Dubbelpipiga och Concentric Mikroelektroder för mätning av extracellulärt Ion Signaler i hjärnvävnad

Protocol

Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med de institutionella riktlinjer Heinrich Heine University Düsseldorf, Tyskland, liksom Europeiska gemenskapen Rådets direktiv (86/609 / EEG). Alla experiment meddelades och godkändes av Animal Welfare Office på Animal Care och användning Facility av Heinrich Heine University Düsseldorf, Tyskland (institutionell handling Nummer: Ø52 / 05). I enlighet med djurskyddslagen tyska (Tierschutzgesetz artiklarna 4 och 7), var det inte nödvändigt att formellt ytterligare godkännande för obduktion avlägsnande av hjärnvävnad.

1. Framställning av dubbelpipiga Jonselektiva Mikroelektroder

1. Bered två borosilikatglas kapillärer med filament: en med en längd av 7,5 cm och en yttre diameter av 1,5 mm som skall användas för den jonkänsliga fat, och en med en längd av 6,5 cm och en yttre diameter av 1,0 mm för den senare referens fat.
2. Rengör capil laries i aceton för 12 timmar och skölj sedan flera gånger med abs. etanol och låt dem torka. Elektroder kan nu lagras i en exsickator.
3. Använd två-komponentslim eller en liten remsa av aluminiumfolie för att fastställa en lång och en kort kapillär tillsammans i båda ändar. Värm dubbel kapillär i en ugn vid 60 ° C under 1 timme. Detta påskyndar härdningsprocessen. Förvara elektrod nu i en exsickator.
4. Centrera dubbel kapillär i en vertikal avdragare med en svängbar chuck. Värm spolen försiktigt tills glaset är tillräckligt mjuk för att tillåta en horisontell rotation av roterbara chucken 180 °. Under detta steg förhindrar töjning av kapillären med en chock under chucken.
5. Efter kylning, ta bort den mekaniska paus och tillämpa en andra uppvärmningsprotokoll för att dra ut kapillären, vilket resulterade i två skarpa, dubbelpipiga kapillärer (Figur 1). Den spetsdiameter av en dubbel-kapillär ska vara nära 1 fim.

ve_content ">
Figur 1. Arkitektur av jonselektiva microelectrodes. (A) Fotografera av en dubbelpipig mikroelektrod. I illustrationssyfte och för bättre synlighet, var vätskan inuti referens pipan tonade. (B) Fotografi av en koncentrisk mikroelektrod och den motsvarande referenselektrod. Spetsen på koncentriska mikroelektrod är visad förstorad vid dess vänstra. I (A) och (B), är den som upptas av jonsensorn i spetsarna på pipetterna utrymme efter färgad. Längst ner är spets arrangemanget av båda elektrodtyper visas schematiskt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Om en vertikal avdragare med vridbara chuck inte är tillgänglig, förbereda en dubbelpipig jon-selectiva mikro i en horisontell avdragare använder theta glas.
   1. För detta ändamål drar teta glas (ytterdiameter 1,5 mm, längd 7,5 cm) för att resultera i två elektroder med två tunnor vardera. Markera ett av dem för att tjäna som framtida referens fat. Silaniserad andra liknande det förfarande som beskrivs nedan för att tjäna som framtida jonselektiva fat.
      OBS: Även om framställningen av dubbelpipiga theta-glaselektroder är mycket lättare än framställningen av vridna dubbelpipiga elektroder, de är mer benägna att kors åtgärder mellan de båda fat den tunna skiljeglasvägg mellan dem tenderar att vara porös i sitt yttersta spets.
      OBS! Eftersom sensor cocktail (se nedan) är hydrofob, måste den inre ytan av den senare jonkänsliga fat göras hydrofoba såväl genom en process som kallas silanisering. För detta är hexametyldisilazan (HMDS) som används (Figur 2) som beskrivs i nästa steg.

Figur 2. silanisering av pipetter. (A) Hexametyldisilazan (HMDS) reagerar med Si-OH-grupper av den inre glasytan och gör den hydrofoba. (B) Den vänstra bilden visar hela silanisering enheten. En bred mun flaska innehållande HMDS är placerad på toppen av en värmeplatta, ställd till 40 ° C. På toppen av flaskan, är en hållare (PH) som bär kapillärerna (CAP) monterad. Den högra bilden visar en förstoring av pipetten hållaren (PH) bär kapillärerna (Cap). (C) Schematisk sidan av skräddarsydda pipetthållare (PH) för dubbelpipiga (vänster) eller koncentriska (höger) kapillärer (CAP) som är monterade på en bred mun flaska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

7. Strax före pufyllning elektroder, fyll ca.. 20 ml HMDS till en bred mun flaska. Attention: HMDS är avsett att användas i en rök bara huv, ånga är hälsofarliga! Stäng flaskan och placera den på en värmeplatta, förinställd på 40 ° C. Värm en ugn, lämnade under huven också, upp till 200 ° C.
8. Fyll referens fat upp till dess spets med destillerat vatten för att förhindra dess silanisering under följande förfarande.
9. Sätt dubbelpipiga kapillär med spetsen upp på en särskild, skräddarsydd hållare (Figur 2B, 2C). Den trubbiga öppna änden måste nå fritt genom botten på hållaren (figur 2C, vänster). Efteråt, placera hållaren på bred mun flaska innehåller förvärmda HMDS under 70 minuter.
   OBS: Se till att HMDS ånga kan strömma genom kapillärer fritt. Under en silanisering processen, gör 20 ml HMDS avdunstar inte fullständigt, och flaskan kan sålunda användas flera gånger.
10. Afterwards, överföra kapillärerna till en metallstativ och i den förvärmda ugnen i två timmar. Detta kommer att torka båda piporna.
11. Efter silanisering, hålla kapillärerna torra fram till användning. Medan det tidigare förfarandet kräver ca 3,5 timmar totalt, kan elektroder nu lagras i en torkapparat under flera veckor.
12. På dagen för deras experimentell användning, förbereda jonselektiva elektroder genom att fylla spetsen på silaniserad pipan med 1-2 | al av den jonselektiva sensor (Figur 1A). För kaliumkänsliga mikroelektroder, använder bäraren valinomycin; och natriumkänsliga microelectrodes använder ETH 157 som bärare.
13. Observera att jonselektiv sensor är ganska viskös vilket gör det svårt för spetsen att fylla på rätt sätt.
14. Fyll referens fat med HEPES-buffrad saltlösning (se nedan).
    OBS: Även om andra, enklare iso-osmotisk saltlösning kan användas, föredrar vi att använda en saltlösning vars sammansättning är väsentligt överensstämmer medperfusion saltlösning (ACSF, se 3,6.), eftersom det kan läcka ut och tränga in i vävnaden under experimenten. Därför är det också viktigt att detta saltlösning inte innehåller en högre koncentration av jonen som skall fastställas än ACSF används.
15. Återfyllning sensorn med saltlösning som innehåller en hög koncentration av jonen, som skall detekteras. Således, återfyllning sensorn med 100 mM NaCl saltlösning (för natriumkänsliga mikroelektroder) eller 100 mM KCl (för kaliumkänsliga mikroelektroder). Var noga med att inte sätta in ytterligare luftbubblor under denna procedur.
16. Om silaniseringen var framgångsrik och sensorn är korrekt ifyllt, observera sensorytan bildar en väl synlig konkav yta mot återfyllningen (Figur 1A). I annat fall kan sensorn ha indragna från kapillärväggen och spetsen kommer inte att fyllas. Sådana elektroder kommer inte att vara funktionella.
17. Sätt kloresilvertrådar i båda piporna (vara noga med att inte röra sensor) och försegla varje fat med dentalvax (Figur 1A).

2. Framställning av Concentric Jonselektiv Mikroelektroder

1. För den yttre cylindern, använda tunnväggiga glaskapillärer med glödtråd (ytterdiameter 2,0 mm) och en längd av 7,5 cm. För innerröret, ta tunnväggiga kapillärer med filament, en ytterdiameter på 1,2 mm och en längd av 10 cm.
2. Rengör kapillärerna i aceton under 12 timmar. och skölj sedan flera gånger med abs. etanol och låt dem torka. Elektroder kan nu lagras i en exsickator.
3. Fyll ca.. 20 ml HMDS till en bred mun flaska. OBS! HMDS är avsedd att användas i en rök bara huv, ånga är hälsofarliga. Stäng flaskan och placera den på en värmeplatta, förinställd på 40 ° C. Värm en ugn, lämnade under huven också, upp till 200 ° C.
4. Sätt in 2,0 mm kapillär i en horisontell avdragare och dra ut resultera i kapillärer med korta konor och ett tips Diameter på ~ 4 pm (Figur 1B).
5. Sätt utdragna 2,0 mm kapillär med spetsen upp på en skräddarsydd, speciell hållare (Figur 2B, figur 2C) så att dess trubbig ände öppnar till hålrummet av flaskan (figur 2C, höger). Efteråt placera denna hållaren på bred mun flaska innehåller förvärmda HMDS under 70 minuter. Försäkra dig om att HMDS ånga kan strömma genom alla kapillärerna.
6. Efteråt överföra kapillärerna till en metallstativ och i den förvärmda ugnen i två timmar.
7. Efter silanisering, hålla kapillärerna torra fram till användning. Medan den förra förfarandet kräver ca 3,5 timmar totalt, nu lagra elektroderna i en exsickator i flera veckor.
8. Strax före användning, fylla en liten mängd av sensorn (0,2 | il) i silaniserad kapillär (Figur 1B).
9. För att förbereda den inre kapillär, infoga en diameter kapillär i avdragare små och dra ut för att resultera i tvåkapillärer med långa vaxljus vassa spetsar (Figur 1B). Fyll med 100 mM NaCl (natriumkänsliga mikroelektroder) eller 100 mM KCl (kaliumkänsliga mikroelektroder) saltlösning.
10. Placera sensorn fyllda och saltlösning fyllda kapillär direkt i linje med varandra på en anpassad bygga propp gjord av täck. Sätt i mindre kapillär en kort väg in i större kapillär.
11. Fäst kapillärerna mellanrum på en annan täck använder modellera, överföra till det stadium av ett mikroskop och visualisera med hjälp av 100x förstoring. Med hjälp av en glasstav som är monterad på en mikromanipulator och genom att vrida den fina enheten på scenen i mikroskop, långsamt föra yttre kapillär över inre kapillär tills avståndet mellan deras tips är ungefär 5 pm (Figur 1B).
12. Fäst den öppna änden av den yttre kapillären på inner kapillären med användning av dentala vax. Alternativt, applicera en liten droppe cyanoakrylat (Crazy Glue) instead av vax.
    OBS: Tillsats av en liten droppe vatten polymeriserar limmet och fixera elektrod på plats. Sätt en klorerad silvertråd i innerröret och försegla den med dentala vax (Figur 1B).
13. För att förbereda referenselektrod, ta en 7,5 cm lång kapillär med glödtråd och en ytterdiameter på 1,5 mm och dra ut med en vertikal avdragare. Se till att tipsen är relativt lång men inte alltför vassa (spetsdiameter ~ 1 mikrometer).
14. Kasta den övre pipett öppna den nedre chucken och lyft nedre pipetten med cirka 5 mm. Stäng chucken igen och lyfta den tills spetsen på den nedre elektroden är placerad omkring 5 mm över värmebatteriet. Värm spolen och använda pincett för att böja spetsen med ca 45 ° åt sidan. Lägre pipett ca 1-2 mm. Böj igen med cirka -45 ° för att rikta spetsen tillbaka parallellt med huvudaxeln (Figur 1B). Detta förfarande är nödvändigt för att möjliggöra nära positionering av spetsen på REFEREiou elektrod till den koncentriska elektroden.
15. Fyll referens fat med HEPES-buffrad saltlösning (se nedan), för in en klorerad silvertråd och försegla pipan med dental vax (Figur 1B).

3. Salines

1. Förbered saltlösning för återfyllning av kaliumkänsliga elektroder (se 1.15.) Består av 100 mM KCl. Saline för återfyllning av natrium- känsliga elektroder består av 100 mM NaCl.
2. Förbered saltlösning under återfyllning av referens fat (. HEPES-buffrad saltlösning, se 1,16) består av (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 _CaCl2, 2 MgSO _4, 1,25 NaH ₂ PO _4, och 25 HEPES, titrerad med NaOH för att resultera i ett pH av 7,4.
3. Förbered saltlösning för kalibrering av kaliumkänsliga elektroder består av 25 mM HEPES och totalt 150 mM NaCl och KCl, pH-justerad till 7,4 med NMDG-OH (N-metyl-D-glukamin). Här var kalibrering utfördes med saltlösningar innehållande 1, 2, 4 eller 10 mMKCl; ACSF innehöll 2,5 mM KCl (Figur 5).
4. Förbered saltlösning för kalibrering av natriumkänsliga elektroder enligt följande; (i mM) 25 HEPES, 3 KCl, totalt 160 NaCl och NMDG-Cl, pH justerades till 7,4 med NMDG-OH. Utföra kalibrering med saltlösning innehållande (i mM) 70, 100, 130 eller 160 NaCl; ACSF innehöll 152 NaCl (figur 6).
5. För bestämning av korsreaktion av sensorn med andra joner, t ex., PH, förbereda ytterligare kalibrerings salines med fasta jonkoncentrationer, men varierande pH.
   OBS: Även om detta förfarande inte demonstreras i den aktuella studien, vänligen bör hänvisa till tidigare arbete att ta itu med denna fråga (t.ex. ^11,12).
6. Förbered akut hjärnvävnadsskivor i saltlösning bestående av (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCOs _3, och 20 glukos, bubblades med _95% O2 och 5 _% CO2, vilket resulterade i ett pH av7,4.
7. Utföra experiment i hjärnan skivor i artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) bestående av (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl _2, 1 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO ₃ och 20 glukos, bubblas med 95 _% O2 och 5% CO2, vilket resulterade i ett pH av 7,4.
8. För stimulering av neuroner och gliaceller, bereds lösningar som innehåller 0,2, 0,3, 0,4 eller 0,5 mM glutamat eller 10 mM L-aspartat löst i ACSF. För tryck ansökan, lös 10 mM glutamat i HEPES saltlösning.
9. Förbered ansökan pipett för tryck ansökan. Infoga tunnväggiga glaskapillärer med glödtråd (ytterdiameter 2,0 mm) och en längd av 7,5 cm i horisontella avdragare och dra ut för att resultera i en spetsdiameter av ~ 1 ^ M.
10. För induktion av epileptiform aktivitet, förbereda magnesiumfritt ACSF innehållande 10 iM bikukullin metiodid.
11. För att inhibera genereringen av aktionspotentialer, förbereda en 10 mM förråds lösnjon av tetrodotoxin (TTX) i destillerat vatten. Under experiment, har TTX direkt sättes till ACSF för att resultera i en slutlig koncentration av 0,5 pM.
12. För att förhindra aktivering av AMPA-receptorer, framställa en 50 mM stamlösning av cyano-nitrokinoxalin-dion (CNQX) i dimetylsulfoxid (DMSO). Under experiment, är detta direkt sättes till ACSF för att resultera i en slutlig koncentration av 100 | iM.
13. För att blockera aktivering av NMDA-receptorer, förbereda en 50 mM stamlösning av amino-phosphonopentanoate (APV) i 70 mM NaHCOs _3. Under experiment, är detta direkt sättes till ACSF för att resultera i en slutlig koncentration av 100 | iM.

4. Kalibrering av Jonselektiva Mikroelektroder

1. Kalibrera jonselektiva mikroelektrod direkt före och efter varje experiment.
2. Fäst elektroderna till micromanipulators och infoga dem i en ACSF-perfusion experimentell kammare, som hänförts till ett stereomikroskop (Figur 3 g>, 4). Placera referenselektroden i förkammaren (Figur 4A, B). Slå på bad perfusion, se till att flödet är ca 2 ml / min.

Figur 3. Den experimentella arbetsutrymme. Inspelningsapparaturen består av en vibrationsdämpad tabellen bär x / y-translationell scenen med den experimentella bad, micromanipulators, och en stereo med högkvalitativ optik. Den stereomikroskop är också utrustad med en CCD-kamera för dokumentation. Dessutom är en tryckappliceringsanordning för fokal drog program som används. De registreringselektrod är kopplade via huvudet scenen till en differentialförstärkare. De digitaliserade data (A / D-omvandlare) är inspelad med en dator. Badet perfusionen realiseras genom en peristaltisk mikropump (ej visad).> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Slå på A / D-omvandlare, differentialförstärkaren, och datorn, och starta programmet inspelning (Figur 3, 4). Eftersom motstånd av jonkänsliga fat är mycket hög (10-20 GΩ, se nedan), använda en speciell elektroförstärkare med hög ingångsimpedans (R _{in =} 10 TΩ) och en liten biasström (I _partiskhet = 50 fA - 1 pA).

Figur 4. Elektronisk och rumslig utformning av den experimentella upplägg. (A) Schematisk vy av inspelningsanordningen. Spetsarna på en dubbelpipig mikroelektrod (blå) och en koncentrisk mikroelektroden (röd) är anordnade i en experimentell bad fyllt med saltlösning. Badet referenselektroden indikeras schematiskt. Den poten TiAl detekteras av jonselektiva fat (V ₁₎ är sammansatt av den elektriska fältpotential _(Vref) och jonen potential (V _jon), medan referens fat (V ₂₎ endast detektera _Vref. För att isolera _V-jon, är _Vref subtraheras från V ₁ med hjälp av en differentialförstärkare (DA). (B) topografi experimentstadiet med en koncentrisk mikro på plats. I mitten av den experimentella steget består av den experimentella bad innehållande skiva beredning. Att jorda badet, är referensbadet elektrod nedsänkt i förkammaren, som också är värd för perfusion inloppet. Scenen i sig är jordad genom en separat jordkontakt. Den koncentriska mikro och dess referenselektrod uppbärs av separata pipetthållare drivs av micromanipulators. Mikroelektrod och referenselektrod är elektroniskt kopplad till huvudet skede av förstärkaren.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Anslut kloresilvertrådar till de respektive ingångarna hos huvudet scenen hos differentialförstärkaren (Figur 4). Bestäm elektrod motstånd. Se till att resistansen hos referens fat är mellan 30-100 Mohm och resistansen hos jonkänsliga fat är mellan 10-20 GΩ.
5. Justera spänningssignaler till noll och starta inspelningen.
6. Notera att potentialen detekteras av jonselektiva fat (V ₁₎ består av den elektriska fältpotential _(Vref) och jonen potential (V _jon), medan referens fat (V ₂₎ endast detektera _Vref. För att isolera _V-jon, är _Vref subtraheras från V ₁ med hjälp av en differentialförstärkare (DA) (Figur 4A).
7. Efter erhållande av en stabil baslinje,byta till kalibrerings salines innehållande definierade koncentrationer av jonen, som skall mätas.
   OBS: Figur 5A visar kalibreringen av en dubbelpipig kaliumkänsliga mikroelektrod. I fig 6A, kalibrering av både en dubbelpipig samt en koncentrisk ^Na ^ -känsliga mikroelektrod visas. Även om vi inte beskriver förfarandet här, observera att eventuella störningar med andra joner måste testas innan du använder en specifik jonofor (se även 3.4.).

Figur 5. Kalibrering av dubbelpipiga kaliumselektiva mikroelektroder. (A) Förändring av spänningen hos referens pipan _(Vref) och ^K ^ -potential (V _{K +)} som svar på förändringar i badet ^K + koncentration ( [K ^+] _b) som anges. (B) Halv-logarithmic plot av ^[K +] _b kontra V _{K +.} En linjär kurva av uppgifterna visar en lutning på cirka 56 mV. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

8. Bestäm spänningen svaret hos den jonselektiva fat som svar på en känd förändring i jonkoncentration. Handling data i en enda logaritmisk kurva (figur 5B, 6B) och bestämma lutningen. En idealisk sensorn följer en relation som beskrivs av Nernsts ekvation (se t ex ^13):

V: uppmätt elektrodpotential;
V _0: Elektrodpotential, till exempel för en AgCl-wire vid en temperatur av 298,15 K och ett partialtryck av 101,325 kPa (absolut)
T: absolut temperatur (i Kelvin)
z: laddning på jon (+ 1 med avseende på kalium och natrium)
F: Faradays konstant (96.500 coulomb)
c ': extracellulär jonkoncentration
c '': intracellulär jonkoncentration

Av praktiska skäl, och den naturliga logaritmen är omräknade till Nernst lutning s som gäller sedan för en given jon och temperatur:

OBS: För kalium och natrium elektroder, en ideal spänningssvaret hos givaren uppvisar alltså en linjär lutning av ca -58 mV vid RT. Viss avvikelse på detta kan godtas (figur 5B, 6B). Det är emellertid väsentligt att svarsegenskaperna hos en given elektrod inte ändras påtagligt (med mer än 10%, se nedan) före och efter ett experiment.

Figur 6. Kalibrering av natriumselektiva mikroelektroder och jämförelse av dubbelpipiga med koncentriska elektroder (A) Top spår. Förändring i spänningen av referens fat (V _ref) av en dubbelpipig elektrod (svart streckad spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) som svar på förändringar i badet Na ⁺ koncentration ([Na ^+] _b) som anges. Notera att spänningssvaren från båda elektroderna är praktiskt taget identiska. Bottom spår: Förändringar i spänning ^för Na * -potential (V _{Na *)} av en dubbelpipig elektrod (svart spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) som svar på förändringar i ^[Na *] _f. (B) Halv logaritmiska tomter i nätverket [Na ^+] _b kontra V _{Na +} båda elektroderna. Linjära tomter av uppgifterna visar en lutning på ca 48 mV för båda elektroderna.(C) Svar för V _{Na *} av en dubbelpipig (svart spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) till en snabb förändring av ^[Na ^] _b från 152 mM till 70 mM. Notera att reaktionstiden för den koncentriska elektroden är betydligt snabbare. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

9. Bestämma responstiden hos elektroderna, som är beroende av spetsdiametern, formen av spetsen samt på tjockleken hos sensorfasen i elektrodspetsen.
   OBS: I denna experimentella inrätta och använda en snabb förändring mellan olika perfusion salines (utbyte genomförts vid elektrodens spets inom 500 ms), dubbelpipiga natriumkänsliga mikroelektroder nått en stabil potential inom 9,7 ± 4,5 sek närbyta från 152 mM till 70 mM [Na ^+] (n = 6). Inom samma inställning, koncentriska natrium-känsliga mikroelektroder nått en stabil potential inom endast 0,8 ± 0,3 sek (n = 6) (fig 6C). Detta understryker den överlägsna tidsupplösning koncentriska jämfört med dubbelpipiga mikroelektroder.

5. Dissektion av Tissue

1. För generering av akut skivor, söva möss av postnatal dagar 16-20 _med CO2 och snabbt halshöggs (efter rekommendation från Europeiska kommissionen offentliggjorde i: Eutanasi av försöksdjur, Luxemburg: Byrån för officiella publikationer Europeiska gemenskapernas, 1997, ISBN 92-827-9694-9).
2. Förbered hippocampus vävnadsskivor (tjocklek 250 um), efter en standardprocedur (se t ex ^14).

6. Experimentella förfaranden

1. Överför en skiva i den experimentella kammaren och fixa det med enrutnät.
2. Sänk den kalibrerade jonselektiva mikroelektroden på skiva yta och spetsa stratum radiatum av CA1-regionen till ett djup av ca 50 | im med elektroden.
   OBS: Om du trycker segmentet yta med mikroelektrod leder till karakteristiska fluktuationer i jonkänsliga fat. Dessutom skador på cellerna under impalement av vävnaden orsakar variationer också. Vänta tills baslinjen har stabiliserats.
3. För tryck tillämpning av sändar agonister, fylla en ansökan pipett med förening (t.ex. 0,5 mM glutamat). Fäst pipetten till en mikromanipulator och koppla den till en tryckappliceringsanordning.
4. Lägre ansökan pipett in i vävnaden och försiktigt placera den i närheten av spetsen på den jonselektiva mikro (~ 20-40 um). Starta tryck ansökan (t.ex. 10 sek, 40 mbar) och spela in spänningsändringar som övervakas av jonselektiva mikro.
5. För bad tillämpning av droger, swkliar mellan olika perfusion salines för en fastställd tidsperiod.
6. För att avsluta experimentet, försiktigt dra tillbaka jonselektiva mikro från vävnaden och registrera varje förändring i potentialer från den ursprungliga nollvärdet som kan ha inträffat under en längre inspelning perioder.
7. Ta slice preparatet från badet och utför en andra kalibrering av jonselektiva mikro.
   OBS: Detta är nödvändigt eftersom elektrodspetsen kan bli igensatta under dess rörelse genom vävnaden. Därför är det viktigt att se till att elektroden svarar fortfarande ordentligt på förändringar i jonkoncentrationer. Experiment bör avvisas om elektrodens svar på en tio-faldig förändring i jonkoncentration har minskat med mer än 10%. Väl arbetselektroder kan i princip återanvändas i flera experiment. Detta gäller särskilt för koncentriska elektroder, som till och med kan pågå i flera dagar. Det är emellertid viktigt att kalibrering är rerökig före och efter varje enskild experiment för att säkerställa en väl fungerande elektroderna.

7. Data Analysis

1. För att konvertera spänningssvaret hos den jonselektiva elektroden på förändringar i extracellulär jonkoncentration, först konvertera ekvation 2 för att bestämma förändringen i det potentiella AV _{jon (mV)} enligt följande (demonstreras här för K ⁺ -känsliga elektroder, analoga förfarande tillämpas för Na ⁺ -känsliga elektroder):

V _{K +:} förändringar i potential valinomycin fat (mV)

s: Nernst lutning

^K +] _B: baslinje koncentration av kalium (i vårt fall 2,5 mM K ⁺⁾

K ^+] _o: förändringar i [K ^+] _o under experimentet

2. Beräkna det aritmetiska medelvärdet av backarna som härrör från de enskilda logaritmiska tomter of kalibreringen före och efter försöket (se Figur 5B, 6B; se punkt 4,8) för att hämta "s".
3. För att beräkna förändringar som [K ^+] _o (Δ [K ^+] _o, i mM), ordna ekvation 3 till:

Representative Results

För övervakning ^[K +] _o och förändringar av detta som svar på excitatoriska aktiviteten, en dubbelpipig kaliumselektiva mikroelektrod insattes i stratum radiatum av CA1-området. Några minuter efter impalement, den jonselektiva fat av elektroden nått en stabil baslinje (Figur 7A), vilket motsvarar ett ^[K +] _{o av} ca 2,8 mM, ett värde som ligger nära den ^[K +] i ACSF används ( 2,5 mM). Bad applicering av 0,5 mM glutamat för 10 sek inducerade en reversibel ökning av ^[K +] _o med ca 4 mM, följt av en undersväng under baslinjen som uppgår till ~ 0,7 mM (figur 7A). Sänkning av glutamatkoncentrationen till 0,4, 0,3 och 0,2 mM orsakade en motsvarande minskning i amplitud både övergående ökning och undersväng i [K ^+] _o (Figur 7A).

oad / 53058 / 53058fig7.jpg "/>
Figur 7. Extracellulära kalium transienter som svar på excitatoriska aktivitet. (A) [K ^+] _o transienter, bestående av en ökning följt av en undersväng under baslinjen, framkallad av bad tillämpning av olika koncentrationer av glutamat i 10 sekunder som anges. (B) Inverkan av en perfusion med glutamatreceptorblockerare (CNQX, 100 iM, APV, 100 M) och tetrodotoxin (TTX, 0,5 M) på [K ^+] _o transienter induceras genom bad tillämpning av 0,5 mM glutamat under 10 sekunder. (C) Spontan [K ^+] _o transienter i närvaro av 0mg ²⁺ / BIC. Experiment som visas i AC utfördes med användning av dubbelpipiga elektroder. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.

Tidigare experiment har visat att sådana glutamat-inducerad [K ^+] _o signaler inte påtagligt förändras under applicering av TTX, och är därmed i stort sett oberoende av öppnandet av spänningskänsliga natriumkanaler och neuronal aktionspotential generation ^15,16. Att studera mekanismerna bakom de observerade [K ^+] _o förändringar som svar på glutamat, tillämpade vi glutamatreceptorblockerare, nämligen CNQX (100 iM, blockerare av AMPA-receptorer) och APV (100 iM, blockerare av NMDA-receptorer) i närvaro av TTX (0,5 M). Vid bad perfusion med dessa blockerare, glutamatinducerad [K ^+] _o förändringar var praktiskt taget avskaffats, bekräftar deras beroende av öppnandet av jonotropa glutamatreceptorkanaler såsom rapporterats tidigare (t.ex. ^17, Figur 7B).

För att ytterligare visa tHan relevans glutamaterga excitation för generering av extracellulärt [K ^+] signaler, var skivor perfusion med nominellt Mg ²⁺ -fri saltlösning innehållande 10 iM bicucullin metiodid (0mg ²⁺ / BIC). Detta lindrar spänningsberoende Mg ²⁺ -block av NMDA-receptorer och dämpar inhibition genom att blockera GABA _{A-receptorer,} vilket spontan återkommande epileptiform aktivitet i nätverket (t.ex. ^18,19). Som väntat ^20, spontan, återkommande [K ^+] _o transienter, som uppgår till ca 1,5 mM detekterades i 0mg ²⁺ / BIC saltlösning (Figur 7C). Mellan dessa svar, mindre [K ^+] _o transienter med en genomsnittlig amplitud av omkring 0,2 mM inträffade (figur 7C).

I en andra uppsättning experiment använde vi [Na ^+] -känsliga microelectrodes att bestämma [Na ^+] _o förändringar framkallade genom tillämpning avglutamat agonister. Här har vi också jämfört svarsegenskaperna hos dubbelpipiga och koncentriska mikroelektroder som använder två olika applikations paradigm. ^[Na ^] -känsliga mikroelektroder placerades in i stratum radiatum på ett djup av ca 50 ^ M. Efter en stabil baslinje uppnåddes, var glutamatagonist-L-aspartat tillämpas per bad perfusion (10 mM, 120 sekund, bad perfusion vid 2,5 ml / min). Såsom observerats tidigare ^21, tillämpning av aspartat orsakade en långsam minskning av [Na ^+] _o med ca 15 mM, som varade ca 5 minuter och sedan började återhämta sig tillbaka till baslinjen (Figur 8A). Noterbart medan toppamplituder och kinetik för [Na ^+] _o signaler bestäms av båda elektroderna var nästan identiska under dessa förhållanden, koncentriska elektroder uppvisade en mer stabil baslinje och en lägre ljudnivå (figur 8A).

För att testa r esponse egenskaperna hos de olika elektroderna under ett snabbare applikation paradigm vi tryckapplicerade glutamat genom en fin glaspipett placerad i stratum radiatum på ett avstånd av 20 till 40 | im från spetsen av den jonselektiva mikroelektrod. Som väntat ^21, tillämpning av glutamat (10 mM) under 200 ms förorsakade en minskning av ^[Na ^] _o (figur 8B). De toppamplituder i nätverket [Na ^+] _o minskning var i samma intervall för båda typerna av elektroder (dubbelpipiga: 4,5-13,5 mM, n = 14; koncentriska: 2,0-19,1 mM, n = 15). Men i motsats till de resultat som erhölls med långsam bad perfusion (se ovan), inte bara signal-till-brus-förhållande, men också tidsförloppet av ^[Na ^] _O-signaler som detekteras av de två typerna av elektroder skilde sig signifikant. Den genomsnittliga tiden till topp var 3,5 sekunder för dubbelpipiga och endast 1,3 sekunder för de koncentriska mikroelektroder.

ve_content "> Därför visar dessa resultat och bekräfta snabbare svars kinetik koncentriska kontra dubbelpipiga Na ⁺ -selektiv microelectrodes, (se Figur 6C och 8B), som noterades även för ^Ca2 + och pH-selektiva motsvarigheter ¹⁰ . Till skillnad från den tidigare studien, där korta skurar synaptiska stimulering utfördes för att framkalla snabb synaptically-inducerade ion transienter, det var bara en tendens, men ingen signifikant skillnad i medel toppamplituder mellan koncentriska och dubbelpipiga elektroder med vår ansökan paradigm. Detta berodde förmodligen på det faktum att avståndet för ansökan pipetten från spetsen av den jonselektiva mikroelektrod varieras med en faktor av två (20-40 | im), och följaktligen, att den maximala glutamatkoncentrationen vid målregionen var inte densamma i olika experiment, hindrar alla befintliga skillnaden i toppamplituder.

(A) Top spår: Förändring i voltaGE av referens fat (V _ref) av en dubbelpipig elektrod (svart streckad kurva) och en koncentrisk elektrod (grå spår) som svar på förändringar i badet ^Na * koncentration ^([Na *] _b) såsom anges. Notera att spänningssvaren från båda elektroderna är praktiskt taget identiska. Bottom spår: Förändringar i spänning ^för Na * -potential (V _{Na *)} av en dubbelpipig elektrod (svart spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) som svar på förändringar i ^[Na *] _f. (B) Halv logaritmiska tomter i nätverket [Na ^+] _b kontra V _{Na +} båda elektroderna. Linjära tomter av uppgifterna visar en lutning på ca 48 mV för båda elektroderna. (C) Svar för V _{Na *} av en dubbelpipig (svart spår) och en koncentrisk elektrod (grå spår) till en snabb förändring av ^[Na ^] _b från 152 mM till 70 mM. Notera att reaktionstiden för den koncentriska elektroden är signifikant FASTer. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20).

Bild 8: Extracellulära natrium transienter som upptäckts av dubbelpipiga och koncentriska elektroder.
(A) Övergående förändringar av _Vref och [Na ^+] _o inducerad av bad perfusion med 10 mM aspartat för 120 sek såsom indikeras av stapeln. De övre spåren visar en inspelning utförs med en dubbelpipig elektrod, var de lägre spår som spelats in med en koncentrisk elektrod. (B) Övergående förändringar i V _ref och [Na ^+] _o inducerade av lokalt tryck applikation med 10 mM glutamat under 0,2 sekunder som indikeras av pilen. De övre spåren visar en inspelning utförs med en dubbelpipig elektrod, var de lägre spår som spelats in med en koncentrisk elektrod.Prickade röda linjerna representerar linjära passar under perioden mellan början av signalen till sitt maximum. Notera att reaktionstiden för den koncentriska elektroden är betydligt snabbare under detta förhållande. För illustrationssyfte, var spår jämnas med en Sawitzky-Golay filter (bredd 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vätske carrier-baserade, jonselektiva elektroder har framgångsrikt använts i årtionden och för många joner, mycket specifika sensorer finns ^22-26. Vid användning i det extracellulära utrymmet (ECS) av ryggradsdjur hjärnan preparat, måste man ha i åtanke är dock att detta är en ganska invasiv teknik: medan bredden på ECS är endast cirka 20-50 nm, diameter jonselektiva microelectrodes är cirka 1 pm (dubbelpipiga elektroder) eller större (koncentriska elektroder). Spetsarna på jonselektiva mikroelektroder kommer således inte bara skada vävnaden under impalement av vävnaden, men också förstora ECS, som främjar en underskattning av jon transienter. Trots dessa fallgropar, extracellulära jon transienter som svar på nervaktivitet är anmärkningsvärt konsekvent mellan olika laboratorier ^7,8, styrker tillförlitligheten av denna metod.

Prestandan och lämplighet jonselektiva elektroderär beroende av deras känslighet och selektivitet, som definieras av sensor cocktail ("vätskemembran jonofor") som används. Sensor drinkar innehåller en speciell bärarmolekyl, t.ex. valinomycin för K ⁺ -selektiv mikroelektroder som uppvisar en hög selektivitet för kalium ^27. Trots detta kan korsreaktivitet med andra joner förekommer och måste testas. Valinomycin uppvisar en signifikant korsreaktivitet för ammonium, som måste beaktas vid tolkning av resultaten (t.ex. ^11,12). Vidare eftersom spänningen-svaret hos jonoforer följer en Nernstian beteende (jfr ekvation 1), signal-till-brusförhållande och tröskeldetektering beror på koncentrationen av jonen, som skall mätas. Således, medan små [K ^+] _o transienter framkalla stora spänningsändringar mot låga baslinjen [K ^+] _o, liten [Na ^+] _o transienter är mycket svårare att upptäcka mot high baslinjen [Na ^+] _o (se Figur 5 och 6).

Utförandet av jonselektiva elektroder bestäms också av tidsupplösning, som till stor del styrs av den elektriska tidskonstant. Den senare bestäms huvudsakligen av den axiella resistansen hos sensorn, och av den fördelade kapacitansen längs längden av pipetten, mellan sina interna lösningar och det yttre fluidumet. I den dubbelpipiga konfiguration, är resistansen hög, på grund av den lång kolonn av återfyllt jonsensor. För ett givet isolerande dielektrikum (i detta fall borsilikatglas), är kapacitansen styrs av den dielektriska tjocklek. I dubbelpipiga elektroder, uppgår den dielektriska bredd till glasväggen av pipetten. Som glaset tunnar nära spetsen, faller den dielektriska bredd, och kapacitansen ökar. Dessa faktorer samverkar för att producera elektroder med svarstider som sträcker sig från flera hundra millisekunder till flerasekunder, eftersom dessa faktorer är varierande.

En stor fördel med den koncentriska utformning är att såväl den axiella motståndet och kapacitansen till badet är kraftigt minskat. De koncentriska pipett shuntar de flesta av resistansen av den återfyllda jonbytare, vilket innebär att endast en kvarleva i de sista få mikrometer före spetsen. Dessutom är fyll lösning inom den koncentriska pipetten fysiskt distanserade från badet, åtskilda av tjockleken av två glasväggar, vilket kraftigt minskar kapacitansen. Som framgått tidigare ^10, är den kombinerade effekten av minskad resistans och kapacitans en förbättring av tidsupplösning av två storleksordningar. I fallet med koncentriska ^Ca2 + och pH-mikroelektroder, 90% svarstider var så låg som 10 till 20 ms ^10. En besläktad fördel med den koncentriska utformningen är den lägre brusnivå (se Figur 8). På grund av den kraftigt minskad motståndskraft, spänningstransienter från någon Ambient buller minimeras. Dessutom är återhämtning från sådana transienter snabb, på grund av den snabba tidskonstanten. Sådana artefakter är därför liten och snabb och har en mindre störande effekt på fysiologiska inspelningar (se Figur 8).

Det finns också nackdelar med den koncentriska teknik. För det första är deras montering mer komplex och tidskrävande. En andra nackdel är behovet att placera en separat referensmikroelektrod med sin spets, vilket innebär användning av antingen ett separat mikromanipulator eller en specialiserad dubbel manipulator. Slutligen kan dubbelpipiga microelectrodes utökas till en trippel pipa design, möjliggör detektion av två olika jonslag samtidigt ^28, vilket inte är möjligt för koncentriska elektroder.

Vanligaste fallgropar

Ineffektiv silanisering.

Det viktigaste steget, och främsta hindret i tillverkning av alla vätske-senseller baserade jonselektiva mikro är silaniseringen förfarandet. När elektroderna inte svarar på förändringar i specifik jonkoncentration, eller svara med en sub-Nernstian respons (dvs väl mindre än 58 mV per tiofaldig skillnad koncentration), är dålig effekt av silanisering typiskt orsaken. I vår erfarenhet, kan detta inträffa om luftfuktigheten är för hög eller för låg, typiskt förhållanden på höjden av sommaren, eller vintern, respektive. Om det är möjligt att utöva en viss kontroll över rumsfuktighet, kan dessa problem övervinnas.

Elektrod resistansen är för hög.

Vid behov kan resistansen hos jonkänsliga fat minskas genom fasning. För detta ändamål utsätter dess spets till en stark stråle av ett slipmedel suspenderat i vatten i ett par sekunder. Detta kommer att orsaka dess översta spets för att bryta och sänka motståndet till det önskade värdet.

Saltbryggor.

Saltbroar mellan jon och referens fat leder till dåligt eller ingen-svarande elektroderna och kan därmed också kraftigt förvirra sina resultat i kalibreringen. Som nämnts ovan (se punkt 1.6.), Är detta främst en fråga när dubbelpipiga theta glas väljs, men är en sällsynt företeelse när du använder offset, vridna fat teknik som beskrivs här.

Med enkel tillverkning i åtanke, kan ofta användas den ursprungliga dubbelpipiga utformning av Lux ²⁹ lönsamt. Denna metod använder pre-fyllning av jon och referens fat med saltlösningar, en snabb exponering för en silanlösning genom sin sug och utvisning från spetsen, följt av inkorporering av jonbytare, även via spetsen (se ^30,31) . Dessa elektroder kan tillverkas på ungefär 10 minuter, men deras spetsstorlek är typiskt 4 um eller mer och de är mer benägna att misslyckas under ett experiment. I motsats till metoder som silaniseringen innebär exponering för silanånga och värmeIng kan producera elektroder med mindre tips som varar dagar och ibland veckor.

Sammantaget finns det flera protokoll och metoder om hur du förbereder jonselektiva microelectrodes. Här har vi beskrivit två huvudsakliga förfaranden för tillverkning av tvinnade dubbelpipiga samt koncentriska mikroelektroder som fungerar bra och tillförlitligt i våra laboratorier, med en total framgång på nära 100%. Viktigare, kommer dessa tekniker kunna överlåtas till mätning av andra joner arter, däribland pH eller kalcium, och kommer också att kunna tillämpas på andra beredningar än i hjärnan, inklusive vätskefyllda hålrum eller vätskor i allmänhet. Sist men inte minst, jonselektiva microelectrodes tillåter bestämning av jonkoncentrationer inuti celler. På grund av deras relativt stora spetsstorlek (~ 1 pm), detta kommer dock att vara möjligt endast i celler med en stor cellkroppen, t.ex. sådana som finns i ryggradslösa preparat ^28,32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Abrasive	MicroPolish	Buehler GmbH	Dissolved in A.dest
Borosilicate-glass capillaries	1405059	Hilgenberg	Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the sensor of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	For the reference of double-barreled microelectrodes
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-200TF-15	Science Products	Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm
Borosilicate glass capillaries with filament	GB-120TF-10	Science Products	Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments
Electrometer amplifier with headstage		Custom-made	Rin = 10 TΩ and Ibias=50 fA-1pA (commercially available  alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)
Experimental chamber		Custom-made	Commercially available from e.g.   Warner Instruments,USA;  Scientifica, UK
Furnace		Heraeus	Must stay constant at 200 °C
Hard sticky wax / dental wax	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Hot plate		Custom-made	Must stay constant at 40 °C
Microelectrodes holder made of plexiglas		Custom-made	Double-barreled: O.D.  capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.  capillaries 2 mm
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
Stereo microscope	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette puller	Model PP-830	Narishige	Concentric microelectrodes
Pipette puller	Model P-97	Sutter Instruments	Sensor of concentric microelectrodes
Pneumatic drug ejection system	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel dovetail stage	DT 25/M	Thorlabs
Two-component glue	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together
Silverwire	99.9%	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
Vertical puller	Type PE-2	Narishige Scientific Instruments	With a revolvable chuck for  double-barreled microelectrodes
x/y translational stage		Custom-made
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma aldrich	440191	CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin
L-Aspartic acid	Sigma aldrich	A9256	Activates NMDA and non-NMDA and EAATs
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma aldrich	G1626	Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),  mGluRs and EAATs
Potassium ionophore I - cocktail B	Fluka	60403	Based on valinomycin; CAUTION toxic
Sodium ionophore II - cocktail A	Fluka	71178	Based on ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic
Water, ultra pure	Sigma aldrich	W3500