Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dobbeltløbet og koncentrisk Mikroelektroder til måling af Ekstracellulær Ion Signaler i hjernevæv

Published: September 5, 2015 doi: 10.3791/53058
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Departments of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra Heinrich Heine University Düsseldorf, Tyskland, samt Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv (86/609 / EØF). Alle forsøg blev meddelt og godkendt af Animal Welfare Office på Animal Care og brug Facility af Heinrich Heine University Düsseldorf, Tyskland (institutionel handling nummer: ø52 / 05). I overensstemmelse med den tyske dyreværnsloven (Tierschutzgesetz, artikel 4 og 7), var nødvendig ingen formel yderligere godkendelse for post mortem fjernelse af hjernevæv.

1. Fremstilling af dobbeltløbet Ion-selektive Mikroelektroder

  1. Forbered to borsilicatglashulsfærer kapillærer med filament: et med en længde på 7,5 cm og en ydre diameter på 1,5 mm, der skal anvendes til ion-følsomme tønde, og et med en længde på 6,5 cm og en ydre diameter på 1,0 mm for den senere henvisning tønde.
  2. Rengør capil laries i acetone i 12 timer, og derefter skylles flere gange med abs. ethanol og lad dem tørre. Elektroder kan nu opbevares i en ekssikkator.
  3. Brug lim to-komponent eller en lille stribe af aluminiumsfolie at fastsætte en lang og en kort kapillar sammen i begge ender. Varm dobbelt-kapillær i en ovn ved 60 ° C i 1 time. Dette accelererer hærdeprocessen. Opbevar elektroderne nu i en ekssikkator.
  4. Centrer dobbelt-kapillar ind i en lodret aftrækker med en drejelig borepatron. Varm spolen forsigtigt, indtil glasset er blødt nok til at tillade en vandret rotation af omdrejende værktøjsholderen ved 180 °. Under dette trin, forebygge forlængelse af kapillær med en chock under værktøjsholderen.
  5. Efter afkøling fjernes mekanisk pause og anvende en anden opvarmning protokol til udtrække kapillarrøret, hvilket resulterer i to skarpe, dobbeltløbet kapillærer (figur 1). Spidsen diameter på en dobbelt-kapillær bør være tæt på 1 um.
ve_content "> Figur 1
Figur 1. Arkitektur af ion-selektive mikroelektroder. (A) Fotografi af en dobbeltløbet mikroelektrode. Til illustration formål og bedre synlighed blev væsken inde i henvisningen tønde tonet. (B) Fotografi af en koncentrisk mikroelektrode, og den tilsvarende referenceelektrode. Spidsen af ​​koncentriske mikroelektrode er vist forstørret på sit venstre. I (A) og (B), rummet besat af ion sensor i spidserne af pipetterne er post-farvet. Nederst er spidsen arrangement af både elektrode typer vist skematisk. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis en lodret aftrækker med drejelig chuck ikke er tilgængelig, udarbejde en dobbeltløbet ion-SELECtive mikroelektrode i vandret aftrækker hjælp theta glas.
    1. Med henblik herpå trækkes theta glas (udvendig diameter på 1,5 mm, længde 7,5 cm) ud til at resultere i to elektroder med to tønder hver. Mark en af ​​dem til at tjene som fremtidig reference tønde. Silaniseret den anden svarer til proceduren beskrevet nedenfor for at fungere som den fremtidige ionselektiv tønde.
      BEMÆRK: Mens fremstillingen af ​​dobbeltløbet theta-glaselektroder er langt lettere end fremstilling af snoede dobbeltløbet elektroder, er de mere tilbøjelige til cross-virkning mellem begge løb den tynde adskillende glasvæg mellem dem tendens til at være porøs i deres yderste spids.
      BEMÆRK: Da sensoren cocktail (se nedenfor) er hydrofob, skal den indvendige overflade af den senere ion-følsomme tønde gøres hydrofob samt ved en proces kaldet silanisering. Til dette formål hexamethyldisilazan (HMDS), der anvendes (figur 2) som beskrevet i det næste trin.

"Figur Figur 2. silanisering af pipetter. (A) Hexamethyldisilazan (HMDS) reagerer med Si-OH-grupperne i den indre glasoverflade og gør den hydrofobe. (B) Den venstre fotografi viser hele silanisering enheden. En bred mund flaske indeholdende HMDS er placeret oven på en varmeplade indstillet på 40 ° C. På toppen af ​​flasken, er en holder (PH), der bærer kapillærerne (CAP) er monteret. Den rigtige fotografi viser en forstørrelse af pipetten holderen (PH), der bærer kapillærerne (CAP). (C) Skematisk side visning af skræddersyede pipetteholdere (PH) til dobbeltløbet (venstre) eller koncentriske (højre) kapillærer (CAP) som monteret på en bred mund flaske. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Lige før pulling elektroder, fylde ca.. 20 ml HMDS ind i en bred mund flaske. OBS: HMDS er til brug i en røg kun hætte, dampe er farligt for helbredet! Luk flasken og sætte det ind på en varmeplade, forudindstillet til 40 ° C. Forvarm en ovn, placeret under motorhjelmen så godt, op til 200 ° C.
  2. Fyld henvisning tønde op til dens spids med destilleret vand for at forhindre dens silanisering under følgende procedure.
  3. Put dobbeltløbet kapillarrør med spidsen op på en særlig, skræddersyet holder (figur 2B, 2C). Den stumpe åbne ende skal være frit gennem bunden af holderen (figur 2C, til venstre). Bagefter placere denne holder på brede mund flaske indeholdende det foropvarmede HMDS i 70 minutter.
    BEMÆRK: Sørg for, at HMDS damp kan strømme gennem kapillærer frit. Under en silanisering proces har de 20 ml HMDS ikke fordampe fuldstændigt, og flasken kan således anvendes flere gange.
  4. Afterwards, overføre kapillærer til et metal stativ og ind i forvarmet ovn til to timer. Dette vil tørre begge løb.
  5. Efter silanisering, holde kapillærerne tørt indtil brug. Mens førstnævnte procedure kræver ca. 3,5 timer i alt, kan elektroderne nu opbevares i en ekssikkator i flere uger.
  6. På dagen for deres eksperimentelle brug, forberede ionselektive elektroder ved at udfylde spidsen af silaniseret tønde med 1-2 pi af ionselektive sensor (figur 1A). For kalium-følsomme mikroelektroder bruge transportøren valinomycin; og for natrium-følsomme mikroelektroder, bruge ETH 157 som bærestof.
  7. Bemærk at ionselektive sensor er ganske viskos gør det vanskeligt for spidsen til at udfylde korrekt.
  8. Fyld henvisning tønde med HEPES-bufret saltvand (se nedenfor).
    BEMÆRK: Mens andre, mere simple iso-osmotisk saltvand kunne anvendes samt, foretrækker vi at anvende en saltopløsning, hvis sammensætning i det væsentlige svarer tilperfusionen saltvand (ACSF, se punkt 3.6.), da det kan sive ud og trænger ind i vævet under forsøg. Derfor er det også vigtigt, at dette saltvand ikke indeholder en højere koncentration af ionen, der skal bestemmes end ACSF anvendes.
  9. Efterfylde sensor med saltvand, der indeholder en høj koncentration af ionen, der skal påvises. Således efterfylde sensor med 100 mM NaCl saltvand (til natrium-følsomme mikroelektroder) eller 100 mM KCI (for kalium-følsomme mikroelektroder). Sørg for ikke at indsætte yderligere luftbobler under denne procedure.
  10. Hvis silaniseringen var vellykket, og sensoren er korrekt udfyldt, observere sensoroverfladen danner en tydeligt synlig konkav overflade mod opfyldning (figur 1A). Ellers kan sensoren have tilbagetrukket fra kapillærvæggen og spidsen vil ikke blive fyldt. Sådanne elektroder vil ikke være funktionel.
  11. Indsæt chlorerede sølv ledninger ind i begge tønder (pas på ikke at røre ved sensor), og forsegle hver tønde med dental voks (figur 1A).

2. Forberedelse af koncentriske Ion-selektive Mikroelektroder

  1. For den ydre cylinder, anvender tyndvæggede glaskapillarer med endeløse (ydre diameter 2,0 mm) og en længde på 7,5 cm. For det indre tromle, tage tyndvæggede kapillærer med endeløse, en ydre diameter på 1,2 mm og en længde på 10 cm.
  2. Rengør kapillærer i acetone i 12 timer. og derefter skylles flere gange med abs. ethanol og lad dem tørre. Elektroder kan nu opbevares i en ekssikkator.
  3. Fyld ca. 20 ml HMDS ind i en bred mund flaske. ADVARSEL! HMDS er til brug i en røg kun hætte, dampe er sundhedsfarlige. Luk flasken og sætte det ind på en varmeplade, forudindstillet til 40 ° C. Forvarm en ovn, placeret under motorhjelmen så godt, op til 200 ° C.
  4. Sæt 2,0 mm kapillar ind i en vandret aftrækker og træk den ud til at resultere i kapillærer med korte paraffin- og vokslys samt et tip Diameter på ~ 4 um (figur 1B).
  5. Sæt udtrukne 2,0 mm kapillarrør med spidsen op på en specialfremstillet, speciel holder (figur 2B, 2C), således at dets stumpe ende åbner til hulrummet i flasken (figur 2C, højre). Bagefter placere denne holder på brede mund flaske indeholdende det foropvarmede HMDS i 70 minutter. Sørg for, at HMDS damp kan strømme gennem alle kapillærer.
  6. Bagefter overfører kapillærerne til et metal stativ og ind i forvarmet ovn til to timer.
  7. Efter silanisering, holde kapillærerne tørt indtil brug. Mens førstnævnte procedure kræver ca. 3,5 timer i alt, nu gemme elektroderne i en ekssikkator i flere uger.
  8. Lige før anvendelse, fylde en lille mængde sensor (0,2 ul) i silaniserede kapillær (figur 1B).
  9. For at forberede den indre kapillar, indsætte en lille diameter kapillar ind i aftrækker og trække sig ud til at resultere i tokapillærer med lange tilspidsninger og skarpe tips (Figur 1B). Fyld med 100 mM NaCl (natrium-følsomme mikroelektroder) eller 100 mM KCI (kalium-følsomme mikroelektroder) saltvand.
  10. Placer sensoren fyldt og saltvand-fyldte kapillarrør direkte i overensstemmelse med hinanden på en brugerdefineret build prop lavet af dækglas. Indsæt mindre kapillær en kort vej i den større kapillarrøret.
  11. Fastgør kapillærerne på en anden dækglas hjælp modellervoks, overførsel til den fase af et mikroskop og visualisere bruge 100x forstørrelse. Med hjælp af en glasstav, der er monteret på en mikromanipulator og ved at dreje finskrue af scenen af mikroskopet, langsomt fremføre ydre kapillar over den indvendige kapillar indtil afstanden mellem deres spidser er omtrent 5 um (figur 1B).
  12. Fastgør den åbne ende af den ydre kapillar på den indre kapillar hjælp dental voks. Alternativt kan anvende en lille dråbe cyanoacrylat (Crazy Glue) insTEAD voks.
    BEMÆRK: Tilsætning af en lille dråbe af vand vil polymerisere limen og løse elektroderne på plads. Indsæt en chloreret sølvtråd ind i den indre cylinder og forsegle det med dental voks (figur 1B).
  13. For at forberede referenceelektroden, læs 7,5 cm lang kapillar med endeløse og en ydre diameter på 1,5 mm og træk med en lodret aftrækker. Sørg for, at tip er relativt lang, men ikke for skarp (spids diameter ~ 1 um).
  14. Kassér den øverste pipette, åbne den nederste borepatronen og løft den nederste pipette med ca. 5 mm. Luk borepatronen igen og løfte den, indtil spidsen af ​​den nedre elektrode er placeret omkring 5 mm over varmefladen. Varm spolen og anvende pincet til at bøje spidsen med omkring 45 ° til siden. Lavere pipette ca. 1-2 mm. Bend igen ved ca. -45 ° til direkte spidsen tilbage parallelt med hovedakslen (figur 1B). Denne fremgangsmåde er nødvendig for at muliggøre tæt positionering af spidsen af ​​reference elektroden til den koncentriske elektrode.
  15. Fyld henvisning tønde med HEPES-bufret saltvand (se nedenfor), indsætte en chloreret sølvtråd og forsegle tønde med dentalvoks (figur 1B).

3. Salines

  1. Forbered saltvand til opfyldning af kalium-sensitive elektroder (se 1.15). Sammensat af 100 mM KCI. Saltvand til opfyldning af natrium- følsomme elektroder er sammensat af 100 mM NaCl.
  2. Forbered saltvand til opfyldning af referencematerialer tønder (. HEPES-bufret saltvand, se 1.16) er sammensat af (i mM): 125 NaCI, 2,5 KCI, 2 CaCl2, 2 MgSO4, 1,25 NaH 2 PO 4 og 25 HEPES, titreret med NaOH til opnåelse af et pH på 7,4.
  3. Forbered saltvand til kalibrering af kalium-følsomme elektroder er sammensat af 25 mM HEPES og i alt 150 mM NaCl og KCl, pH justeret til 7,4 med NMDG-OH (N-methyl-D-glucamin). Her kalibrering blev udført med saltopløsninger indeholdende 1, 2, 4 eller 10 mMKCI; ACSF indeholdt 2,5 mM KCI (figur 5).
  4. Forbered saltvand til kalibrering af natrium-følsomme elektroder som følger; (i mM) 25 HEPES, 3 KCI, i alt 160 NaCI og NMDG-CI, pH justeret til 7,4 med NMDG-OH. Udfør kalibrering med saltvand indeholdende (i mM) 70, 100, 130 eller 160 NaCl; ACSF indeholdt 152 NaCl (figur 6).
  5. Til bestemmelse af krydsreaktion af føleren med andre ioner, f.eks., PH, udarbejde supplerende kalibreringspunkter saltopløsninger med faste ion koncentrationer, men varierende pH.
    BEMÆRK: Selvom denne procedure ikke er påvist i den foreliggende undersøgelse, bedes du bør henvise til tidligere arbejde dette spørgsmål (fx 11,12).
  6. Forbered akutte hjerne vævssnit i saltvand bestående af (i mM): 125 NaCI, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3 og 20 glucose, gennemboblet med 95% O2 og 5 % CO2, hvilket resulterer i en pH-værdi på7.4.
  7. Udfør eksperimenter i hjerneskiver i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) bestående af (i mM): 125 NaCI, 2,5 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3 og 20 glucose, gennemboblet med 95 % O 2 og 5% CO2, hvilket resulterer i en pH-værdi på 7,4.
  8. Til stimulering af neuroner og gliaceller, fremstille opløsninger indeholdende 0,2, 0,3, 0,4 eller 0,5 mM glutamat eller 10 mM L-aspartat opløst i ACSF. For pres ansøgning, opløses 10 mM glutamat i HEPES saltvand.
  9. Forberede ansøgning pipette til pres ansøgning. Indsæt tyndvæggede glaskapillarer med endeløse (ydre diameter 2,0 mm) og en længde på 7,5 cm i vandret aftrækker og træk ud til at resultere i en spids diameter ~ 1 uM.
  10. Til induktion af epileptiform aktivitet, fremstille magnesium-fri ACSF indeholdende 10 pM bicucullin-methiodid.
  11. For at hæmme dannelsen af ​​aktionspotentialer, udarbejde en 10 mM bestand solution af tetrodotoxin (TTX) i destilleret vand. Under forsøg er TTX tilsættes direkte til ACSF at resultere i en slutkoncentration på 0,5 uM.
  12. For at undgå aktivering af AMPA-receptorer, udarbejde en 50 mM stamopløsning af cyano-nitroquinoxalin-dion (CNQX) i dimethylsulfoxid (DMSO). Under forsøgene, er det tilsættes direkte til ACSF at resultere i en endelig koncentration på 100 uM.
  13. For at blokere aktivering af NMDA-receptorer, udarbejde en 50 mM stamopløsning af amino-phosphonopentanoate (APV) i 70 mM NaHCO3. Under forsøgene, er det tilsættes direkte til ACSF at resultere i en endelig koncentration på 100 uM.

4. Kalibrering af Ion-selektive Mikroelektroder

  1. Kalibrer ion-selektive mikroelektrode direkte før og efter hvert forsøg.
  2. Vedhæft elektroder til mikromanipulatorer og indsætte dem i en ACSF-perfunderet eksperimentelle kammer, placeret under et stereo mikroskop (Figur 3 g>, 4). Placer referenceelektroden i forkammeret (figur 4A, B). Tænd bad perfusion, sikre, at strømmen er omkring 2 ml / min.

Figur 3
Figur 3. Det eksperimentelle arbejde rummet. Optagelsen Riggen består af en vibration-dæmpet tabel bærer x / y-translationel scenen med den eksperimentelle bad, de mikromanipulatorer, og et stereomikroskop med høj kvalitet optik. Den stereomikroskop er også udstyret med en CCD-kamera til dokumentation. Desuden er en trykpåføringsanordning for fokal lægemiddeltilførsel anvendes. Registreringselektroderne er koblet via hovedet scenen til en differentialforstærker. De digitaliserede data (A / D-konverter) registreres med en computer. Badet perfusion realiseres ved en peristaltisk mikropumpe (ikke vist).> Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Tænd for A / D-konverter, differential forstærker, og computeren, og start optagelsen software (figur 3, 4). Da modstanden af ion-følsomme tønder er meget høj (10-20 GQ, se nedenfor), bruge en speciel elektrometer forstærker med høj indgangsimpedans (R = 10 TΩ) og en lille skævhed (I skævhed = 50 fA - 1 pA).

Figur 4
Figur 4. Elektronisk og rumlig udformning af den eksperimentelle oprettet. (A) Skematisk afbildning af optagelsen arrangement. Spidsen af ​​en dobbeltløbet mikroelektrode (blå) og en koncentrisk mikroelektrode (rød) er anbragt i en eksperimentel bad fyldt med saltvand. Badet referenceelektrode er angivet skematisk. Den poten oplys- detekteres af ionselektive tønder (V 1) består af det elektriske felt potentiale (V ref) og ion potentiale (V ion), henvisningen tønder (V 2) kun afsløre V ref. For at isolere V-ion, er V ref trækkes fra V 1 ved hjælp af en differentialforstærker (DA). (B) Topografi forsøgsstadiet med en koncentrisk mikroelektrode på plads. I midten af ​​den eksperimentelle fase består af den eksperimentelle bad indeholdende præparatet skive. At jorde badet henvisningen bad elektroden nedsænket i forkammeret, som også er vært for perfusion indløb. Scenen selv er jordet af en separat jord stik. Den koncentriske mikroelektrode og dens referenceelektrode er båret af separate pipetteholdere drevet af mikromanipulatorer. Mikroelektrode og referenceelektrode elektronisk koblet til hovedet fase af forstærkeren.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Tilslut chlorerede sølvtråde til de respektive indgange på hovedet fase af differensforstærkeren (figur 4). Bestem elektrode modstande. Sikre, at modstanden af ​​henvisningen tønde er mellem 30-100 MOhm og modstanden af ​​ion-følsomme tønde er mellem 10-20 GQ.
  2. Juster spænding signaler til nul og starte optagelsen.
  3. Bemærk, at potentialet opdaget af ionselektive tønder (V 1) er sammensat af det elektriske felt potentiale (V ref) og ion potentiale (V) ion, henvisningen tønder (V 2) kun afsløre V ref. For at isolere V-ion, er V ref trækkes fra V 1 ved hjælp af en differentialforstærker (DA) (figur 4A).
  4. Efter opnåelse af en stabil basislinje,skifte til kalibrering saltopløsninger indeholdende definerede koncentrationer af ionen, som skal måles.
    BEMÆRK: Figur 5A viser kalibreringen af en dobbeltløbet kalium-følsomme mikroelektrode. I figur 6A, kalibrering af både en dobbeltløbet samt en koncentrisk Na + -følsom mikroelektrode vises. Selvom vi ikke beskrive proceduren her opmærksom på, at mulige interferenser med andre ioner skal afprøves, før du bruger en bestemt ionophor (se også 3.4.).

Figur 5
Figur 5. Kalibrering af dobbeltløbet kalium-selektive mikroelektroder. (A) Ændring i spænding af henvisningen cylinderen (V ref) og K + -potential (V K +) som reaktion på ændringer i badet K + koncentration ( [K +] b) som angivet. (B) Halv-logarithmic plot af [K +] b versus V K +. En lineær afbildning af data afslører en hældning på ca. 56 mV. Til illustration blev spor glattet med en Sawitzky-Golay-filter (bredde 20). Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Bestem spændingsresponsen af ​​ionselektive tønde som reaktion på en kendt ændring i ionkoncentration. Plot data i en enkelt logaritmisk plot (figur 5B, 6B) og bestemme hældningen. En ideel sensor følger et forhold, der er beskrevet af Nernstligningen (se f.eks 13):

Ligning 1
V: målt elektrode potentiale;
V 0: standard elektrode potentiale, fx en AgCI-ledning ved en temperatur på 298,15 K og et partialtryk på 101,325 kPa (absolut)
T: absolut temperatur (i Kelvin)
z: afgift på ion (+ 1 for kalium og natrium)
F: Faraday konstant (96.500 coulomb)
c ': ekstracellulær ion koncentration
c '': intracellulær ion koncentration

Til praktiske formål, og den naturlige logaritme konverteres til Nernst hældningen s som derefter gælder for en given ion og temperatur:

Ligning 2
BEMÆRK: For kalium og natrium elektroder, en ideel spænding af sensorens respons udviser således en lineær hældning på ca. -58 mV ved stuetemperatur. Nogle afvigelse af denne kan accepteres (figur 5B, 6B). Det er imidlertid væsentligt, at respons karakteristika for en given elektrode ikke ændrer sig væsentligt (med mere end 10%, se nedenfor) før og efter et eksperiment.

Figur 6 Figur 6. Kalibrering af natrium-selektive mikroelektroder og sammenligning af dobbeltløbet med koncentriske elektroder (A) Top spor:. Ændring i spænding på reference- tønder (V ref) af en dobbeltløbet elektrode (sort prikket trace) og en koncentriske elektrode (grå linie) som reaktion på ændringer i badet Na + koncentration ([Na +] b) som angivet. Bemærk, at spændingen svarene fra begge elektroder er næsten identiske. Bottom spor: Ændringer i spænding på Na + -potential (V Na +) af en dobbeltløbet elektrode (sort trace) og en koncentrisk elektrode (grå spor) som reaktion på ændringer i [Na +] b. (B) Half-logaritmiske afbildninger af [Na +] b versus V Na + i begge elektroder. Lineære afbildninger af data viser en hældning på ca. 48 mV for begge elektroder.(C) Respons af V Na + i en dobbeltløbet (sort trace) og en koncentrisk elektrode (grå spor) til en hurtig ændring i [Na +] b fra 152 mM til 70 mM. Bemærk, at responstiden for koncentriske elektrode er betydeligt hurtigere. Til illustration blev spor glattet med en Sawitzky-Golay-filter (bredde 20). Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Bestem responstid elektroderne, som afhænger af spidsen diameter, i form af spidsen samt tykkelsen af ​​sensoren fase i elektrodespidsen.
    BEMÆRK: I denne eksperimentelle oprette og anvende en hurtig ændring mellem forskellige perfusion Salines (exchange afsluttet ved elektroden tip inden 500 ms), dobbeltløbet natrium-følsomme mikroelektroder nået et stabilt potentiale inden for 9,7 ± 4,5 sek, nårskifte fra 152 mM til 70 mM Na [+] (n = 6). Inden for samme indstilling, koncentriske natrium-følsomme mikroelektroder nået et stabilt potentiale inden for kun 0,8 ± 0,3 sek (n = 6) (Figur 6C). Dette understreger den overlegne tidsopløsning af koncentriske i forhold til dobbeltløbet mikroelektroder.

5. Dissektion af væv

  1. Til generering af akutte skiver, bedøve mus af postnatal dage 16-20 med CO 2 og hurtigt halshugget (efter henstilling fra Europa-Kommissionen offentliggjorde i: Eutanasi af forsøgsdyr, Luxembourg: Kontoret for Officielle Publikationer De Europæiske Fællesskaber, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
  2. Forbered hippocampus vævssnit (tykkelse 250 um), efter en standardprocedure (se f.eks 14).

6. Eksperimentelle procedurer

  1. Overfør en skive ind i eksperimentelle kammer, og ordne det med engitter.
  2. Sænk kalibrerede ionselektive mikroelektrode på skive overflade og spidde stratum radiatum af CA1-regionen til en dybde på ca. 50 um med elektroden.
    BEMÆRK: Berøring af skive overflade med mikroelektrode medfører karakteristiske udsving i ion-følsomme tønde. Desuden skader på celler under impalement af vævet forårsager udsving samt. Vent til baseline er stabiliseret.
  3. Ved tryk anvendelse af transmitter-agonister, fylde en ansøgning pipette med forbindelse (f.eks 0,5 mM glutamat). Fastgør pipette til en mikromanipulator og koble det til en trykpåføringsanordning.
  4. Lavere anvendelse pipette ind i vævet og omhyggeligt placere den i nærheden af ​​spidsen af ​​ionselektive mikroelektrode (~ 20-40 um). Start pres program (f.eks 10 sek, 40 mbar) og optage spændingsændringer som overvåges af ion-selektive mikroelektrode.
  5. Til bad anvendelse af narkotika, swkløe mellem forskellige perfusion saltopløsninger i en bestemt varighed.
  6. For at afslutte eksperimentet, forsigtigt trække ion-selektive mikroelektrode fra vævet og registrere enhver tendens i potentialer fra den oprindelige nul værdi, der kan være opstået under langvarige optagelse perioder.
  7. Fjern forberedelse skive fra badet og udføre en anden kalibrering af ion-selektive mikroelektrode.
    BEMÆRK: Dette er nødvendigt, fordi elektrodespidsen kan blive tilstoppet under sin bevægelse gennem vævet. Således er det vigtigt at sikre, at elektroden stadig reagerer korrekt på ændringer i ionkoncentrationer. Eksperimenter bør afvises, hvis elektrodens reaktion på en ti-fold ændring i ion-koncentrationen er faldet med mere end 10%. Velfungerende elektroder kan i princippet genanvendes i flere eksperimenter. Dette gælder især for koncentriske elektroder, som kan Selv sidste i flere dage. Det er afgørende, men at procedurerne kalibrering er regentagen før og efter hver enkelt eksperiment for at sikre et velfungerende af elektroderne.

7. Dataanalyse

  1. At konvertere spændingen respons ionelektrode på ændringer i ekstracellulær ionkoncentration, først konvertere ligning 2 for at bestemme ændringen i den potentielle AV ion (mV) som følger (påvist her for K + -følsom elektroder, analog procedure gælder for Na + -følsom elektroder):

Ligning 3

V K +: ændringer i potentialet i valinomycin tønde (mV)

s: Nernst hældning

K +] B: baseline koncentration af kalium (i vores tilfælde 2,5 mM K +)

K +] o: ændringer i [K +] o under forsøget

  1. Beregn det aritmetiske gennemsnit af de skråninger, der stammer fra de enkelte logaritmiske plot of kalibreringen før og efter forsøget (jf figur 5B, 6B, se punkt 4.8) for at hente "s".
  2. For at beregne ændringer på [K +] o (Δ [K +] o, i mM), omarrangere ligning 3 til:

Ligning 4

Representative Results

At overvåge [K +] o og ændringer heri som reaktion på excitatoriske aktivitet, en dobbeltløbet kalium-selektive mikroelektrode blev indsat i stratum radiatum af CA1-området. Et par minutter efter impalement, ion-selektive tønde elektroden nået en stabil basislinie (figur 7A), svarende til en [K +] o af ca. 2,8 mM, er en værdi tæt på [K +] i ACSF anvendes ( 2,5 mM). Bath anvendelse af 0,5 mM glutamat i 10 sek inducerede en reversibel stigning i [K +] o ca. 4 mm, efterfulgt af en underskridelse under baseline svarende til ~ 0,7 mM (figur 7A). Sænkning af glutamat fusions 0,4, 0,3 og 0,2 mM forårsagede en tilsvarende reduktion i amplituden af både forbigående stigning og underskridelse i [K +] o (figur 7A).

OAD / 53058 / 53058fig7.jpg "/>
Figur 7. Ekstracellulære kalium transienter som reaktion på excitatorisk aktivitet. (A) [K +] o transienter, der består af en stigning efterfulgt af en underskridelse under baseline, induceret ved bad anvendelse af forskellige koncentrationer af glutamat i 10 sek som angivet. (B) Indflydelse af en perfusion med glutamat receptorblokkere (CNQX, 100 uM, APV, 100 uM) og tetrodotoxin (TTX; 0,5 uM) på [K +] o transienter induceret af bad anvendelse af 0,5 mM glutamat i 10 sek. (C) Spontan [K +] o transienter i nærvær af 0 mg 2+ / BIC. Eksperimenter vist i AC blev udført under anvendelse dobbeltløbet elektroder. Til illustration blev spor glattet med en Sawitzky-Golay-filter (bredde 20). Venligst click her for et større version af dette tal.

Tidligere forsøg har vist, at sådanne glutamat-induceret [K +] o signalerne ikke er signifikant ændret under anvendelse af TTX, og er således stort set uafhængig om åbning af spændingsafhængige natriumkanaler og neuronal aktionspotentiale generation 15,16. For at undersøge mekanismerne bag de observerede [K +] o ændringer som reaktion på glutamat, vi anvendte glutamat receptor-blokkere, nemlig CNQX (100 uM; blokker af AMPA-receptorer) og APV (100 uM; blokker af NMDA-receptorer) i nærvær af TTX (0,5 uM). Efter bad perfusion med disse blokkere, glutamat-induceret [K +] o ændringer var næsten afskaffet, bekræfter deres afhængighed af åbningen af ionotropiske glutamat receptor-kanaler som rapporteret før (f.eks 17 Figur 7B).

For yderligere at demonstrere than relevans glutamaterge excitation til generering af ekstracellulære [K +] signaler, blev skiver perfunderet med nominelt Mg2 + -fri saltvand indeholdende 10 uM bicucullin-methiodid (0mg 2+ / BIC). Det aflaster spændingsafhængige Mg2 + -blok af NMDA-receptorer og dæmper inhibering ved at blokere GABAA-receptorer, forårsager spontane tilbagevendende epileptiform aktivitet i netværket (f.eks 18,19). Som forventet 20, spontan, tilbagevendende [K +] o transienter, der beløber sig til ca. 1,5 mM blev påvist i 0mg 2+ / BIC saltvand (Figur 7C). Imellem disse reaktioner, mindre [K +] o transienter med en gennemsnitlig amplitude på ca. 0,2 mM opstod (Figur 7C).

I et andet sæt eksperimenter, vi brugte [Na +] -følsom mikroelektroder at bestemme [Na +] o ændringer fremkaldt af anvendelse afglutamat agonister. Her har vi sammenlignet også svaret karakteristika dobbeltløbet og koncentriske mikroelektroder beskæftiger to forskellige anvendelsesområder paradigmer. [Na +] -følsom mikroelektroder blev anbragt i stratum radiatum i en dybde på omkring 50 uM. Efter en stabil basislinje blev nået, blev glutamat-agonist L-aspartat anvendt pr bath perfusion (10 mM, 120 sek, bad perfusion ved 2,5 ml / min). Som bemærket tidligere 21, anvendelse af aspartat forårsagede en langsom nedgang i [Na +] o med omkring 15 mm, som varede omkring 5 min, og derefter begyndte at komme sig tilbage til baseline (figur 8A). Især, medens spidsamplituder og kinetik [Na +] o signaler bestemt ved begge elektroder var næsten identiske under disse betingelser, koncentriske elektroder udviste en mere stabil basislinje og et lavere støjniveau (figur 8A).

For at teste r esponse kendetegn ved de forskellige elektroder under en hurtigere anvendelse paradigme, vi tryk påført glutamat gennem en fin glaspipette anbragt i stratum radiatum i en afstand på 20-40 um fra spidsen af ionselektive mikroelektrode. Som forventet 21, anvendelsen af glutamat (10 mM) i 200 ms forårsagede et fald i [Na +] o (figur 8B). Af udsvingene i den [Na +] o fald var i samme område for begge typer af elektroder (dobbelt barreled: 4,5-13,5 mM, n = 14; koncentriske: 2,0-19,1 mM, n = 15). Men i modsætning til resultaterne opnået med langsom bad perfusion (se ovenfor), ikke blot signal-til-støj-forhold, men også tidsforløbet for [Na +] o signaler detekteres af de to typer elektroder afveg væsentligt. Den gennemsnitlige tid til peak var 3,5 sek for dobbeltløbet og kun 1,3 sek for de koncentriske mikroelektroder.

ve_content "> Således demonstrerer disse resultater og bekræft hurtigere respons kinetik koncentriske vs. dobbeltløbet Na + -selektive mikroelektroder, (jf figur 6C og 8B), blev som også noteret for Ca2 + og pH-selektive modstykker 10 . I modsætning til den tidligere undersøgelse, hvor korte burst synaptisk stimulering blev udført for at fremkalde hurtig synaptisk inducerede ion transienter, der var kun en tendens, men ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige spidsamplituder mellem koncentriske og dobbeltløbet elektroder med vores ansøgning paradigme. Dette var sandsynligvis på grund af det faktum, at afstanden af ​​ansøgningen pipette fra spidsen af ​​ionselektive mikroelektrode varierede med en faktor på to (20-40 um), og følgelig, at den maksimale koncentration glutamat ved målområdet var ikke den samme i forskellige eksperimenter, blokerer en eksisterende forskel i spidsamplituder.

(A) Top spor: Ændring i voltage referenceaksens tønder (V ref) af en dobbeltløbet elektrode (sort stiplede spor) og en koncentrisk elektrode (grå linie) som reaktion på ændringer i badet Na + koncentration ([Na +] b) som angivet. Bemærk, at spændingen svarene fra begge elektroder er næsten identiske. Bottom spor: Ændringer i spænding på Na + -potential (V Na +) af en dobbeltløbet elektrode (sort trace) og en koncentrisk elektrode (grå spor) som reaktion på ændringer i [Na +] b. (B) Half-logaritmiske afbildninger af [Na +] b versus V Na + i begge elektroder. Lineære afbildninger af data viser en hældning på ca. 48 mV for begge elektroder. (C) Respons af V Na + i en dobbeltløbet (sort trace) og en koncentrisk elektrode (grå spor) til en hurtig ændring i [Na +] b fra 152 mM til 70 mM. Bemærk, at responstiden for koncentriske elektrode er væsentligt faster. Til illustration blev spor glattet med en Sawitzky-Golay-filter (bredde 20).

Figur 8
Figur 8: Ekstracellulære natrium transienter som påvist af dobbeltløbet og koncentriske elektroder.
(A) Forbigående ændringer i V ref og [Na +] o induceret af bad perfusion med 10 mM aspartat til 120 sek som angivet ved linjen. De øverste spor viser en optagelse udføres med en dobbeltløbet elektrode, blev de lavere spor optaget med en koncentrisk elektrode. (B) Forbigående ændringer i V ref og [Na +] o induceret af lokale tryk program med 10 mM glutamat i 0,2 sek som angivet ved pilespids. De øverste spor viser en optagelse udføres med en dobbeltløbet elektrode, blev de lavere spor optaget med en koncentrisk elektrode.Stiplede røde linje viser lineære anfald af perioden mellem starten af ​​signalet til dets maksimum. Bemærk, at responstiden for koncentriske elektrode er betydeligt hurtigere under denne betingelse. Til illustration blev spor glattet med en Sawitzky-Golay-filter (bredde 20). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Væske-carrier-baserede, har ionselektive elektroder med held blevet anvendt i årtier, og mange ioner, er tilgængelige 22-26 meget specifikke sensorer. Når det bruges i det ekstracellulære rum (ECS) af hvirveldyr hjerne præparater, må man huske på, dog, at dette er en ganske invasiv teknik: mens bredden på ECS er kun omkring 20-50 nm, diameteren af ​​ion-selektive mikroelektroder er omkring 1 um (dobbeltløbet elektroder) eller større (koncentriske elektroder). Spidserne af ion-selektive mikroelektroder vil således ikke kun skade væv under deres impalement af vævet, men også forstørre ECS, som fremmer en undervurdering af ion transienter. På trods af disse faldgruber, ekstracellulære ion transienter som reaktion på neuronal aktivitet er bemærkelsesværdigt konsekvent mellem forskellige laboratorier 7,8, attesterer pålideligheden af denne metode.

Udførelsen og egnethed ion-selektive elektroderer afhængig af deres følsomhed og selektivitet, der er defineret af sensoren cocktail ('flydende membran ionofor "), der anvendes. Sensor cocktails indeholder en særlig bærermolekyle, f.eks valinomycin for K + -selektive mikroelektroder, som udviser en høj selektivitet for kalium 27. Uanset, kan krydsreaktivitet med andre ioner forekommer, og skal afprøves. Valinomycin udviser en signifikant krydsreaktivitet for ammonium, som skal tages i betragtning ved fortolkningen af resultater (f.eks 11,12). Endvidere fordi spændingen-respons af ionoforer følger en Nernstian adfærd (jf ligning 1), signal-til-støj-forhold og detektionsgrænsen afhænger af koncentrationen af ​​ionen, som skal måles. Således, mens små [K +] o transienter fremkalde store spændingsændringer mod den lave baseline [K +] o, lille [Na +] o transienter er langt sværere at opdage mod high baseline [Na +] o (jf figur 5 og 6).

Udførelsen af ​​ion-selektive elektroder bestemmes også af den tidsmæssige opløsning, som i høj grad styret af dens elektriske tidskonstant. Sidstnævnte bestemmes hovedsageligt af den aksiale modstand på sensoren, og ved den distribuerede kapacitans langs længden af ​​pipetten, mellem dens interne løsninger og den eksterne væske. I dobbeltløbet konfiguration, modstanden er høj på grund af den lange kolonne i tilbagefyldt ion sensor. For en given isolerende dielektrisk (i dette tilfælde borsilicatglas), er kapacitansen omfattet af den dielektriske tykkelse. I dobbeltløbet elektroder, dielektriske bredde svarer til glasvæggen af ​​pipetten. Som glasset thins tæt på spidsen, falder den dielektriske bredde og kapacitansen stiger. Disse faktorer kombineres for at producere elektroder med svartider, der spænder fra flere hundrede millisekunder til fleresekunder, da disse faktorer er varierede.

En stor fordel ved den koncentriske konstruktion er, at både den aksiale modstand og kapacitans til badet er stærkt formindsket. De koncentriske pipette shunts fleste af modstanden af ​​tilbagefyldt ionbytter, så kun en rest i de sidste par mikrometer før spidsen. Desuden er fyldet løsning inden den koncentriske pipette fysisk afstand fra badet, adskilt af tykkelsen af ​​to glasvægge, hvilket reducerer kapaciteten. Som vist tidligere 10, den kombinerede effekt af reduceret modstand og kapacitans er en forbedring i tidsmæssig opløsning på to størrelsesordener. I tilfælde af koncentriske Ca2 + og pH mikroelektroder, 90% svartiderne var så lav som 10-20 ms 10. En beslægtet fordel af koncentriske design er lavere støjniveau (jf figur 8). På grund af den stærkt reduceret modstand, spændingstransienter fra enhver ambient støj minimeres. Desuden nyttiggørelse fra sådanne transienter er hurtig på grund af den hurtige tidskonstant. Sådanne artefakter er derfor lille og hurtig, og har en mindre forstyrrende effekt på fysiologiske optagelser (jf figur 8).

Der er også ulemper ved den koncentriske teknik. Først deres samling er mere kompleks, og tidskrævende. En anden ulempe er behovet for at placere en særskilt henvisning mikroelektrode med sin spids, medfører anvendelse af enten en separat mikromanipulator eller et specialiseret dual manipulator. Endelig kan dobbeltløbet mikroelektroder udvides til en tredobbelt riflede design, tillader detektion af to forskellige arter ion samtidig 28, hvilket ikke er muligt for koncentriske elektroder.

Mest almindelige faldgruber

Ineffektiv silanisering.

Det vigtigste skridt, og hovedstol hindring i fabrikation af eventuelle væske-senseller baseret ionselektive mikroelektrode er silanisering procedure. Når elektroder undlader at reagere på ændringer i specifikke ion-koncentration, eller reagere med en sub-Nernstian respons (dvs. godt mindre end 58 mV pr ti gange koncentration forskel), dårlig effekt af silanisering er typisk årsagen. Det er vores erfaring, kan dette ske, hvis luftfugtighed er for høj, eller for lav, typisk for betingelser på højden af ​​sommeren, eller vinter, hhv. Hvis det er muligt at udøve en vis kontrol over rumfugtighed, kan disse problemer løses.

Elektrodemodstand er for høj.

Hvis det er nødvendigt, kan modstanden af ​​ion-følsomme tønde reduceres ved affasning. Med henblik herpå udsættes spidsen til en stærk stråle af et slibemiddel suspenderet i vand i et par sekunder. Dette vil forårsage dens yderste spids til at bryde og sænke modstanden til den ønskede værdi.

Saltbroer.

Saltbroer mellem ion og reference- tønder resulterer i dårligt eller ingen-reagerer elektroder og kan således også i høj grad forvirre deres præstationer i kalibreringen. Som nævnt ovenfor (se punkt 1.6.), Er det først og fremmest et problem, når dobbeltløbet theta glas er valgt, men er en sjælden begivenhed, når du bruger offset, snoede tønde teknik beskrevet her.

Med lethed i fabrikation i tankerne, kan den oprindelige dobbeltnavn udformning af Lux 29 ofte anvendes rentabelt. Denne metode udnytter præ-fyldning af ion og reference- tønder med saltopløsninger, en hurtig eksponering for en silan løsning ved sin sugning og bortvisning fra spidsen, efter ved inkorporering af ion-veksleren, også via spidsen (se 30,31) . Disse elektroder kan fremstilles i omtrent 10 minutter, men deres dysestørrelse er typisk 4 um eller mere, og de er mere tilbøjelige til at svigte under et eksperiment. I modsætning hertil silanisering metoder, der indebærer udsættelse for silan damp og varmeING kan producere elektroder med mindre tips, der sidste dage og nogle gange uger.

Tilsammen er der flere protokoller og tilgange om, hvordan man forbereder ion-selektive mikroelektroder. Her har vi beskrevet to vigtigste procedurer til fremstilling af snoede dobbeltløbet samt koncentriske mikroelektroder, som fungerer godt og pålideligt i vores laboratorier, med en samlet succesrate på tæt på 100%. Vigtigt er det, vil disse teknikker kunne overføres til måling af andre ioner arter, herunder pH eller calcium, og vil også være gældende for andre præparater end hjernen, herunder væskefyldte hulrum eller væsker i almindelighed. Sidst, men ikke mindst, ionselektive mikroelektroder tillader bestemmelse af ionkoncentrationer i celler. På grund af deres relativt store spids størrelse (~ 1 um), dette vil dog kun være mulig i celler med en stor celle krop, fx som findes i hvirvelløse præparater 28,32.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke C. Roderigo for ekspert teknisk bistand. Vi takker S. Köhler (Center for Avanceret afbildning, Heinrich Heine University Duesseldorf) om hjælp til videoproduktion. Forskning i forfatterens laboratorium er blevet finansieret af den tyske Research Association (DFG: Ro 2327 / 8-1 til CRR), Heinrich Heine University Düsseldorf (til NH) og af National Institutes of Health give R01NS032123 (til MC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Abrasive   MicroPolish  Buehler GmbH Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries 1405059 Hilgenberg Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament GC 150 F-15  Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus For the sensor of double-barreled microelectrodes 
Borosilicate glass capillaries with filament GC100-F-15 Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus For the reference of double-barreled microelectrodes 
Borosilicate glass capillaries with filament GB-200TF-15  Science Products Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm  
Borosilicate glass capillaries with filament GB-120TF-10 Science Products Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata 1322A Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage Custom-made Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber Custom-made Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace Heraeus Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax  Deiberit 502  Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate Custom-made Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas Custom-made Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator Leitz
Micromanipulator MD4R Leica
Stereo microscope M205C Leica
Objective Plan 0.8xLWD Leica
Pipette puller Model PP-830 Narishige Concentric microelectrodes 
Pipette puller Model P-97 Sutter Instruments  Sensor of concentric microelectrodes 
Pneumatic drug ejection system Picospritzter Type II General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage DT 25/M Thorlabs
Two-component glue  Araldite Huntsman advanced materials GmbH One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together 
Silverwire 99.9%  Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome Microm HM 650 V Thermo Scientific
Software AxoScope 8.1  Axon Instruments
Vertical puller  Type PE-2 Narishige Scientific Instruments With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide Sigma aldrich 14343 Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX Sigma aldrich C-127 AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma aldrich D5879
DL-AP5 Alfa Aesar J64210 NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma aldrich 440191 CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid Sigma aldrich A9256 Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma aldrich G1626 Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B Fluka  60403 Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A Fluka   71178 Based on ETH 157
TTX Ascent Scientific Asc-055 Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure Sigma aldrich W3500 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  2. Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space. Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).
  3. Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex. J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).
  4. Rice, M. E., Nicholson, C. Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum. Neuroscience. 38, 295-310 (1990).
  5. Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex. Brain Res. 50, 489-495 (1973).
  6. Deitmer, J. W., Rose, C. R. pH regulation and proton signalling by glial cells. Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).
  7. Chesler, M. Regulation and modulation of pH in the brain. Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).
  8. Kofuji, P., Newman, E. Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , Springer. (2009).
  9. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).
  10. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).
  11. Stephan, J., et al. Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ. Glia. 60, 965-978 (2012).
  12. Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. Microelectrodes. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).
  13. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).
  14. Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  15. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain. J Neurosci Res. , (2014).
  16. Pumain, R., Heinemann, U. Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex. J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).
  17. Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord. J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).
  18. Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices. J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).
  19. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322, 1551-1555 (2008).
  20. Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity. Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).
  21. Zanotto, L., Heinemann, U. Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats. Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).
  22. Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells. J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).
  23. Ammann, D., Anker, P. Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies. Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).
  24. Deitmer, J. W., Schlue, W. R. Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump. Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).
  25. Schwiening, C. J., Thomas, R. C. Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones. J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).
  26. Chesler, M., Kraig, R. P. Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation. Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).
  27. Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).
  28. Deitmer, J. W. Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells. Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).
  29. Lux, H. D. Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS. Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).
  30. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  31. Chesler, M., Chan, C. Y. Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum. Neuroscience. 27, 941-948 (1988).
  32. Thomas, R. C. Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones. J Physiol. 220, 55-71 (1972).

Tags

Neuroscience neurovidenskab akut hjerne skive hippocampus ekstracellulære rum ionselektiv mikroelektrode elektrofysiologi natrium kalium glutamat

Erratum

Formal Correction: Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 05/10/2016. Citeable Link.

An author's middle initial was omitted from the publication, Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. The author's name has been updated to:

Christine R. Rose

from:

Christine Rose

Dobbeltløbet og koncentrisk Mikroelektroder til måling af Ekstracellulær Ion Signaler i hjernevæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., … More

Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J. Vis. Exp. (103), e53058, doi:10.3791/53058 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter