뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

Protocol

본 연구는 엄격한 하인리히 하이네 대학 뒤셀도르프, 독일의 제도적 지침에 따라,뿐만 아니라 유럽 공동체위원회 지침 (6백9분의 86 / EEC)을 실시 하였다. (: O52 / 05 제도적 행위 번호) 모든 실험은 하인리히 하이네 대학 뒤셀도르프, 독일의 동물 관리 및 사용 시설에서 동물 복지 사무소에 통보하고 승인했다. 독일의 동물 복지법에 따라 (Tierschutzgesetz는, 제 4 조 및 제 7), 뇌 조직의 사후 제거를위한 공식적인 추가 승인이 필요 없었다.

두 번 질주 이온 선택성 미소 전극 1. 준비

1. 필라멘트 두 보로 실리케이트 유리 모세관 제조 : 7.5 cm의 길이와 1.5 mm의 외경을 가진 하나는 6.5 cm의 길이 이상 1.0 mm의 외부 직경을 갖는 이온 성 배럴 위해 사용되고, 하나로 참조 배럴.
2. capil를 청소 다음 12 시간과 아세톤에 laries는 복근에 여러 번 헹군다. 에탄올하고 건조 할 수 있습니다. 전극은 지금 건조기에 저장 될 수있다.
3. 양쪽에서 함께 길고 짧은 모세관을 해결하기 위해 두 성분 접착제 또는 알루미늄 호일의 작은 스트라이프를 사용합니다. 60 ℃에서 1 시간 동안 노에서 이중 모세관을 가열한다. 이는 경화 공정을 가속. 데시 케이 터에 지금 전극을 저장합니다.
4. 선회 척으로 수직 풀러에 두 번 모세관 센터입니다. 유리가 180도 선회 척의 수평 회전을 허용하기에 충분히 부드럽고까지 부드럽게 코일을 가열한다. 이 단계 동안, 척 아래 초크와 모세관의 신장을 방지한다.
5. 냉각 후, 기계적 브레이크를 제거하고 두 개의 날카로운 두 번 질주 모세 혈관 (그림 1)의 결과로, 모세관을 당겨 제 2 가열 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 더블 - 모세관의 끝 직경은 1 ㎛에 가까워 야합니다.

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그림 이온 선택성 미소 전극 1. 건축. 이중 질주 미세 전극의 (A)의 사진. 예시 목적 나은 가시성은 참조 배럴 내부 액을 착색시켰다. 동심 미세 전극 및 대응하는 참조 전극 (B)의 사진. 동심 미세 전극의 끝은 그것의 왼쪽에 확대 표시됩니다. (A) 및 (B)에서, 피펫 팁에 이온 센서가 차지하는 공간이 포스트 채색된다. 하단에서 두 전극 타입의 팁 배열이 개략적으로 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 선회 척 수직 풀러를 사용할 수없는 경우, 이중 목적 이온 SELEC 준비세타 유리를 사용하여 수평 풀러의적인 미세 전극.
   1. 이를 위해, 세타 유리 밖으로 두 배럴 각각 두 개의 전극에서 발생하는 (1.5 mm, 길이 7.5 cm의 외경)을 당깁니다. 그 중 마크 하나는 나중에 참조 할 수 있도록 배럴 역할을합니다. 미래 이온 선택 배럴 역할을 아래에 설명 된 절차에 다른 유사한은 실란 화.
      주 : 이중 목적 쎄타 - 유리 전극의 제조가 꼬인 이중 목적 전극의 제조에 비해 훨씬 쉽다 동안 그들 사이 얇은 분리 유리 벽은 다공성지는 경향으로, 이들은 모두 배럴 사이의 상호 작용에 더 쉽다 자신의 최대한의 팁.
      주 : 센서 칵테일 (아래 참조), 소수성이기 때문에, 이후 이온 성 배럴의 내부 표면은 실란 화라는 처리에 의해뿐만 아니라 소수성되어야한다. 다음 단계에서 기재 한 바와 같이 들어, 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)은 (도 2)를 사용한다.

도 2는 실란 화 피펫. (A), 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 내측의 유리 표면의 Si-OH 그룹과 반응하여 소수성을 렌더링한다. (B) 왼쪽 사진은 전체 실란 화 유닛을 도시한다. HMDS를 포함하는 넓은 입구 병을 40 ℃로 설정된 가열 플레이트 위에 배치된다. 병 상단에, 모세 혈관 (CAP)를 운반하는 홀더 (PH)가 장착되어있다. 오른쪽 사진은 모세 혈관 (CAP)을 들고 피펫 홀더 (PH)의 확대를 보여줍니다. (C) 입구가 넓은 병에 장착으로 두 번 질주 (왼쪽) 또는 동심 (오른쪽) 모세 혈관 (모자)에 대한 맞춤형 피펫 홀더 (PH)의 개략적 인 측면도. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

7. 그냥 PU 전에lling 전극, 약을 채우십시오. 입구가 넓은 병에 20 ㎖의 HMDS. 주의 : HMDS는 흄 후드에서 사용하기위한 것입니다, 증기는 건강에 해로운! 병을 닫고 40 ℃로 가열 판에 사전 설정을 넣어. 200 ° C까지의뿐 후드하에 위치로를 예열.
8. 다음 절차를 수행하는 동안 그 실란 화를 방지하기 위해 증류수에 선단 기준 배럴을 채운다.
9. 특별 주문 제작 홀더 (그림 2B, 2C)에 그 끝이 위로 두 번 질주 모세관을 넣습니다. 무딘 오픈 엔드 홀더 (그림 2C, 왼쪽)의 바닥을 통해 자유롭게 도달해야한다. 그 후, 70 분간 예열 HMDS 함유 넓은 입 병에이 홀더를 배치했다.
   참고 : HMDS 증기 자유롭게 모세 혈관을 통과 할 수 있는지 확인합니다. 하나의 실란 화 과정에서, HMDS의 20 ㎖가 완전히 증발하지 않고, 병에 따라서 여러 번 사용될 수있다.
10. AfterwarDS는 두 시간 동안 예열로 금속 스탠드와에 모세 혈관을 전송합니다. 이 두 배럴을 건조합니다.
11. 실란 화 한 후, 사용할 때까지 건조 모세 혈관을 유지한다. 이전 절차는 총 약 3.5 시간이 필요하지만, 전극은 지금 몇 주 동안 데시 케이 터에 저장 될 수있다.
12. 실험적인 사용 일에, 이온 선택 센서 (도 1a)의 1-2 μL로 실란 배럴의 선단을 충전하여 이온 선택성 전극을 제조. 칼륨 성 미소 전극에 대해, 캐리어 발리 노마 이신 (Valinomycin)를 사용한다; 나트륨에 민감한 미소 전극에 대해, 캐리어로 ETH 157을 사용합니다.
13. 팁이 제대로 채우기 위해 이온 선택 센서 어렵게 매우 점성 것을 관찰한다.
14. HEPES 완충 식염수와 기준 배럴을 작성 (아래 참조).
    주 : 다른 더 단순한 삼투압 식염수가 또한 사용될 수 있지만, 우리는 생리 식염수를 사용하는 것을 선호의 조성물은 본질적으로 유사하다관류 식염수 (ACSF은 3.6을 참조하십시오.),이 누출 실험 중에 조직에 침투 할 수 있기 때문이다. 따라서, 이러한 염은 이온의 높은 농도가 사용 ACSF보다 결정될 포함하지 않는 것이 중요하다.
15. 이온의 높은 농도가 검출 될 포함 식염수 센서 백필. 따라서, (나트륨에 민감한 미소 전극 용) 100 mM의 염화나트륨 식염수 또는 (칼륨 민감한 미소 전극 용) 100 밀리미터의 KCl와 센서를 백필. 이 절차를 수행하는 동안 추가로 공기 방울을 삽입하지 않도록해야합니다.
16. 실란 화 과정이 성공하고 센서가 채워지면, 백필 (도 1A)에 대하여 명확하게 보이는 오목면을 형성하는 센서 표면을 관찰한다. 그렇지 않으면, 센서는 모세관 벽으로부터 후퇴 한 수와 팁 충전되지 않을 것이다. 이러한 전극은 작동하지 않을 것입니다.
17. (두 배럴로 염소화 실버 와이어를 삽입 센에 닿지 않도록주의SOR)과) 치과 왁스 (그림 1A 각 통을 밀봉.

2. 동심의 준비 이온 선택성 미소 전극

1. 외부 배럴, 필라멘트 (외부 직경 2.0 ㎜)와 7.5 cm의 길이로 얇은 유리 모세관을 사용합니다. 내통 들어, 필라멘트와 1.2 mm의 외부 지름과 10cm의 길이를 박벽 모세관을 가지고.
2. 12 시간 동안 아세톤에있는 모세 혈관을 청소합니다. 다음 복근 여러 번 헹군다. 에탄올하고 건조 할 수 있습니다. 전극은 지금 건조기에 저장 될 수있다.
3. 약 채 웁니다. 입구가 넓은 병에 20 ㎖의 HMDS. 주의! HMDS는 흄 후드에서 사용하기위한 것입니다, 증기는 건강에 위험하다. 병을 닫고 40 ℃로 가열 판에 사전 설정을 넣어. 200 ° C까지의뿐 후드하에 위치로를 예열.
4. 수평 풀러에 2.0 mm의 모세관을 넣고 짧은 테이퍼와 팁 diame와 모세 혈관에서 발생하는 잡아 당깁니다~ 4 μm의 (그림 1B)의 터.
5. 주문 제작, 특수 홀더 (그림 2B, 그림 2C)의 뭉툭한 끝 (오른쪽 그림 2C) 병의 공동으로 열리도록에 그 끝을 위로 당겨 아웃 2.0 mm의 모세관을 넣습니다. 이후 70 분 동안 예열 HMDS 함유 넓은 입 병이 홀더 상에 배치. HMDS 증기가 모든 모세 혈관을 통과 할 수 있는지 확인합니다.
6. 그 후, 두 시간 동안 예열로 금속 스탠드와에 모세 혈관을 전송합니다.
7. 실란 화 한 후, 사용할 때까지 건조 모세 혈관을 유지한다. 전 과정은 총 약 3.5 시간을 필요로하지만, 지금 몇 주 동안 데시 케이 터에 전극을 저장합니다.
8. 그냥 사용하기 전에, 실란 화 모세관 (그림 1B)에 센서 (0.2 μL)의 작은 금액을 입력합니다.
9. 내부 모세관을 준비하려면, 풀러에 작은 직경의 모세 혈관을 삽입하고 두 결과에 꺼내긴 테이퍼 날카로운 팁 (그림 1B)와 모세 혈관. 100 mM의 염화나트륨 (나트륨에 민감한 미소 전극) 또는 100 밀리미터의 KCl (칼륨 민감한 미소 전극) 식염수로 채 웁니다.
10. 센서 가득 된 커버로 만든 사용자 지정 빌드 스토퍼 위에 서로 라인에 직접 식염수로 채워진 모세관을 놓습니다. 더 큰 모세관에 작은 모세관에게 짧은 길을 삽입합니다.
11. 모델링 점토를 사용하여 다른 커버 슬립 위에 모세 혈관을 수정 현미경의 무대에 전송하고 100 배 배율을 사용하여 시각화. 그들의 팁 사이의 거리가 약 5 μm의 (도 1b)가 될 때까지 미세 조작기과 현미경의 스테이지의 미세 구동을 돌려 장착 유리로드의 도움으로, 서서히 내부 모세관 위에 외측 모세관을 전진.
12. 치과 용 왁스를 사용하여 내부에 모세관 외측 모세관의 개방 단부를 고정한다. 또한, 시아 노 아크릴 레이트의 작은 방울 (미친 접착제) 기능을 적용왁스의 tead.
    참고 : 물 작은 방울의 첨가는 접착제를 중합과 장소에 전극을 수정합니다. 내통에 염소화 실버 와이어를 삽입하고 치과 왁스 (그림 1B)로 밀봉.
13. 기준 전극을 준비하기 위해 필라멘트와 7.5 cm 긴 모세관 1.5 mm의 외부 직경을 가지고 수직 풀러으로 잡아 당깁니다. 팁 비교적 긴하지만 (팁 직경 ~ 1 ㎛) 너무 날카로운 있는지 확인합니다.
14. 상부 피펫을 버리고 낮은 척을 열고 약 5 mm 정도 낮은 피펫을 올립니다. 다시 척을 닫고 가열 코일 위 5mm에 대한 위치하는 하부 전극의 끝 부분까지 들어 올립니다. 코일을 가열하고 약 45 ° 옆으로 끝이 구부러 집게를 사용합니다. 낮은 피펫 약 1-2mm. 벤드는 다시 약 -45 °로 메인 샤프트 (그림 1B)로 다시 병렬로 끝을 지시합니다. 이 절차는 참조하지만의 팁의 근접 배치를 가능하게 할 필요가있다동심 전극에 NCE 전극.
15. HEPES 완충 식염수 (아래 참조)를 참조 배럴 채우기, 염소화 실버 와이어를 삽입하고 치과 왁스 (그림 1B)와 배럴을 밀봉.

3. 살리 네스

1. 100 mM의 KCl을 구성 칼륨 민감한 전극 (1.15을 참조하십시오.)의 백업 광고를 위해 식염수를 준비합니다. 나트륨에 민감한 전극의 백필에 대한 생리 식염수 100 mM의 염화나트륨으로 구성되어있다.
2. 125의 NaCl, 2.5의 KCl, 2 염화칼슘 _{2, 2 황산,} 1.25의 NaH ₂ PO _4, 25 HEPES를 적정 : (. 1.16을 참조 HEPES 완충 식염수) 참조 배럴의 백필을 위해 식염수를 준비 (MM)에 구성되어 NaOH로 7.4의 pH가 발생합니다.
3. 25 mM의 HEPES 구성되어 칼륨 성 전극들의 교정 및 150 mM의 염화나트륨의 KCl과 총 염을 제조, pH는 NMDG-OH (N- 메틸 -D- 글루 카민)를 7.4로 조정. 여기에서, 교정은 식염수를 1, 2, 4 또는 10 mm로 함유 하였다KCl을; ACSF 2.5 밀리미터의 KCl (그림 5)이 포함되어 있습니다.
4. 나트륨에 민감한 전극은 다음과 같이 교정 용 식염수를 준비; 25 HEPES, (3)의 KCl, NMDG-OH로 7.4로 조정하고 염화나트륨 160 NMDG-CL, pH를 총 (㎜ 단위). 70, 100, 130 또는 160 염화나트륨 (mm 단위)를 포함 식염수 보정을 수행합니다; ACSF 152 염화나트륨 (그림 6)이 포함되어 있습니다.
5. 다른 이온 센서, 교차 반응의 결정에 대한 예., pH는 고정 된 이온 농도와 추가 교정 식염수,하지만 변화의 pH를 준비합니다.
   참고 :이 절차는 본 연구에서 증명되지 않지만,이 문제 (예를 들어 ^{11, 12)을} 주소 이전 작업을 참조해야 바랍니다.
6. 95 % O _2, 5로 버블 (125)의 NaCl, 2.5의 KCl, 0.5 _CaCl2를,도 6의 MgCl _2, 1.25의 NaH ₂ PO _4, 26의 _NaHCO3 및 20 글루코오스 (mm 단위)으로 이루어지는 식염수 급성 뇌 조직 조각을 준비 산도의 결과 %의 CO _2,7.4.
7. (125)의 NaCl, 2.5의 KCl, 2 염화칼슘 _2, 1의 MgCl _2, 1.25의 NaH ₂ PO _4, 26의 _NaHCO3, 20 포도당, 95 버블 (mm 단위)로 구성된 인공 뇌척수액 (ACSF)에 뇌 조각에서 실험을 수행 7.4의 pH를 초래 %의 O ₂ 및 5 % CO2,.
8. 신경 세포와 신경 교세포의 자극, ACSF에 용해 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 mM의 글루타메이트 또는 10 MM의 L - 아스파 테이트를 함유 한 용액을 준비합니다. 압력 응용 프로그램의 경우, HEPES 완충 식염수에 10 mM의 글루타메이트를 녹인다.
9. 압력 응용 프로그램에 대한 응용 프로그램 피펫을 준비합니다. 필라멘트 (외부 직경 2.0 ㎜) 및 수평 풀러에 7.5 cm의 길이로 얇은 유리 모세관을 넣고 ~ 1 ㎛의 팁 직경 결과에 잡아 당깁니다.
10. 간질 활동의 유도를 들어, 10 μm의 bicuculline의 메티을 포함하는 마그네슘 - 무료 ACSF을 준비합니다.
11. 활동 전위의 발생을 억제하기 위해, 10 mM의 스톡 오디오 솔루션을 제조테트로도톡신의 이온 증류수 (TTX). 실험 동안, TTX 직접 0.5 μM의 최종 농도 초래할 ACSF에 첨가된다.
12. AMPA 수용체의 활성화를 방지하기 위해, 시아 노 - 퀴녹 살린 디온 디메틸 술폭 시드 (CNQX) (DMSO)의 50 mM의 스톡 용액을 제조 하였다. 실험하는 동안, 이것은 직접 100 μM의 최종 농도 초래할 ACSF에 첨가된다.
13. NMDA 수용체의 활성을 차단하는, 70 mM의 _NaHCO3을 2- 아미노 phosphonopentanoate (APV)의 50 mM의 스톡 용액을 제조 하였다. 실험하는 동안, 이것은 직접 100 μM의 최종 농도 초래할 ACSF에 첨가된다.

이온 선택성 미소 전극 4. 교정

1. 직접하기 전에 각 실험 후 이온 선택적 미세 전극을 보정합니다.
2. (미세 조작기에 전극을 부착하고 스테레오 현미경으로 배치 ACSF - 관류 실험 챔버에 삽입 그림 3 g> 4). 프리 챔버 (그림 4A, B)에 기준 전극을 배치합니다. 목욕 관류에 스위치, 흐름이 약 2 ml / 분 있는지 확인합니다.

그림 3. 실험 작업 공간. 녹음 장비는 실험 목욕, 미세 조작기, 고품질의 광학와 실체 현미경과 X / Y 번역 단계를 운반하는 진동 감쇠 테이블로 구성되어 있습니다. 실체 현미경은 문서 상업적 CCD 카메라를 갖추고있다. 또한, 국소 약물 애플리케이션 가압 장치가 사용된다. 기록 전극은 차동 증폭기 헤드 스테이지를 통해 연결된다. 디지털화 된 데이터 (A / D 변환기)는 컴퓨터와 함께 기록된다. 목욕 관류가 연동 마이크로 펌프에 의해 실현된다 (도시 생략).>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 레코딩 소프트웨어 A / D 컨버터, 차동 증폭기, 및 컴퓨터 스위치, 시동 (도 3, 4). 이온 성 배럴의 저항이 매우 높기 때문에 (10-20 GΩ; 아래 참조), 높은 입력 임피던스 특별한 전위계 증폭기를 사용하여 (= 10 _TΩ에서 R) 및 작은 바이어스 전류 (I _바이어스 = 50 fA로 - 1 PA).

그림 4. 전자 및 설정 실험의 공간 디자인. (A) 기록 장치의 개략도. 이중 질주 미세 전극 (파란색)과 동심 미세 전극 (적색)의 팁은 식염수로 채워진 실험 욕조에 배치되어있다. 목욕 기준 전극 개략적 나타낸다. poten 기준 배럴 반면 (V _2)에만 V _심판을 검출, 이온 선택 배럴 (V ₁₎ 전기장 전위 (V의 _REF)과 이온 전위 (V _이온)로 구성되어 검출 자유형. V _이온을 분리하기 위해, V의 _REF가 차동 증폭기 (DA)에 의해 V _(1)로부터 감산된다. 장소에 동심 미세 전극과 실험 단계의 (B) 지형. 실험 단계의 중심은 슬라이스 준비를 포함하는 실험 화장실로 구성되어 있습니다. 목욕을 땅에, 기준 목욕 전극은 관류 입구를 호스팅하는 사전 챔버에 잠겨있다. 무대 자체는 별도의 접지 커넥터가 접지되어있다. 동심 미세 전극 및 기준 전극은 미세 조작기에 의해 구동되는 별도 피펫 홀더에 의해지지된다. 미세 전극 및 기준 전극은 전자 증폭기의 선두 단에 연결된다.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 차동 증폭기 (그림 4)의 머리 단계의 각각의 입력에 염소화 실버 와이어를 연결합니다. 전극의 저항을 결정합니다. 기준 배럴의 저항이 30-100 MΩ 이온에 민감한 배럴의 저항을 10 ~ 20 GΩ 사이 사이에 있는지 확인하십시오.
5. 제로 전압 신호를 조정하고 녹음을 시작합니다.
6. 기준 배럴 반면 이온 선택 배럴 (V ₁₎ 전기장 전위 (V _심판)로 구성되어 있고, 이온 전위 (V _이온)에 의해 검출 된 전위 (V _2)에만 V의 _REF를 검색합니다. V _이온을 분리하기 위해, V의 _REF가 차동 증폭기 (DA) (도 4a)에 의해 V _(1)로부터 감산된다.
7. 안정적인 기준을 얻은 후,이온의 정의 농도를 포함하는 교정 식염수로 전환 측정한다.
   주 : 그림 5a는 이중 질주 칼륨 민감한 미세 전극의 교정을 보여줍니다. 도 6a의 교정에서 모두 두 번 질주뿐만 아니라 동심 나 ⁺ 민감한 미세 전극은 그림과 같습니다. 우리가 여기있는 절차를 설명하지 않지만, 다른 이온과 가능한 간섭이 특정 이온 운반체를 사용하기 전에 테스트 할 수 있어야합니다 (또한 3.4을 참조하십시오.).

그림 5. 두 번 질주 칼륨 선택적 미소 전극의 교정. (A) 참조 배럴 (V _심판)의 전압의 변화와 응답의 K ⁺ -potential (V _{K +)의} 목욕 K ⁺ 농도의 변화 ( [K ^+]는 _b)에 나타낸 바와 같이. (B) 하프V _{K +} 대 _B [K ^+]의 -logarithmic 줄거리. 데이터를 선형 플롯은 약 56 MV의 기울기를 보여준다. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky - 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 이온 농도의 변화에​​ 대응하여 공지의 이온 선택 배럴의 전압 응답을 결정한다. 플롯 하나의 로그 플롯의 데이터 (그림 5B, 6B)와 기울기를 결정합니다. 이상적인 센서는 네른스트 식에 의해 설명 된 관계는 다음 (예 ¹³ 참조) :

V : 전극 전위 측정;
V ₀ : 표준 전극 전위, AgCl을 와이어 예 : 298.15 K의 온도 및 101.325 kPa로의 분압 (절대)
T : (켈빈) 절대 온도
Z : 이온의 전하 (+ 1 칼륨과 나트륨의 경우)
F : 패러데이 상수 (96.500 쿨롱)
C ': 외 이온 농도
C ': 세포 내 이온 농도

실용적인 목적 및 자연 로그를 들어 주어진 이온 및 온도에 대한 다음 유효 네른스트 경사 s로 변환됩니다 :

주 : 칼륨 및 나트륨 전극 들어, 센서의 이상적인 전압 응답 따라서 RT에서 약 -58 MV의 선형 기울기를 나타낸다. 이 중 일부 편차는 (그림 5B, 6B) 허용 할 수 있습니다. 그것은 주어진 전극의 응답 특성 전과 실험 후 (10 % 이상, 아래 참조) 크게 변경하지 않는 것이, 그러나 필수적이다.

. 그림 6. 나트륨 선택적 미소 전극과 (가) 최고 추적을 두 번 질주 동심 전극의 비교 교정 : 이중 질주 전극의 기준 배럴 (V _심판)의 전압의 변화 (검은 점선 추적) 및 욕조 나 ^{+ 농도의} 변화에 대응하여 동심원 전극 (회색 추적) ([나 ^+는] _b)에 나타낸 바와 같이. 양 전극의 전압 응답 사실상 동일하다. 바닥 흔적 : 이중 질주 전극 (블랙 추적)와 [나 ^+] _B 변화에 대응 동심 전극 (회색 추적)의 나 ⁺ -potential (V _{나 +)의} 전압의 변화. 양 전극의 V _{나 +} 대 _B (B) [나 ^+]의 하프 로그 플롯. 데이터의 선형 그래프는 양 전극에 대한 약 48 MV의 기울기를 알 수있다.70 밀리미터에 152 밀리미터에서 _B를 두 번 질주 (블랙 추적)의 V _{나 +의} (C) 응답하고, [나 ^+]의 빠른 변화에 동심 전극 (회색 추적). 동심 전극의 응답 시간이 현저하게 빠르다 참고. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky - 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9. 전극 팁의 상기 센서 상에 두께뿐만 아니라, 팁 직경에 팁의 형태를 좌우 전극의 응답 시간을 결정한다.
   참고 :이 실험에서 설정하고 (500 밀리 초 내에 전극의 끝에서 완성 교환) 다른 관류 식염수 사이에 급격한 변화를 채용, 더블 질주 나트륨에 민감한 미세 전극은 9.7 ± 4.5 초 때 내에서 안정적인 가능성에 도달152 mM 내지 70 mM의 [나 ^+]로 전환 (N = 6). 같은 설정 내에서 동심 나트륨에 민감한 미세 전극은 0.8 ± 0.3 초 (N = 6) (그림 6C) 내에서 안정적인 잠재력을했다. 이것은 두 번 질주 미소 전극에 비해 동심의 우수한 시간 해상도를 강조한다.

조직 5. 해부

1. 실험 동물의 안락사, 룩셈부르크 : 급성 조각의 생성, 출판 (해고 유럽위원회의 권고에 따라 신속하게 _{이산화탄소와} 출생 후의 일 16 ~ 20의 쥐를 마취시키다과 유럽 공동체, 1997 년 공식 간행물 용 Office; ISBN 92-827-9694-9).
2. 표준 절차 (참조 예 ¹⁴⁾ 다음 해마 조직 슬라이스 (두께 250 μm의)를 준비합니다.

6. 실험 절차

1. 실험 챔버에 슬라이스를 전송하고 그것을 해결그리드.
2. 슬라이스 표면에 교정 이온 선택적 미세 전극을 내리고 약 50 μm의 전극과의 깊이에 CA1 지역의 지층 radiatum을 찌른다.
   참고 : 미세 전극과 조각 표면을 만져 이온에 민감한 배럴의 특성 변동에 연결됩니다. 또한, 조직의 꿰 뚫기 동안 세포의 손상도 변동됩니다. 베이스 라인이 안정 될 때까지 기다립니다.
3. 송신기 작용제의 압력 응용 프로그램의 경우, 화합물 (예를 들어, 0.5 mM의 글루타메이트)를 사용하여 응용 프로그램 피펫을 입력합니다. 가압 장치에 미세 조작기 커플을에 피펫을 연결합니다.
4. 조심스럽게 낮은 응용 프로그램 조직에 피펫과 이온 선택적 미세 전극 (~ 20 ~ 40 μm의)의 팁의 근접에 넣습니다. 압력 응용 프로그램 (예를 들어, 10 초, 40 밀리바)와 이온 선택적 미세 전극에 의해 모니터링으로 기록 전압 변화를 시작합니다.
5. 약물의 목욕 응용 프로그램의 경우, SW정의 된 기간 동안 다른 관류 식염수 사이에 가려움.
6. 실험을 종료하려면, 조심스럽게 조직에서 이온 선택적 미세 전극을 철회하고 장시간 녹음 기간 동안 발생했을 수있는 원래의 제로 값에서 전위에​​있는 드리프트를 기록.
7. 화장실에서 슬라이스 준비를 제거하고 이온 선택적 미세 전극의 두 번째 보정을 수행합니다.
   참고 : 전극의 끝 부분이 조직을 통해 이동하는 동안 막힌 얻을 수 있기 때문이 필요합니다. 따라서, 전극은 여전히​​ 이온 농도의 변화에​​ 적절히 응답하는 것을 보장하는 것이 필수적이다. 이온 농도에서 10 배 변화에 대한 전극의 반응이 10 % 이상 떨어진 경우, 실험은 거부한다. 잘 작동 전극은 원칙적으로 여러 실험에서 재사용 될 수있다. 이것은 심지어 며칠 동안 지속될 수 있습니다 동심 전극, 특히 사실이다. 이는 필수적인 그러나, 교정 절차가 다시 아르전극의 적절한 기능을 보장하기 전과 후에 각각의 단일 실험이 반복되고.

7. 데이터 분석

1. 세포 외 이온 농도 변화에 따른 이온 선택성 전극의 전압 응답을 변환하기 위해, 제 K ⁺ 과민 전극 여기 입증 전위 ΔV _이온 (MV)는 다음과 같이 (의 변화를 결정하기 위해 수학 식 2를 변환, 아날로그 절차 적용 나)는 민감한 전극 ⁺ :

_{K +} V : 배럴 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 전위의 변화 (MV)

S : 네른스트 경사

K ^+] _B : 칼륨의 기준 농도 (우리의 경우 2.5 mM의 K ⁺⁾

K ^+] _O : [K ^+] 변화 _O 실험 중

2. 단일 대수 플롯으로부터 유도 슬로프의 산술 평균을 계산 O전과 실험 후 교정 F] "S"를 검색 (참조 그림 5B, 6B는 점 4.8 참조).
3. [K ^+] _O (MM에서 Δ [K ^+] _O를,)에 식 (3)을 재 배열 변화를 계산하려면 :

Representative Results

모니터링하려면 [K ^+]는 _O 및 변경은 내부에 흥분성 활동에 대한 응답으로, 이중 질주 칼륨 선택적 미세 전극은 CA1 영역의 지층 radiatum에 삽입되었다. 몇 분 꿰 뚫기 후에 전극의 이온 선택 배럴은 약 2.8 mm의 사용 ACSF의 [K ^+]에 가까운 값 _(아 [K ^+]에 대응하는, 안정한 기준선 (도 7a)에 도달 2.5 mm)이다. 10 초 동안 0.5 mM의 글루타메이트의 목욕 응용 프로그램은 ~ 0.7 밀리미터 (그림 7A)에 달하는 기준선 아래 언더 다음, 약 4 mm 정도 _O를 [K ^+]에서 가역적 인 증가를 유도. 0.4, 0.3 글루타메이트 농도를 낮추고, 0.2 mm의 일시적 증가 [K ^+] _오 (그림 7A)에 언더 모두의 진폭에 대응 감소를 일으키는 원인이되었다.

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그림 흥분성 활동에 응답 7. 세포 외 칼륨 과도. (A) [K ^+] _오 과도, 지시 된 바와 같이 10 초 동안 글루타메이트의 서로 다른 농도의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도 된 기준 아래 언더 다음의 증가, 구성. (B) 글루타메이트 수용체 차단제와 관류의 영향 (CNQX, 100 μM, APV, 100 μM)과 테트로도톡신 (TTX 0.5 μM) [K ^+] _O 과도에 10 초 동안 0.5 mM의 글루타메이트의 목욕 응용 프로그램에 의해 유도. 0Mg ²⁺ / BIC의 존재 (C) 자발적인 [K ^+] _오 과도. AC에 표시된 실험은 두 번 질주 전극을 사용하여 수행 하였다. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky - 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. 카스티하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK.

이전 실험은 글루타메이트에 의한 [K ^+] _{O 신호가} 크게 TTX의 응용 프로그램 중 변경되지 것을 보여, 따라서 전압 문이 나트륨 채널과 신경 활동 전위 세대 ^{(15, 16)의} 개방에 거의 독립적있다. 글루타메이트에 반응하여 관찰 된 [K ^+] _{O 변화를} 기본 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 글루타메이트 수용체 차단제, 즉 CNQX (100 μM; AMPA 수용체 차단제) 적용 및 APV를 (100 μM; NMDA 수용체 차단제)의 존재하에 TTX (0.5 μM). (도 7B 예를 들어, ^17)이 차단제 목욕 관류시, 글루타메이트에 의한 [K ^+] 변화 _o를하기 전에보고 된 이온 성 글루타메이트 수용체 채널의 개방에 대한 의존도를 확인, 사실상 폐지했다.

더 T를 보여주기 위해세포의 생성을위한 글루타메이트 여기의 그는 관련성 [K ^+] 신호, 조각은 명목상의 Mg ²⁺ - 무료 식염수 10 μm의 bicuculline의 메티 (0Mg ²⁺ / BIC)를 포함하여 관류 하였다. 이는 NMDA 수용체의 전압 의존성의 Mg ²⁺ - 블록을 완화하고 (예 : ^18,19) 네트워크에서 자발적인 간질 재발 활동을 일으키는, GABA _수용체를 차단함으로써 억제를 감쇠시킨다. 예상대로 ^20, 자연, 재발 [K ^+] _오 과도, 약 1.5 밀리미터에 달하는이 0Mg ²⁺ / BIC 식염수 (그림 7C)에서 검출되었다. 약 0.2의 평균 진폭이 응답 사이의 작은 [K ^+] _오 과도 전월 (그림 7C)를 발생했습니다.

제 2 세트의 실험에서는, 도포에 의해 유발 [나 ^+] _{O 변화를} 결정하기 위해 [나 ^+] 민감한 미소 전극을 사용글루타민산 작용제. 여기, 우리는 두 개의 서로 다른 응용 프로그램의 패러다임을 사용하는 더블 질주과 동심 미소 전극의 응답 특성을 비교 하​​였다. [나 ^+]는 민감한 미소 전극은 약 50 μm의 깊이의 지층 radiatum에 위치했다. 안정한 기준선을 달성 한 후, 글루타메이트 작용제 L 아스파라긴산은 (2.5 ㎖ / 분으로 10 mm의 120 초, 목욕 관류) 목욕 관류 당 도포 하였다. 이전 ²¹ 관찰, 아스 파르 테이트의 응용 프로그램은 약 5 분을 지속 한 후베이스 라인에 다시 (그림 8A)를 복구하기 시작 약 15 밀리미터에 의해 _O를 [나 ^+]에 느린 감소를 일으키는 원인이되었다. 양 전극에 의해 결정 [나 ^+] _{O 신호의} 피크 진폭과 동력학은 이들 조건 하에서 거의 동일했다하면서 특히, 동심 전극보다 안정한 기준선 및 낮은 잡음 레벨 (도 8a)를 나타냈다.

R을 테스트하려면 더 빠른 애플리케이션 패러다임에서 다른 전극의 특성을 저 응답, 우리는 이온 선택적 미세 전극의 끝에서 20 ~ 40 ㎛의 거리에서 지층 radiatum에 위치 미세 유리 피펫을 통해 글루타메이트를-인가 압력. ⁽²¹⁾ 예상대로, 200 MS에 대한 글루타메이트의 응용 프로그램 (10 mM)을 [나 ^+] _O (그림 8B)의 저하를 일으키는 원인이되었다. [나 ^+] _{O 감소의} 피크 진폭이 전극의 두 가지 유형에 대해 동일한 범위에 있었다 (:; : 19.1 밀리미터, N = 15 - - 2.0 동심 13.5 밀리미터, N = 14 4.5을 두 번 질주). 그러나, 느린 목욕 관류 (위 참조), 신호 대 잡음비, 또한 전극의 두 가지에 의해 검출 [나 ^+] _{O 신호의} 시간 경로뿐만 얻어진 결과와 대조적 크게 달랐다. 피크 평균 시간은 동심 미소 전극의 질주 - 더블, 1.3 초 3.5 초였다.

ve_content "> 따라서, 이러한 결과를 보여 주 및 대 동심을 두 번 질주 나 ⁺ -selective 미소 전극의 빠른 반응 속도론을 확인, (참조 그림 6C 및도 8b)으로는 CA의 유명했다 ²⁺ pH를 선택적 대응 ⁽¹⁰⁾ . 짧은 버스트 시냅스 자극이 빠른 시냅스에 의한 이온 과도를 연상하기 위해 수행되었던 이전의 연구와는 달리, 단지 경향이 있지만, 우리의 응용 프로그램과 동심을 두 번 질주 전극 사이의 평균 피크 진폭에서 유의 한 차이가 있었다 패러다임. 이는 사실에 아마이었다 그 결과적으로 두 개 (20 ~ 40 μm의)의 인자에 의해 변경 이온 선택 미세 전극의 팁으로부터 애플리케이션 피펫의 거리, 즉 타깃 영역에서 최대 글루타메이트 농도 피크 진폭의 기존 차를 막고, 다른 실험에서 같은 아니었다.

(가) 위쪽 추적 : 볼타의 변화를이중 질주 전극 (검은 색 점선 추적)와 욕조 나 ^{+ 농도의} 변화에 따라 동심 전극 (회색 추적)의 기준 배럴 (V _심판)의 GE ([나 ^+는] _b)에 나타낸 바와 같이. 양 전극의 전압 응답 사실상 동일하다. 바닥 흔적 : 이중 질주 전극 (블랙 추적)와 [나 ^+] _B 변화에 대응 동심 전극 (회색 추적)의 나 ⁺ -potential (V _{나 +)의} 전압의 변화. 양 전극의 V _{나 +} 대 _B (B) [나 ^+]의 하프 로그 플롯. 데이터의 선형 그래프는 양 전극에 대한 약 48 MV의 기울기를 알 수있다. 70 밀리미터에 152 밀리미터에서 _B를 두 번 질주 (블랙 추적)의 V _{나 +의} (C) 응답하고, [나 ^+]의 빠른 변화에 동심 전극 (회색 추적). 동심 전극의 응답 시간이 크게 FAS 유의터. 예시를 위해, 트레이스 Sawitzky - 골 레이 필터와 평활화 된 (폭 20).

그림 8 : 두 번 질주와 동심 전극에 의해 검출 된 세포 외 나트륨 과도.
(A) 과도 V _심판의 변화와 [나 ^+] 막대로 나타낸 바와 같이 _O 120 초 동안 10 mM의 아스 파르 테이트 목욕 관류에 의해 유도. 상단 트레이스는 이중 질주 전극 수행 기록, 낮은 흔적 동심 전극을 사용하여 기록 하였다 보여준다. (B)에 화살표로 표시된 바와 같이 0.2 초 동안 10 mM의 글루타메이트 현지 압력 응용 ​​프로그램에 의해 유도 _O를 V _심판와 [나 ^+]에 과도 변경됩니다. 상단 트레이스는 이중 질주 전극 수행 기록, 낮은 흔적 동심 전극을 사용하여 기록 하였다 보여준다.빨간 점선 라인은 최대로 신호의 시작 사이의 시간 선형 발작을 나타낸다. 동심 전극의 응답 시간이이 조건에서 상당히 빠르다는 것을주의. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky - 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

액체 캐리어 기반이, 이온 선택성 전극이 성공적으로 수십 년 동안 많은 이온을 위해 사용되어왔다, 매우 구체적인 센서는 ^{22 ~ 26 사용할} 수 있습니다. ECS의 폭은 단지 약 20 내지 50 nm 인, 선택적 이온의 직경 인 동안 : 척추 뇌 제제의 세포 외 공간 (ECS)에서 사용되는 경우, 하나의 문제는 상당히 침습적 방법이 있다는 것이 유념해야 미소 전극은 약 1 ㎛ (더블 질주 전극) 이상 (동심 전극)입니다. 이온 선택성 미소 전극의 끝은 이렇게뿐만 아니라 조직의 자신의 꿰 뚫기 동안 조직을 손상시킬뿐만 아니라, 이온 과도의 과소 평가를 선호, ECS을 확대 할 것이다. 이 함정에도 불구하고, 신경 세포의 활동에 응답 세포 외 이온 과도은이 방법의 신뢰성을 입증 다른 실험실 ^{7, 8,} 사이 현저하게 일치한다.

이온 선택성 전극의 성능 및 적합성사용되는 센서 칵테일 ( '액체 막 이온 운반체')에 의해 정의되는 자신의 감도와 선택도에 따라 달라집니다. 센서 칵테일 칼륨 ^(27)에 대한 높은 선택성을 나타내는 K ⁺ -selective 미소 전극을 위해 발리 노마 이신 (Valinomycin) 예를 들어, 특별한 캐리어 분자가 포함되어 있습니다. 에도 불구하고, 다른 이온과 교차 반응이 발생할 수 있으며, 테스트해야합니다. 발리 노마 이신 (Valinomycin)는 결과를 해석 할 때 고려되어야 암모늄 대한 상당한 교차 반응 (예, ^{11, 12)를} 나타낸다. 이오 노 포어의 전압 응답 Nernstian 동작 (참조, 수학 식 1)을 따르기 때문에 또한, 신호 대 잡음비와 검출 임계 값이 측정되는 이온의 농도에 의존한다. 따라서, 동안 작은 [K ^+] _오 과도 과도 훨씬 더 어려운 인사에 대해 감지 할 수있는 _O를 낮은 기준 [K ^+] _오, 작은 [나 ^+]에 대한 큰 전압 변화를 보여주고GH 기준 [나 ^+] _O (참조 그림 5, 6).

이온 선택성 전극의 성능은 대부분의 전기 시정이 적용됩니다 시간적 해상도에 의해 결정된다. 후자는 주로 센서의 축 방향의 저항에 의해 결정되고, 내부 용액 및 외부 사이의 유체 피펫의 길이를 따라 분산 커패시턴스에 의해된다. 이중 목적 구성에서, 저항은 백필 이온 센서의 컬럼 길이로 인해 높다. (이 경우 붕규산 유리) 지정된 절연 유전체의 경우, 용량은 유전체 두께의 적용을받습니다. 이중 목적의 전극에서, 유전체층의 폭은 피펫의 유리 벽에 달한다. 유리 선단 부근 얇아 같이, 유전체 폭이 떨어지는 및 용량이 증가한다. 이러한 요인은 수백 밀리 초에서 몇 범위 응답 시간 전극을 생성하기 위해 결합초, 이러한 요인은 다양하다.

동심 설계의 주요 장점은 축 및 저항 욕 용량 모두 크게 감소된다는 것이다. 팁 전에 마지막 몇 마이크로 미터 만 남은 떠나는 채워서 이온 교환기의 저항의 대부분 동심 피펫 션트. 또한, 동심 피펫 내의 도금액 물리적 용량을 크게 줄일 수 개의 유리 벽의 두께에 의해 분리 조로부터 이격된다. ⁽¹⁰⁾ 이전에 도시 된 바와 같이, 감소 된 저항 및 커패시턴스의 결합 된 효과는, 2 차의 크기의 시간적 해상도의 향상이다. 동심 ^칼슘하여 pH 미소 전극의 경우 90 %의 응답 시간은 낮은 밀리 10-20 : ^10이었다. 동심 디자인 관련 장점은 낮은 노이즈 레벨 (참조 그림 8)입니다. 어떤 수면제에서 크게 감소 저항에 전압 과도 때문에T 소음은 최소화된다. 또한, 이러한 과도로부터 회복하기 때문에 빠른 시간 상수, 빠르다. 이러한 유물 따라서 작고 빠른, 그리고 생리 학적 기록 (참조 그림 8)에 덜 파괴적인 영향을 미친다.

동심 기술의 단점도 있습니다. 우선, 이들 어셈블리는 더 복잡하고, 시간 소모적이다. 두 번째 단점은 별도의 micromanipulator 또는 특수한 이중 매니퓰레이터 하나의 사용을 수반하는 그 팁 별도 기준 미세 전극을 배치 할 필요가있다. 마지막으로, 이중 목적 미소 전극 동심 전극 용 불가능 동시에 ^28에서 두 개의 서로 다른 이온 종의 검출을 가능하게 트리플 질주 설계로 확장 될 수있다.

가장 일반적인 함정

비효율적 인 실란 화.

모든 액체 SENS의 제조에있어서 가장 중요한 공정 및 주요 장애물또는 기반 이온 선택적 미세 전극은 실란 화의 절차입니다. 전극이 특정 이온 농도의 변화에 반응, 또는 서브 Nernstian 응답 (10 배 농도의 차이에 따라, 즉, 58도 미만 MV)에 대응하지 않을 때, 실란 화의 불량한 효능은 일반적 원인이다. 대기 습도가 여름 또는 겨울의 높이에서 조건의 전형적인, 너무 높거나 너무 낮은 경우 우리의 경험에 의하면,이 각각 발생할 수 있습니다. 그것은 실내 습도 일부 제어 발휘 가능한 경우, 이러한 문제는 극복 할 수있다.

전극 저항이 너무 높다.

필요한 경우, 이온 성 배럴의 저항은 베벨함으로써 감소 될 수있다. 이를 위해 몇 초 동안 물에 현탁 연마제 강한 제트 선단을 노출. 이것은 그것의 최상의 팁 깨고 원하는 저항 값을 저하시킬 것이다.

소금 다리.

소금이온 및 참조 배럴 사이의 다리는 잘못 또는 없음 - 응답 전극을 초래할 따라서도 크게 교정에서의 성능을 혼동 할 수 있습니다. (포인트 1.6 참조.) 상술 한 바와 같이, 이는 이중 목적 세타 유리가 선택 문제는 주로하지만 여기에 설명 오프셋 꼬인 배럴 기법을 사용할 때 드문하다.

염두에두고 제작의 용이성과 함께, 럭스 ^(29)의 원래 더블 질주 디자인은 종종 유익하게 사용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 팁을 통해, 이온 교환기의 도입에 의해 다음, 소금 솔루션, 끝에서의 흡입 및 퇴학으로 실란 솔루션을 빠르고 노출 이온 및 참조 배럴의 사전 충전을 활용 ^{(30, 31 참조)} . 이 전극은 약 10 분으로 제작하지만, 자신의 팁 크기는 일반적으로 4 ㎛ 이상을 그리고 그들은 실험 기간 동안 실패 할 경향이있다 할 수있다. 대조적으로, 그 방법은 실란 화 실란 증기 및 열에 대한 노출을 포함ING는 작은 일 마지막 팁, 때로는 주와 전극을 생성 할 수 있습니다.

함께 찍은 여러 프로토콜이있다 이온 선택성 미소 전극을 준비하는 방법에 접근한다. 여기, 우리는 가까운 100 %의 성공률로, 우리의 실험실에서 잘 안정적으로 작동 트위스트 질주 더블뿐만 아니라 동심 미소 전극의 제조를 위해 두 가지 방법을 설명했다. 중요한 것은, 이들 기술은 산도 또는 칼슘 이온을 포함하는 다른 종의 측정에 양도 할 것이며, 또한 일반적으로 유체로 채워진 캐비티 또는 체액을 포함한 뇌 이외의 제제에 적용 할 수있을 것이다. 마지막으로,하지만 적어도, 이온 선택성 미소 전극은 세포 내부의 이온 농도의 결정을 할 수 있습니다. 상대적으로 큰 팁 크기 (~ 1 ㎛)의 때문에,이 뜻은, 그러나, 무척추 준비 ^{28, 32에서} 발견 된 같은 단지 예를 들어 큰 세포체와 세포에서 가능하다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abrasive	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries	1405059	Hilgenberg	Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the sensor of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the reference of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-200TF-15	Science Products	Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-120TF-10	Science Products	Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage		Custom-made	Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber		Custom-made	Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace		Heraeus	Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate		Custom-made	Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas		Custom-made	Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
Stereo microscope	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette puller	Model PP-830	Narishige	Concentric microelectrodes
Pipette puller	Model P-97	Sutter Instruments	Sensor of concentric microelectrodes
Pneumatic drug ejection system	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage	DT 25/M	Thorlabs
Two-component glue	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertical puller	Type PE-2	Narishige Scientific Instruments	With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage		Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid	Sigma aldrich	A9256	Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma aldrich	G1626	Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B	Fluka	60403	Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A	Fluka	71178	Based on ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure	Sigma aldrich	W3500