya kullanımını gerektirmeyen, kendi ucu ile ayrı bir referans mikroelektrot yer ihtiyacıdır. Son olarak, iki namlulu Mikroelektronlar konsantrik elektrotlar için mümkün değildir, aynı zamanda 28, iki farklı iyon türü tespitine olanak sağlayan, üçlü namlulu tasarım uzatılabilir.

En yaygın tuzaklar

Verimsiz silanizasyon.

Herhangi bir sıvı-sens imalatında en önemli adım, ve asıl engelya göre iyon seçici mikroelektrot silanizasyon işlemdir. Elektrotlar spesifik iyon konsantrasyonuna değişikliklere yanıt, ya da bir alt Nernst cevabı (on kat konsantrasyon farkı başına, yani iyi az 58 mV) ile yanıt başarısız olduğunda, silanizasyon kötü etkinliği genellikle nedenidir. Atmosferik nem yaz veya kış yükseklikte koşulları tipik, çok yüksek veya çok düşükse Bizim tecrübelerimize göre, bu sırasıyla oluşabilir. Oda nem üzerinde bir miktar kontrol uygulamak için mümkün değilse, bu sorunlar aşılabilir.

Elektrot direnci çok yüksektir.

Gerekirse, iyona duyarlı bir kovanın direnci Kaynak ağzı azaltılabilir. Bu amaçla, bir kaç saniye için su içinde süspansiyon haline getirilmiş, bir aşındırıcı maddenin kuvvetli jet olan ucu maruz. Bu, upmost ucu kırmak ve istenen değere daha düşük direnci neden olur.

Tuz köprüler.

Tuziyon ve referans varil arasında köprüler zayıf ya da hiç tepki vermeyen elektrotlar neden ve dolayısıyla da büyük ölçüde kalibrasyon performanslarını karıştırabilir. (Nokta 1.6 bkz.) Yukarıda da belirttiğimiz gibi, bu çift namlulu teta cam seçilir bir sorun esas olmakla birlikte, burada açıklanan ofset, bükülmüş varil tekniğini kullanırken nadir görülen bir durumdur.

Akılda imalat kolaylığı sayesinde, Lux 29 orijinal çift namlulu tasarım genellikle karlı kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda ucu ile, iyon değiştirici katılmasıyla, aşağıdaki, tuz çözeltileri, ucu olan emme ve çıkarma ile silan çözeltisine hızlı bir pozlama ile iyonu ve referans varil ön doldurma kullanır (30,31 bakınız) . Bu elektrotlar yaklaşık 10 dakika içinde imal, ama onların uç boyutu genellikle 4 mm veya daha fazla ve onlar bir deney sırasında başarısız daha yatkındır edilebilir. Bunun aksine, bu silanizasyon yöntemleri silan buhar ve ısı maruz kalınmasınıing küçük günler süren ipuçları ve bazen haftalık elektrotları üretebilir.

Birlikte ele alındığında, birçok protokoller vardır ve iyon seçici Mikroelektronlar hazırlamak için nasıl yaklaşır. Burada, yakın% 100 genel başarı oranı ile, bizim laboratuarlarımızda iyi ve güvenilir çalışması bükümlü namlulu çift olarak konsantrik Mikroelektronlar imalatı için iki ana süreçleri de tarif etmiştik. Önemli olarak, bu teknikler, pH veya kalsiyum iyonları da dahil olmak üzere, diğer türler, ölçülmesi de aktarılabilir, ve aynı zamanda, genel olarak sıvı ile dolu boşlukların veya sıvıları da dahil olmak üzere beyinde dışında preparatlar için de geçerli olacaktır. Son fakat en az değil, iyon seçici Mikroelektronlar hücrelerin içinde iyon konsantrasyonlarının tespitine imkan. Nispeten büyük bir uç boyutu (~ 1 mm) arasında olduğundan, bu, bununla birlikte, omurgasız preparasyonlar 28,32 bulunan gibi yalnızca örneğin büyük bir hücre gövdesi, hücrelerde mümkün.

Acknowledgments

Yazarlar, uzman teknik yardım için C. Roderigo teşekkür etmek istiyorum. Biz video üretimi için yardım S. Köhler (İleri Görüntüleme Merkezi, Heinrich-Heine Üniversitesi Duesseldorf) teşekkür ederim. (MC) R01NS032123 hibe: (Ro 2327 / 8-1 CRR için DFG), (nh) Heinrich-Heine Üniversitesi Duesseldorf ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yazarın laboratuvarında araştırma Alman Araştırma Birliği tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Abrasive   MicroPolish  Buehler GmbH Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries 1405059 Hilgenberg Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament GC 150 F-15  Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus For the sensor of double-barreled microelectrodes 
Borosilicate glass capillaries with filament GC100-F-15 Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus For the reference of double-barreled microelectrodes 
Borosilicate glass capillaries with filament GB-200TF-15  Science Products Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm  
Borosilicate glass capillaries with filament GB-120TF-10 Science Products Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata 1322A Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage Custom-made Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber Custom-made Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace Heraeus Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax  Deiberit 502  Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate Custom-made Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas Custom-made Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator Leitz
Micromanipulator MD4R Leica
Stereo microscope M205C Leica
Objective Plan 0.8xLWD Leica
Pipette puller Model PP-830 Narishige Concentric microelectrodes 
Pipette puller Model P-97 Sutter Instruments  Sensor of concentric microelectrodes 
Pneumatic drug ejection system Picospritzter Type II General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage DT 25/M Thorlabs
Two-component glue  Araldite Huntsman advanced materials GmbH One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together 
Silverwire 99.9%  Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome Microm HM 650 V Thermo Scientific
Software AxoScope 8.1  Axon Instruments
Vertical puller  Type PE-2 Narishige Scientific Instruments With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide Sigma aldrich 14343 Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX Sigma aldrich C-127 AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma aldrich D5879
DL-AP5 Alfa Aesar J64210 NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma aldrich 440191 CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid Sigma aldrich A9256 Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma aldrich G1626 Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B Fluka  60403 Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A Fluka   71178 Based on ETH 157
TTX Ascent Scientific Asc-055 Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure Sigma aldrich W3500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  2. Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space. Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).
  3. Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex. J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).
  4. Rice, M. E., Nicholson, C. Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum. Neuroscience. 38, 295-310 (1990).
  5. Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex. Brain Res. 50, 489-495 (1973).
  6. Deitmer, J. W., Rose, C. R. pH regulation and proton signalling by glial cells. Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).
  7. Chesler, M. Regulation and modulation of pH in the brain. Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).
  8. Kofuji, P., Newman, E. Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. Springer. (2009).
  9. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).
  10. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).
  11. Stephan, J., et al. Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ. Glia. 60, 965-978 (2012).
  12. Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. Microelectrodes. Lei, K. F. Nova Science Publishers. 87-105 (2014).
  13. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).
  14. Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (2014).
  15. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain. J Neurosci Res. (2014).
  16. Pumain, R., Heinemann, U. Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex. J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).
  17. Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord. J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).
  18. Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices. J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).
  19. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322, 1551-1555 (2008).
  20. Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity. Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).
  21. Zanotto, L., Heinemann, U. Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats. Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).
  22. Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells. J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).
  23. Ammann, D., Anker, P. Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies. Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).
  24. Deitmer, J. W., Schlue, W. R. Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump. Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).
  25. Schwiening, C. J., Thomas, R. C. Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones. J Physiol. 491, (Pt 3), 621-633 (1996).
  26. Chesler, M., Kraig, R. P. Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation. Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).
  27. Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).
  28. Deitmer, J. W. Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells. Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).
  29. Lux, H. D. Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS. Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).
  30. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  31. Chesler, M., Chan, C. Y. Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum. Neuroscience. 27, 941-948 (1988).
  32. Thomas, R. C. Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones. J Physiol. 220, 55-71 (1972).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 05/10/2016. Citeable Link.

An author's middle initial was omitted from the publication, Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. The author's name has been updated to:

Christine R. Rose

from:

Christine Rose

Beyin Dokusu Ölçme Ekstraselüler Ion Sinyalleri için Çift namlulu ve Konsantrik Mikroelektronlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J. Vis. Exp. (103), e53058, doi:10.3791/53058 (2015).More

Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J. Vis. Exp. (103), e53058, doi:10.3791/53058 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter