Dobbeltløpet og Konsentriske mikroelektroder for måling av Ekstracellulær Ion Signaler i hjernevev

Protocol

Denne studien ble utført i henhold til de institusjonelle retningslinjer Heinrich Heine Universitetet Düsseldorf, Tyskland, samt EU rådsdirektiv (86/609 / EØF). Alle forsøkene ble kommunisert til og godkjent av Animal Welfare Kontoret ved Animal Care og bruk Facility av Heinrich Heine Universitetet Düsseldorf, Tyskland (institusjonell handling Nummer: O52 / 05). I samsvar med den tyske dyrevernloven (Tierschutzgesetz, artikkel 4 og 7), var det ikke nødvendig med formell tilleggsgodkjenning for post-mortem fjerning av hjernevev.

1. Utarbeidelse av dobbeltløpet Ion-selektive mikroelektroder

1. Forbered to borsilikatglass kapillærer med filament: en med en lengde på 7,5 cm og en ytre diameter på 1,5 mm som skal benyttes for ione-sensitive fat, og en med en lengde på 6,5 cm og en ytre diameter på 1,0 mm for den senere referanse fat.
2. Rengjør capil laries i aceton i 12 timer og deretter skylle flere ganger med abs. etanol og la dem tørke. Elektrodene kan nå være lagret i en eksikator.
3. Bruke to-komponent lim, eller en liten stripe av aluminiumsfolie for å feste en lang og en kort kapillær sammen i begge ender. Varm dobbel-kapillar i en ovn ved 60 ° C i 1 time. Dette påskynder herdeprosessen. Oppbevar elektrodene nå i en eksikator.
4. Sentrere dobbelt kapillar i en vertikal puller med en svingbar chuck. Varm spolen forsiktig til glasset er mykt nok til å tillate en horisontal rotasjon av chucken svingbar ved 180 °. I løpet av dette trinnet, forhindre forlengelse av kapillar med en kloss i henhold til chucken.
5. Etter avkjøling fjerne den mekaniske pause og påfør et andre oppvarmingsprotokoll til å trekke ut i kapillært, noe som resulterer i to skarpe, dobbeltløpet kapillærer (figur 1). Spissen diameteren av en dobbelt-kapillar bør være nær 1 um.

ve_content ">
Figur 1. Arkitektur av ion-selektive microelectrodes. (A) Fotografi av en dobbeltløpet microelectrode. For illustrasjonsformål og bedre synlighet, ble væsken inni referansen fat tonet. (B) Fotografi av en konsentrisk microelectrode og tilsvarende referanseelektrode. Tuppen av konsentriske microelectrode er vist forstørret på sitt venstre. I (A) og (B), plassen som opptas av det ion sensoren i spissene av pipetter er post-farget. Nederst, er spissen arrangement av begge elektrodetypene vist skjematisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

6. Hvis en vertikal avtrekker med svingbar chuck er ikke tilgjengelig, utarbeide en dobbeltløpet ion-selective mikroelektrode i et horisontalt avtrekker ved hjelp av theta glass.
   1. For dette formål, trekk theta glass (ytre diameter 1,5 mm, lengde 7,5 cm) ut til å resultere i to elektroder med to løp hver. Mark en av dem for å tjene som fremtidig referanse fat. Silaniserte det andre i likhet med fremgangsmåten beskrevet nedenfor for å tjene som den fremtidige ioneselektiv fat.
      MERK: Selv om utarbeidelse av dobbeltløpet theta-glasselektroder er langt enklere enn utarbeidelse av vridde dobbeltløpet elektroder, de er mer utsatt for kryss-action mellom begge fat som tynn skillevegg glassvegg mellom dem har en tendens til å være porøs i sitt ytterste spiss.
      MERK: Siden sensoren cocktail (se nedenfor) er hydrofob, må den indre overflaten av den senere ione-sensitive fat bli gjort hydrofob, så vel ved en prosess kalt silanisering. For dette er heksametyldisilazan (HMDS) som benyttes (figur 2), som beskrevet i det neste trinn.

Figur 2. silanisering av pipetter. (A) Heksametyldisilazan (HMDS) reagerer med Si-OH-grupper i den indre glassoverflaten og gjør den hydrofobe. (B) Den venstre Bildet viser hele silanisering enhet. En stor åpning flaske som inneholder HMDS er plassert på toppen av en varmeplate innstilt på 40 ° C. På toppen av flasken, en holder (PH) som bærer de kapillærer (CAP) montert. Den høyre Bildet viser en forstørrelse av pipetten holderen (PH) bærer kapillærene (CAP). (C) Skjematisk side visning av skreddersydde pipettes holdere (PH) for dobbeltløpet (venstre) eller konsentriske (høyre) kapillærer (CAP) som er montert på en bred munn flaske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

7. Like før pulling elektroder, fyll ca. 20 ml HMDS inn i en bred munn flaske. Oppmerksomhet: HMDS er for bruk i et avtrekksskap bare, damper er helsefarlig! Lukk flasken og legg den på en varmeplate, forhåndsinnstilt til 40 ° C. Forvarm en ovn, plassert under panseret også, opp til 200 ° C.
8. Fyll henvisning fat inntil dens spiss med destillert vann for å hindre at den silanisering under følgende prosedyre.
9. Sett dobbeltløpet kapillær med spissen opp på en spesiell, skreddersydde holderen (figur 2B, 2C). Den butte åpne ende må være fritt gjennom bunnen av holderen (figur 2C, venstre). Etterpå plassere denne holderen på den brede munnen flasken inneholder forvarmet HMDS for 70 min.
   MERK: Pass på at HMDS damp kan strømme gjennom kapillærer fritt. Under en silanisering prosess, gjør 20 ml HMDS ikke fordamper fullstendig, og flasken kan således anvendes flere ganger.
10. Afterwards, overfører kapillærene til et metallstativ, og inn i den forvarmede ovn i to timer. Dette vil tørke både fat.
11. Etter silanisering, holde kapillærene tørr før bruk. Mens det tidligere prosedyren krever omtrent 3,5 timer totalt, kan elektrodene nå være lagret i en eksikator i flere uker.
12. På dagen for deres eksperimentell bruk, fremstille ione-selektive elektroder ved å fylle spissen av silanert sylinder med 1-2 ul av den ioneselektive føler (figur 1A). For kalium-sensitive mikroelektroder, bruke bære valinomycin; og for natrium-sensitive mikroelektroder, bruke ETH 157 som transportør.
13. Legg merke til at ioneselektiv sensor er ganske viskøs gjør det vanskelig for spissen å fylle på riktig måte.
14. Fyll referanse fat med HEPES-bufret saltløsning (se nedenfor).
    MERK: Mens andre, mer enkel iso-osmotisk saltløsning kan også anvendes, foretrekker vi å bruke en saltoppløsning hvis sammensetning er i det vesentlige likperfusjon saltvann (ACSF, se 3.6.), fordi det kan lekke ut og trenge inn i vevet i løpet av eksperimentene. Derfor er det også viktig at denne saltvann ikke inneholder en høyere konsentrasjon av det ion som skal bestemmes enn ACSF som brukes.
15. Fylle sensor med saltløsning som inneholder en høy konsentrasjon av det ion som skal detekteres. Dermed fylle sensor med 100 mM NaCl saltvann (for natrium-sensitive mikroelektroder) eller 100 mM KCl (for kalium-sensitive mikroelektroder). Pass på å ikke sette inn flere luftbobler under denne prosedyren.
16. Dersom silanisering var vellykket og sensoren er fylt ordentlig, observere sensoroverflaten danner et klart synlig konkav flate mot tilbakefyllingen (figur 1A). Ellers kan sensoren ha trukket fra den kapillære vegg og spissen vil ikke bli fylt. Slike elektroder vil ikke være funksjonelle.
17. Sett klorsølvtråder i både fat (vær forsiktig så du ikke berører sensor) og forsegle hvert fat med dental voks (figur 1A).

2. Utarbeidelse av konsentriske Ion-selektive mikroelektroder

1. For den ytre sylinder, bruk tynnveggede glasskapillærer med filament (ytre diameter 2,0 mm) og en lengde på 7,5 cm. For den indre sylinder, kan tynnveggede kapillærer med filamentet, en ytre diameter på 1,2 mm og en lengde på 10 cm.
2. Rengjør kapillærene i aceton i 12 timer. og deretter skylle flere ganger med abs. etanol og la dem tørke. Elektrodene kan nå være lagret i en eksikator.
3. Fyll ca. 20 ml HMDS inn i en bred munn flaske. FORSIKTIG! HMDS er for bruk i et avtrekksskap bare, damper er helsefarlig. Lukk flasken og legg den på en varmeplate, forhåndsinnstilt til 40 ° C. Forvarm en ovn, plassert under panseret også, opp til 200 ° C.
4. Sett inn 2,0 mm kapillær til en horisontal avtrekker og trekk den ut til å resultere i kapillærer med korte smalner og et tips Diameter av ~ 4 mikrometer (Figur 1B).
5. Sett uttrukket 2,0 mm kapillær med spissen opp på en skreddersydd, spesiell holder (figur 2B, 2C) slik at den butte enden åpner til hulrommet i flasken (Figur 2C, høyre). Etterpå plassere denne holderen på den brede munnen flasken inneholder forvarmet HMDS for 70 min. Sørg for at HMDS damp kan strømme gjennom alle kapillærer.
6. Deretter overfører kapillærene til et metallstativ, og inn i den forvarmede ovn i to timer.
7. Etter silanisering, holde kapillærene tørr før bruk. Mens det tidligere prosedyren krever omtrent 3,5 timer totalt, nå lagre elektrodene i en eksikator i flere uker.
8. Rett før bruk fylle en liten mengde av sensoren (0,2 mL) i silanert kapillær (figur 1B).
9. For å forberede den indre kapillær, sette inn en liten diameter kapillær inn i avtrekker og trekk ut til å resultere i to-kapillærer med lange smalner og skarpe tips (Figur 1b). Fyll med 100 mM NaCl (natrium-sensitive mikroelektroder) eller 100 mM KCl (kalium-sensitive mikroelektroder) saltvann.
10. Plasser sensoren fylt og saltvannsfylte kapillære direkte på linje med hverandre på en tilpasset bygge proppen er laget av dekkglass. Sett mindre kapillære en kort vei inn i den større kapillar.
11. Fest kapillærer på en annen dekk bruker modelleire, overføre til scenen av et mikroskop og visualisere ved hjelp 100x forstørrelse. Ved hjelp av en glasstav som er montert på en mikromanipulator og ved å dreie den fine driften av trinn i mikroskop, langsomt videre den ytre kapillær over indre kapillær inntil avstanden mellom deres spisser er omtrent 5 pm (figur 1B).
12. Løs den åpne ende av den ytre kapillær på den innvendige kapillaren ved hjelp av tann voks. Alternativt, bruke en liten dråpe cyanoakrylat (Crazy Glue) instead av voks.
    MERK: Tilsetning av en liten dråpe av vann vil polymerisere limet og feste elektrodene på plass. Sett inn en klorert sølvtråd i den indre fat og forsegle den med dental voks (figur 1B).
13. For å fremstille referanseelektroden, ta en 7,5 cm lang kapillar med glødetråd og en ytre diameter på 1,5 mm og trekker ut med en vertikal avtrekker. Pass på at tipsene er relativt lang, men ikke for skarp (tip diameter ~ 1 mikrometer).
14. Kast den øvre pipette, åpne den nedre chuck og løft den nedre pipette med ca 5 mm. Lukk chuck igjen og løfter den til spissen av den nedre elektrode er plassert omtrent 5 mm over varmebatteriet. Varm spolen og bruke tang for å bøye spissen ved ca. 45 ° til siden. Nedre pipette ca 1-2 mm. Bend igjen ved ca. -45 ° til direkte spissen tilbake parallelt med hovedakslingen (figur 1B). Denne prosedyren er nødvendig for å muliggjøre tett plassering av spissen av reference elektrode til den konsentriske elektrode.
15. Fyll referansen fat med HEPES-bufret saltvann (se nedenfor), sett inn et klorert sølvtråd og forsegle fat med dental voks (figur 1B).

3. Salines

1. Forbered saltvann for tilbakefylling av kalium sensitive elektroder (se 1.15.) Består av 100 mM KCl. Saline for tilbakefylling av natrium- følsomme elektroder er sammensatt av 100 mM NaCl.
2. Forbered saltvann for tilbakefylling av referanse fat (. HEPES-bufret saltvann, se 1.16) er sammensatt av (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 2 _MgSO4, 1,25 NaH _{2PO 4,} og 25 HEPES, titrert med NaOH for å gi en pH-verdi på 7,4.
3. Forbered saltvann for kalibrering av kaliumfølsomme elektroder er sammensatt av 25 mM HEPES og et total på 150 mM NaCl og KCl, pH justert til 7,4 med NMDG-OH (N-metyl-D-glukamin). Her kalibrering ble utført med salines inneholdende 1, 2, 4 eller 10 mMKCl; ACSF inneholdt 2,5 mM KCl (figur 5).
4. Forbered saltvann for kalibrering av natrium-sensitive elektroder som følger; (i mM) 25 HEPES, 3 KCl, totalt 160 NaCl og NMDG-Cl, pH justert til 7,4 med NMDG-OH. Kalibrere med saltløsning inneholdende (i mM) 70, 100, 130 eller 160 NaCl; ACSF inneholdt 152 NaCl (figur 6).
5. For bestemmelse av kryssreaksjon av sensoren sammen med andre ioner, f.eks., PH, fremstille ytterligere salines kalibrerings med faste ionekonsentrasjoner, men varierende pH.
   MERK: Selv om denne prosedyren ikke er påvist i denne studien, kan henvises til tidligere arbeid å ta opp dette problemet (f.eks ^11,12).
6. Forbered akutte hjerne vevssnitt i saltløsning bestående av (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH _{2PO 4,} 26 _NaHCO3, og 20 glukose, gjennomboblet med 95% _O2 og 5 % CO _2, noe som resulterer i en pH på7,4.
7. Utføre eksperimenter i hjerneskiver i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) bestående av (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 1,25 NaH _{2PO 4,} 26 _NaHCO3, og 20 glukose, boblet med 95 O% ₂ og 5% CO2, noe som resulterer i en pH på 7,4.
8. For stimulering av neuroner og gliaceller, fremstille oppløsninger inneholdende 0,2, 0,3, 0,4 eller 0,5 mM glutamat eller 10 mM L-aspartat oppløst i ACSF. For trykkanvendelse, oppløse 10 mM glutamat i HEPES-bufret saltvann.
9. Forberede søknad pipette for press søknaden. Sett tynnveggede glasskapillærer med filament (ytre diameter 2,0 mm) og en lengde på 7,5 cm til horisontal avtrekker og trekker ut til å resultere i en spiss diameter på ~ 1 uM.
10. For induksjon av epileptiform aktivitet, forberede magnesium-free ACSF inneholder 10 mikrometer bicuculline methiodide.
11. Å hemme dannelsen av aksjonspotensialer, utarbeide en 10 mM lager solution av tetrodotoksin (TTX) i destillert vann. Under forsøk er TTX direkte tilsettes til ACSF til å resultere i en sluttkonsentrasjon på 0,5 uM.
12. For å hindre aktivering av AMPA-reseptorer, forberede en 50 mM stamløsning av cyano-nitrokinoksalin-dion (CNQX) i dimetylsulfoksyd (DMSO). Under forsøk er denne direkte tilsettes til ACSF til å resultere i en sluttkonsentrasjon på 100 uM.
13. Å blokkere aktivering av NMDA-reseptorer, utarbeide en 50 mM stamløsning av amino-phosphonopentanoate (APV) i 70 mM _NaHCO3. Under forsøk er denne direkte tilsettes til ACSF til å resultere i en sluttkonsentrasjon på 100 uM.

4. Kalibrering av Ion-selektive mikroelektroder

1. Kalibrere ioneselektiv microelectrode direkte før og etter hvert forsøk.
2. Fest elektrodene til micromanipulators og sette dem inn i en ACSF-perfundert eksperimentelle kammer, plassert under en stereo mikroskop (figur 3 g>, 4). Plassere referanseelektroden inn i forkammeret (figur 4A, B). Slå på bad perfusjon, sørge for at flyten er ca 2 ml / min.

Figur 3. Det eksperimentelle arbeidsplass. Opptaket Riggen består av et vibrasjonsdempet bord bærer x / y-translasjonell trinnet med den eksperimentelle bad, de micromanipulators, og et stereomikroskop med høy kvalitet optikk. Stereomikroskop er også utstyrt med en CCD-kamera for dokumentasjonsformål. I tillegg er en trykk søknad enhet for focal narkotika program som brukes. Opptaks Elektrodene er koblet via hodet trinnet til en differensialforsterker. De digitaliserte data (A / D konverter) er spilt inn med en datamaskin. Badet perfusjon er realisert av en peristaltisk mikropumpe (ikke vist).> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Slå på A / D-konverter, differensialforsterkeren, og datamaskinen, og start innspillingen programvare (figur 3, 4). Fordi motstanden i ion-sensitive fat er svært høy (10-20 GΩ, se nedenfor), bruk en spesiell elektro forsterker med høy inngangsimpedans (R _i = 10 TΩ) og en liten skjevhet strøm (I _skjevhet = 50 fA - 1 pA).

Figur 4. Elektronisk og romlige utforming av den eksperimentelle oppstilling. (A) Skjematisk visning av registreringsarrangement. Tuppen av en dobbeltløpet microelectrode (blå) og en konsentrisk microelectrode (rødt) er anordnet i en eksperimentell bad fylt med saltvann. Badet referanseelektrode er antydet skjematisk. Den Poten tial som detekteres av ioneselektive fat _(V 1) er sammensatt av den elektriske feltpotensial (V _ref) og ion potensial (V _ion), mens referanse fat (V ₂₎ bare detektere V _ref. For å isolere V _ion, er V _ref subtrahert fra V _{1 ved hjelp av} en differensialforsterker (DA). (B) Topografi av den eksperimentelle scenen med en konsentrisk microelectrode på plass. Sentrum av den eksperimentelle stadium består av den eksperimentelle bad som inneholdt en skive preparatet. Til bakken badekaret, er referansen bad elektrode neddykket i forkammeret som også vert perfusjon innløpet. Scenen i seg selv er jordet ved en egen bakkekontakt. Den konsentriske microelectrode og referanseelektrode blir båret av separate pipettes innehavere drevet av micromanipulators. Mikroelektroden og referanseelektroden er elektronisk koplet til hodet trinn av forsterkeren.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. Koble klorsølvtråder til de respektive innganger av hodet trinn av differensialforsterkeren (figur 4). Bestem elektrodemotstander. Sørg for at motstanden av referansen fat er mellom 30-100 Megohm og motstanden i ion-sensitive fat er mellom 10-20 GΩ.
5. Justere spenningssignaler til null og starte innspillingen.
6. Legg merke til at potensialet detektert av de ioneselektive fat (V ₁₎ er sammensatt av den elektriske feltpotensial (V _ref) og ione-potensial (V _ion), mens referanse fat (V ₂₎ bare detektere V _ref. For å isolere V _ion, er V _ref subtrahert fra V _{1 ved hjelp av} en differensialforsterker (DA) (figur 4A).
7. Etter å ha fått en stabil baseline,bryteren til kalibrerings salines inneholdende definerte konsentrasjoner av ionet som skal måles.
   MERK: Figur 5A viser kalibrering av en dobbeltløpet kalium-sensitive microelectrode. I figur 6A, kalibrering av både et dobbeltløpet, samt en konsentrisk Na ⁺ -sensitive microelectrode er vist. Selv om vi ikke beskrive prosedyren her, merk at eventuelle forstyrrelser med andre ioner må testes før bruk av en bestemt ionophore (se også 3.4.).

Figur 5. Kalibrering av dobbeltløpet kalium-selektiv mikroelektroder. (A) Endring i spenningen til referanse sylinderen (V _ref) og K ⁺ -potensial (V _{K +)} i respons til endringer i badekaret K ⁺ konsentrasjon ( [K ^+] _b) som angitt. (B) Halv-logarithmic tomt på [K ^+] _b versus V _{K +.} Et lineært plott av data avslører en skråning på omtrent 56 mV. For illustrasjonsformål, ble spor glattet med en Sawitzky-Golay filter (bredde 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

8. Bestemme spenningsforløpet av det ion-selektive fat i respons til en kjent endring i ionekonsentrasjon. Plott data i en enkelt logaritmisk plott (Figur 5B, 6B) og bestemme skråningen. En ideell sensor følger et forhold beskrevet av Nernst-ligningen (se for eksempel ^13):

V: målt elektrodepotensial;
V _0: standard elektrodepotensial, for eksempel for en AgCl-ledning ved en temperatur på 298,15 K og et partialtrykk på 101,325 kPa (absolutt)
T: absolutt temperatur (i Kelvin)
z: kostnad på ion (+ 1 for kalium og natrium)
F: Faraday konstant (96.500 coulombs)
c ': ekstracellulære ionkonsentrasjon
c '': intracellulær ionkonsentrasjon

For praktiske formål, og den naturlige logaritmen omdannes til Nernst skråningen s som gjelder deretter for et gitt ion og temperatur:

MERK: For kalium og natrium elektroder, viser en ideell spennings respons på sensoren dermed en lineær skråning på ca -58 mV ved RT. Noen avvik fra dette kan aksepteres (figur 5B, 6B). Det er imidlertid viktig, at responskarakteristikker for en gitt elektrode ikke endrer seg vesentlig (med mer enn 10%, se nedenfor) før og etter et eksperiment.

Figur 6. Kalibrering av natrium-selektive mikroelektroder og sammenligning av dobbeltløpet med konsentriske elektroder (A) Top sporer. Endring i spenningen til referanse fat (V _ref) på en dobbeltløpet elektrode (svart stiplet kurve) og en konsentriske elektrode (grå kurve) som respons på endringer i badekaret Na ^{+ -konsentrasjon} ([Na ^+] _b) som angitt. Merk at spenningsreaksjoner av begge elektrodene er tilnærmet identiske. Bunn spor: Endringer i spenningen på Na ⁺ -potensial (V _{Na +)} av et dobbeltløpet elektrode (svart kurve) og en konsentrisk elektrode (grå kurve) som respons på endringer i [Na ^+] _b. (B) Halv logaritmisk plott av [Na ^+] _b versus V _{Na +} fra begge elektrodene. Lineære plott av dataene avslører en skråning på ca 48 mV for begge elektrodene.(C) Reaksjon av V _{Na +} av et dobbeltløpet (svart kurve) og en konsentrisk elektrode (grå kurve) til en rask forandring i [Na ^_+] f fra 152 mM til 70 mM. Legg merke til at responstiden for den konsentriske elektrode er betydelig raskere. For illustrasjonsformål, ble spor glattet med en Sawitzky-Golay filter (bredde 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

9. Fastslå responstiden av elektrodene, noe som avhenger av diameteren spissen, i form av tuppen, samt av tykkelsen på sensoren fase i elektrodespissen.
   MERK: I denne eksperimentelle satt opp og ansette en rask endring mellom ulike perfusjon salines (utvekslings gjennomført på elektroden tips innen 500 ms), dobbeltløpet natrium-sensitive microelectrodes nådd et stabilt potensial innenfor 9,7 ± 4,5 sek nårveksling fra 152 mM til 70 mM [Na ^{+] (n} = 6). Innenfor den samme innstilling, konsentriske natrium-følsomme mikroelektroder nådd et stabilt potensial i kun 0,8 ± 0,3 sek (n = 6) (figur 6C). Dette understreker overlegen tidsoppløsning på konsentrisk i forhold til dobbeltløpet mikroelektroder.

5. Disseksjon av Tissue

1. For generering av akutte skiver, bedøver mus av dagene etter fødselen 16-20 med CO ₂ og raskt overfalt (etter anbefaling fra Europakommisjonen publiserte i: Avliving av forsøksdyr, Luxembourg: Kontoret for offisielle publikasjoner De europeiske fellesskap, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Forbered hippocampus vevssnitt (tykkelse 250 mikrometer), etter en standard prosedyre (se for eksempel ^14).

6. eksperimentelle prosedyrer

1. Overfør en skive i den eksperimentelle kammer og fikse det med enrutenett.
2. Senk kalibrert ioneselektiv microelectrode på skiveoverflate og spidde det stratum radiatum av CA1 regionen til en dybde på omtrent 50 um med elektroden.
   MERK: Berører skive underlag med microelectrode fører til karakteristiske svingninger i ion-sensitive fat. Videre kan skade på cellene under impalement av vevet forårsaker svingninger i tillegg. Vent til baseline har stabilisert seg.
3. For press anvendelse av transmitter agonister, fylle en søknad pipette med forbindelse (f.eks 0,5 mm glutamat). Fest pipetten til en micromanipulator og par det til et trykk programmet på enheten.
4. Lavere søknad pipette inn i vevet, og forsiktig plassere den i nærheten av spissen av ione-selektive mikroelektrode (~ 20-40 um). Starte trykk program (f.eks 10 sek, 40 mbar) og registrere spenningsendringer som overvåkes av ioneselektiv microelectrode.
5. For bath bruk av narkotika, swkløe mellom ulike perfusjon salines for en definert varighet.
6. For å avslutte forsøket, nøye trekke ioneselektiv microelectrode fra vevet og registrere all drift i potensialer fra den opprinnelige null verdi som kan ha oppstått under lengre opptaksperioder.
7. Fjern skive preparatet fra badet og utføre en andre kalibrering av den ioneselektive mikroelektroden.
   MERK: Dette er nødvendig fordi elektrodespissen kan bli tilstoppet under sin bevegelse gjennom vevet. Således er det viktig å sikre at elektroden reagerer fremdeles riktig på endringer i ione-konsentrasjoner. Eksperimenter bør avvises dersom elektroden respons på en ti ganger endring i ionekonsentrasjon har falt med mer enn 10%. Godt arbeidselektroder kan i prinsippet anvendes på nytt i flere eksperimenter. Dette gjelder spesielt for konsentriske elektroder, som selv kan vare i flere dager. Det er imidlertid viktig, at kalibreringsprosedyrer er gjenrøyket før og etter hvert enkelt eksperiment for å sikre riktig funksjon av elektrodene.

7. Data Analysis

1. For å konvertere den spenningsforløpet av det ioneselektive elektrode til endringer i ekstracellulær ionekonsentrasjon, først konvertere ligning 2 for å bestemme endring i potensialet ΔV _ion (mV) som følger (vist her for K ⁺ -sensitive elektroder, gjelder analog prosedyre for Na ⁺ -sensitive elektroder):

V _{K +:} endringer i potensialet av valinomycin fat (mV)

s: Nernst skråning

K ^+] _B: baseline konsentrasjonen av kalium (i vårt tilfelle 2,5 mM K ⁺⁾

K ^+] _o: endringer i [K ^+] _o løpet av eksperimentet

2. Beregne aritmetisk gjennomsnitt av bakkene som stammer fra enkelt logaritmisk plott of kalibrering før og etter forsøket (se figur 5B, 6B, se punkt 4,8) for å hente "s".
3. For å beregne endringer i [K ^+] _o (Δ [K ^+] _o, i mm), omorganisere ligningen tre til:

Representative Results

For å overvåke [K ^+] _o og endringer i respons på eksitatoriske aktivitet, en dobbeltløpet kalium-selektive mikroelektrode ble satt inn i stratum radiatum av CA1-området. Noen få minutter etter impalement den ion-selektive fat av elektroden nådd en stabil basislinje (figur 7A), tilsvarende en [K ^+] _{o av} omtrent 2,8 mm, en verdi nær til [K ^+] i ACSF som brukes ( 2,5 mM). Bath anvendelse av 0,5 mM glutamat i 10 sek induserte en reversibel økning i [K ^+] _o på ca. 4 mm, etterfulgt av en underskridelse lavere enn utgangsverdien som beløper seg til ~ 0,7 mM (figur 7A). Senking av glutamat-konsentrasjonen til 0,4, 0,3, og 0,2 mM forårsaket en tilsvarende reduksjon i amplituden til både forbigående økning og underskridelse i [K ^+] _o (figur 7A).

oad / 53058 / 53058fig7.jpg "/>
Figur 7. Ekstracellulære kalium transienter som respons på eksitatoriske aktivitet. (A) [K ^+] _o transienter, som består av en økning etterfulgt av en underskridelse lavere enn utgangsverdien, indusert ved bad anvendelse av forskjellige konsentrasjoner av glutamat i 10 sek, som angitt. (B) Påvirkning av en perfusjon med glutamat reseptorblokkere (CNQX, 100 mikrometer, APV, 100 mm) og tetrodotoksin (TTX 0,5 mm) på [K ^+] _o transienter indusert av bad søknad på 0,5 mM glutamat i 10 sek. (C) Spontaneous [K ^+] _o transienter i nærvær av 0 mg ^{2 +} / BIC. Eksperimenter vist i AC ble utført ved hjelp av dobbeltløpet elektroder. For illustrasjonsformål, ble spor glattet med en Sawitzky-Golay filter (bredde 20). Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.

Tidligere forsøk har vist at slike glutamat-indusert [K ^+] _o-signaler ikke er vesentlig endret under påføring av TTX, og er dermed i stor grad uavhengig om åpning av spenningsstyrte natriumkanaler og nevronale aksjonspotensial generasjon ^15,16. For å studere mekanismene bak de observerte [K ^+] _o endringer som respons på glutamat, søkte vi glutamat reseptor blokkere, nemlig CNQX (100 pM; blokkering av AMPA-reseptorer) og APV (100 pM; blokkering av NMDA-reseptorer), i nærvær av TTX (0,5 mm). Ved bad perfusjon med disse blokkere, glutamatindusert [K ^+] _o endringene var nesten avskaffet, bekrefter deres avhengighet av åpningen av ionotrope glutamatreseptor kanaler som rapportert før (for eksempel ^17, figur 7B).

For ytterligere å demonstrere than relevans glutamatergic eksitasjon for generering av ekstracellulære [K ^+] signaler, skiver ble dynket med nominelt Mg ²⁺ -fri saltvann inneholder 10 mm bicuculline methiodide (0 mg ²⁺ / BIC). Dette avlaster spenningsavhengig ^Mg2 + -blokk av NMDA-reseptorer og demper inhibering ved blokkering av _{GABAA-reseptorer,} forårsaker spontan tilbakevendende epileptiform aktivitet i nettverket (f.eks ^18,19). Som forventet ^20, spontan, tilbakevendende [K ^+] _o transienter, ble beløper seg til om lag 1,5 mM oppdaget i 0 mg ²⁺ / BIC saltvann (figur 7C). Mellom disse responser, mindre [K ^+] _o transienter med en gjennomsnittlig amplitude på omtrent 0,2 mM oppstått (figur 7C).

I et andre sett av eksperimenter brukte vi [Na ^+] -sensitive mikroelektroder for å bestemme [Na ^+] _o forandringer fremkalt ved anvendelse avglutamat agonister. Her har vi også sammenlignet respons karakteristikker av dobbeltløpet og konsentriske microelectrodes ansette to forskjellige program paradigmer. [Na ^+] -sensitive mikroelektroder ble plassert inn i stratum radiatum i en dybde på omtrent 50 pM. Etter at en stabil basislinje var oppnådd, ble den glutamat-agonisten L-aspartat brukt per bad perfusjon (10 mM, 120 sec, bad perfusjon på 2,5 ml / min). Som observert tidligere ^21, anvendelse av aspartat forårsaket en langsom reduksjon i [Na ^+] _o av omtrent 15 mm, som varte ca 5 min og deretter begynte å komme tilbake til utgangspunktet (8A). Spesielt, mens de maksimale amplitudene og kinetikk av [Na ^+] _o signaler bestemt av begge elektroder var praktisk talt identiske under disse betingelser, konsentriske elektrodene oppviste en mer stabil basislinje, og et lavere lydnivå (figur 8A).

For å teste r esponse egenskaper ved de forskjellige elektroder under en mer rask program paradigme, vi trykk-glutamat påføres gjennom en fin pipette glass anbrakt i stratum radiatum i en avstand på 20 til 40 mikrometer fra spissen av den ioneselektive mikroelektroden. Som forventet ^21, anvendelse av glutamat (10 mM) i 200 ms forårsaket et fall i [Na ^+] _o (figur 8B). Topp amplitudene av [Na ^+] _o reduksjonen var i samme område for begge typer av elektroder (dobbeltløpet: 4,5 - 13,5 mM, n = 14; konsentrisk: 2,0 - 19,1 mM, n = 15). Men i motsetning til de resultater som ble oppnådd med langsom bad perfusjon (se ovenfor), ikke bare signal-til-støy-forhold, men også tidsforløpet av [Na ^+] _o signaler som detekteres av de to typer elektroder var signifikant forskjellig. Den gjennomsnittlige tiden til topp var 3,5 sek for dobbeltløpet og kun 1,3 sek for de konsentriske mikroelektroder.

ve_content "> Således er disse resultatene demonstrerer og bekrefter raskere responskinetikken av konsentriske vs. dobbeltløpet Na ⁺ selektive mikroelektroder, (se figur 6C og 8B), som også ble notert for Ca ²⁺ og pH-selektive motstykker ¹⁰ . I motsetning til den tidligere undersøkelsen, hvor kort-burst synaptisk stimulering ble utført for å fremkalle hurtig postsynaptisk-induserte ione-transienter, var det bare en tendens, men ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig maksimal amplituder mellom konsentriske og dobbeltløpet elektroder med vår søknad paradigme. Dette var sannsynligvis på grunn av det faktum at avstanden fra søknad pipette fra spissen av den ioneselektive microelectrode varieres med en faktor på to (20-40 um), og følgelig at den maksimale glutamat konsentrasjonen ved målregionen var ikke det samme i forskjellige eksperimenter, hindrer eksisterende forskjell i peak amplituder.

(A) Top spor: Endring i voltage av referanse fat (V _ref) på en dobbeltløpet elektrode (svart stiplet kurve) og en konsentrisk elektrode (grå kurve) som respons på endringer i badekaret Na ^{+ -konsentrasjon} ([Na ^+] _b) som angitt. Merk at spenningsreaksjoner av begge elektrodene er tilnærmet identiske. Bunn spor: Endringer i spenningen på Na ⁺ -potensial (V _{Na +)} av et dobbeltløpet elektrode (svart kurve) og en konsentrisk elektrode (grå kurve) som respons på endringer i [Na ^+] _b. (B) Halv logaritmisk plott av [Na ^+] _b versus V _{Na +} fra begge elektrodene. Lineære plott av dataene avslører en skråning på ca 48 mV for begge elektrodene. (C) Reaksjon av V _{Na +} av et dobbeltløpet (svart kurve) og en konsentrisk elektrode (grå kurve) til en rask forandring i [Na ^_+] f fra 152 mM til 70 mM. Legg merke til at responstiden for den konsentriske elektrode er vesentlig faster. For illustrasjonsformål, ble spor glattet med en Sawitzky-Golay filter (bredde 20).

Figur 8: Ekstracellulære natrium transienter som oppdages av dobbeltløpet og konsentriske elektroder.
(A) Forbigående endringer i V _ref og [Na ^+] _o indusert ved bad perfusjon med 10 mM aspartat i 120 sek, som angitt ved linjen. De øvre spor viser et opptak utført med en dobbeltløpet elektrode, ble de nedre spor innspilt med en konsentrisk elektrode. (B) Forbigående endringer i V _ref og [Na ^+] _o indusert av lokale trykk søknad med 10 mM glutamat for 0,2 sek, som angitt ved pilspiss. De øvre spor viser et opptak utført med en dobbeltløpet elektrode, ble de nedre spor innspilt med en konsentrisk elektrode.Prikkede røde linjer representerer lineære anfall av perioden mellom starten av signalet til sitt maksimum. Legg merke til at responstiden for den konsentriske elektrode er betydelig raskere under denne betingelse. For illustrasjonsformål, ble spor glattet med en Sawitzky-Golay filter (bredde 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Flytende bærebølge-basert, har ione-selektive elektroder blitt anvendt i årtier, og for mange ioner, meget spesifikke sensorer er tilgjengelige ^22-26. Når den brukes i det ekstracellulære rom (ECS) i virveldyr hjernepreparater, må en huske på, men at dette er en ganske invasiv teknikk: mens bredden på ECS er bare rundt 20-50 nm, diameteren av ion-selektive mikroelektroder er omtrent 1 mikrometer (dobbeltløpet elektroder) eller større (konsentriske elektroder). Tuppen av ioneselektive mikroelektroder vil således ikke bare skade vev under impalement av vevet, men også større ECS, favoriserer en undervurdering av ion-transienter. Til tross for disse fallgruvene, ekstracellulære ion transienter i respons til neuronal aktivitet er bemerkelsesverdig konsistent mellom ulike laboratorier ^7,8, attesterer til påliteligheten av denne metoden.

Ytelsen og egnethet ion-selektive elektroderer avhengig av deres følsomhet og selektivitet, som er definert av føleren cocktail («flytende membran ionofor") anvendt. Sensor cocktails inneholde en spesiell bæremolekyl, f.eks valinomycin for K ⁺ selektive microelectrodes som viser en høy selektivitet for kalium ^27. Likevel kan kryssreaksjon med andre ioner oppstå og må testes. Valinomycin viser en betydelig kryssreaktivitet for ammonium, som må tas i betraktning når man tolker resultatene (f.eks ^11,12). Videre, fordi den spenningsresponsen av de ionoforer følger en Nernstian atferd (jfr ligning 1), signal-til-støy-forhold og deteksjonsgrensen er avhengig av konsentrasjonen av det ion som skal måles. Således, mens små [K ^+] _o transienter fremkalle store spenningsendringer mot den lave grunnlinjen [K ^+] _o, liten [Na ^+] _o transienter er mye vanskeligere å oppdage mot high baseline [Na ^+] _o (se figur 5 og 6).

Utførelsen av ioneselektive elektroder blir også bestemt av den tidsmessig oppløsning, som i stor grad styres av den elektriske tidskonstant. Sistnevnte er i hovedsak bestemt av den aksiale motstanden i føleren, og ved den fordelte kapasitans langs lengden av pipetten, mellom de interne løsninger og det eksterne fluidet. I dobbeltløpet konfigurasjon, er motstanden stor, på grunn av den lange kolonne av backfilled ion sensor. For en gitt isolerende dielektrikum (i dette tilfelle borsilikatglass), blir kapasitansen styrt av den dielektriske tykkelsen. I dobbeltløpet elektroder, utgjør det dielektriske bredden til glassveggen av pipetten. Som glasset tynner nær spissen, faller det dielektriske bredde, og kapasitans øker. Disse faktorene kombineres for å fremstille elektroder med responstider som varierer fra flere hundre til flere millisekundersekunder, ettersom disse faktorene er variert.

En stor fordel med den konsentriske konstruksjon er at både den aksielle motstand og kapasitans til badet er sterkt redusert. De konsentriske pipettes shunts fleste av motstanden i backfilled ionebytter, slik at bare en levning i de siste par mikrometer før spissen. I tillegg er fyllingen løsning i løpet av konsentriske pipetten fysisk avstand fra badet, adskilt av tykkelsen av to glassvegger, noe som reduserer kapasitansen. Som vist tidligere ^10, den kombinerte effekt av redusert motstand og kapasitans er en forbedring i tidsmessig oppløsning på to størrelsesordener. I tilfelle av konsentriske Ca ²⁺ og pH-mikroelektroder, 90% responstider var så lav som 10-20 msek ^10. En beslektet fordel av den konsentriske konstruksjon er lavere lydnivå (se figur 8). På grunn av den sterkt redusert motstand, spenningstransienter fra en hvilken som helst valiumt støy minimaliseres. Dessuten er utvinningen av slike transienter hurtig, på grunn av den hurtig tidskonstant. Slike gjenstander er derfor liten og rask, og har en mindre forstyrrende effekt på fysiologiske opptak (jf figur 8).

Det er også ulemper ved den konsentriske teknikk. For det første er deres montasje mer komplisert og tidkrevende. En annen ulempe er behovet for å plassere et separat referanse microelectrode med sin spiss, medfører bruk av enten en separat mikromanipulator eller en spesialisert dual manipulator. Endelig kan dobbeltløpet mikroelektroder bli utvidet til en trippel løpet utforming, slik at deteksjon av to forskjellige arter ion samtidig ^28, som ikke er mulig for konsentriske elektroder.

De vanligste fallgruvene

Ineffektiv silanisering.

Det viktigste steget, og rektor hinder i fabrikasjon av Flytende-senseller basert ioneselektiv microelectrode er silanisering prosedyre. Når elektrodene unnlater å reagere på endringer i spesifikke ion konsentrasjon, eller reagere med et sub-Nernstian respons (dvs. godt mindre enn 58 mV per ti gangers forskjell konsentrasjon), er dårlig effekt av silanisering vanligvis årsaken. I vår erfaring, kan dette skje hvis luftfuktigheten er for høy eller for lav, typisk for forholdene på høyden av sommeren eller vinteren, henholdsvis. Hvis det er mulig å utøve en viss kontroll over fuktigheten i rommet, kan disse problemene overvinnes.

Elektrode motstanden er for høy.

Om nødvendig kan motstanden av ion-sensitive fat reduseres med avfasing. For dette formål utsettes sin spiss til en sterk stråle av et slipemiddel oppslemmet i vann i et par sekunder. Dette vil føre til at den ytterste spiss for å bryte og lavere motstand til den ønskede verdi.

Salt broer.

Saltbroer mellom ion og referanse fat resultere i dårlig eller ingen kontaktbare elektroder og kan dermed også i stor grad forvirre deres prestasjoner i kalibreringen. Som nevnt ovenfor (se punkt 1.6.), Er dette først og fremst et problem når dobbeltløpet theta glass er valgt, men er en sjelden forekomst når du bruker offset, vridd fat teknikken beskrevet her.

Med enkel fabrikasjon i tankene, kan den opprinnelige dobbeltløpet design av Lux ²⁹ ofte brukes lønnsomt. Denne metoden benytter forhånds fylling av ion og referanse tønner med saltløsninger, en rask eksponering til en silanløsning ved sin suge og utdriving fra spissen, som følge av innlemmelse av ionebytter, også via spissen (se ^30,31) . Disse elektroder kan fremstilles i omtrent 10 min, men deres dysestørrelse er typisk 4 um eller mer, og de er mer utsatt for å svikte i løpet av et eksperiment. I motsetning til dette, silanisering metoder som involverer eksponering av silan damp og varmeing kan produsere elektroder med mindre tips som siste dager, og noen ganger uker.

Til sammen er det flere protokoller og tilnærminger på hvordan å forberede ion-selektive mikroelektroder. Her har vi beskrevet to hoved prosedyrer for fabrikasjon av vridde dobbeltløpet samt konsentriske mikroelektroder som fungerer godt og pålitelig i våre laboratorier, med en samlet suksessrate på nær 100%. Viktigere, vil disse teknikkene være overførbar til måling av andre ioner arter, inkludert pH eller kalsium, og vil også være anvendelig for andre preparater enn hjernen, inkludert væskefylte hulrom eller væsker generelt. Sist, men ikke minst, ion-selektive microelectrodes tillater bestemmelse av ionekonsentrasjoner inni cellene. På grunn av sin relativt store størrelse spiss (~ 1 mm), det vil imidlertid være mulig bare i celler med en stor cellelegemet, for eksempel slik som befinner seg i virvelløse preparater ^28,32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abrasive	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries	1405059	Hilgenberg	Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the sensor of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the reference of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-200TF-15	Science Products	Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-120TF-10	Science Products	Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage		Custom-made	Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber		Custom-made	Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace		Heraeus	Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate		Custom-made	Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas		Custom-made	Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
Stereo microscope	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette puller	Model PP-830	Narishige	Concentric microelectrodes
Pipette puller	Model P-97	Sutter Instruments	Sensor of concentric microelectrodes
Pneumatic drug ejection system	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage	DT 25/M	Thorlabs
Two-component glue	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertical puller	Type PE-2	Narishige Scientific Instruments	With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage		Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid	Sigma aldrich	A9256	Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma aldrich	G1626	Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B	Fluka	60403	Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A	Fluka	71178	Based on ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure	Sigma aldrich	W3500