Abstract
Enzymatiska mikroelektrod biosensorer har ofta används för att mäta extracellulär signalering i realtid. De flesta av deras användning har varit begränsad till hjärnsnitt och neuronala cellkulturer. Nyligen har denna teknik använts till hela organ. Framsteg inom sensordesign har möjliggjort mätning av cellsignalering i blod-perfusion in vivo njurar. Föreliggande protokoll listar de steg som behövs för att mäta ATP och H2O 2 signalering i råttnjure interstitium. Två separata sensor konstruktioner används för ex vivo och in vivo-protokoll. Båda typerna av sensorer är belagda med ett tunt enzymatisk biolayer ovanpå en permselektivitet skikt för att ge snabb svarar, känsliga och selektiva biosensorer. Den permselektivitet Skiktet skyddar signalen från störande i biologisk vävnad, och den enzymatiska skiktet utnyttjar sekventiell katalytisk reaktion av glycerolkinas och glycerol-3-fosfosfat oxidas i närvaro av ATP för att framställa H2O 2. Uppsättningen av sensorer som används för ex vivo-studier detekterades ytterligare analyt genom oxidation av H2O 2 på en platina / iridium (Pt-Ir) trådelektroden. Sensorerna för studier in vivo istället baseras på en minskning av H2O 2 om en medlare belagd guldelektrod avsedd för blod-perfusion vävnad. Slutkoncentrationsförändringar upptäcks av realtids amperometri följt av kalibrering till kända koncentrationer av analyt. Dessutom kan specificiteten hos den amperometriska signalen bekräftas genom tillsats av enzymer såsom katalas och apyras som bryter ner H2O 2 och ATP på motsvarande sätt. Dessa sensorer förlitar sig också starkt på korrekta kalibreringar före och efter varje experiment. Följande två protokoll fastställa studiet av realtidsdetektion av ATP och H 2O 2 i njurvävnad, och kan vidare modifieras för att förlänga den beskrivna metoden för användning vid andra biologiska preparat eller hela organ.
Introduction
Enzymatisk mikroelektrod biosensorer (även kallad sensorer i den nuvarande manuskriptet) har varit ett värdefullt verktyg för att studera dynamiska signalprocesser i levande celler och vävnader. Sensorerna ger ökad tidsmässiga och geografiska cellsignalmolekyler i biologiskt relevanta koncentrationer. I stället för provtagning och analys av extracellulära vätskor tagna vid intervall under långa tidsperioder, dessa sensorer svara så snabbt som deras enzymer reagerar till analyten, varigenom realtidsmätningar 1,2. Snabb upptäckt av mellanrums koncentrationer av autokrina och parakrina faktorer, såsom puriner eller väteperoxid, och dynamiken i deras frigivning kan användas för att upprätta en profil för effekterna av läkemedel i normala och patologiska tillstånd 3. För närvarande har de flesta applikationer som använder sensorer varit i hjärnvävnad skivor och cellkulturer 4-10. De protokoll som beskrivs i detta manuskript mål attfastställa medel för att noggrant mäta realtid koncentrationer av analyter i hela njurar.
Följande protokoll utvecklades för att studera interstitiell ATP och H2O 2 signalering i njurarna. I naturliga miljö i njurarna, är extracellulärt ATP snabbt kataboliseras av endogena ectonucleotidases till dess derivat (ADP, AMP och adenosin). De sensorer som används här är mycket selektiva till ATP över andra puriner eller ATP nedbrytningsprodukter 11. Detta ger en stor fördel eftersom det tillåter noggrann övervakning av de konstanta och dynamiska koncentrationer av ATP-frisättning och dess funktion signalering. Interstitiell ATP koncentrationen mäts med hjälp av en kombination av två mikroelektroder, en ATP-sensor och en Null sensor. Den Null sensorn i kombination med katalas program kan upptäcka interstitiell H 2 O 2 koncentrationer 12. Följande protokoll använder två olika utformningar av sensors som har egenskaper som optimala för antingen ex vivo eller in vivo applikationer.
Båda konstruktioner är baserade på den sekventiella katalytisk reaktion av glycerolkinas och glycerol-3-fosfat-oxidas som finns i en sensor enzymatisk skikt och drives av närvaro av ATP. I uppsättningen av sensorer som används i ex vivo-studier, H2O 2, den slutliga enzymatiska reaktionsprodukten, detekteras genom oxidering på ett platina / iridium (Pt-Ir) trådelektroden. Sensorer för in vivo-studier istället baseras på H2O 2 rabatt på en medlare belagd guldelektrod avsedd för blod-perfusion vävnad. Visas i figur 1 är ett schema av de båda protokollen i detta manuskript. Den Null sensorn är identisk med sin motsvarande ATP sensor förutom att det saknar de bundna enzymerna. Därför, förutom detekteringen av H2O 2 med katalasenzym, Null sensor meader ospecifika störningar. ATP-koncentrationer beräknas genom att subtrahera Null upptäckta ospecifika interferenser och bakgrund H2O 2 från ATP sensorsignalen. Flera sensorer är också kommersiellt tillgängliga för att upptäcka andra analyter inklusive adenosin, ionosine, hypoxantin, acetylkolin, kolin, glutamat, glukos, laktat, d-serin för ex vivo applikationer eller adenosin, ionosine och hypoxantin för in vivo när det paras ihop med motsvarande Null sensorn.
Förmågan hos sensorn att noggrant detektera analyter är beroende av korrekt pre- och post-kalibreringar 13. Detta säkerställer att analysen står för drift i sensorkänslighet som inträffar under användning i biologiska vävnader. Sensorn har en depå av glycerol som används som ett reagens i sensor enzymatiska reaktioner. Om givaren inte används i bad lösningar innehållande glycerol, kommer det tvätta bort med tiden. Kortare rInspelning tider är då nödvändigt att minimera sensordrift. Dessutom sensor nedsmutsning av endogena proteaser och proteinfragment kan kraftigt minska känsligheten hos sensorerna 14.
Föreliggande manuskriptet fastställs användningen av enzymatiska mikroelektrod biosensorer för ex vivo och in vivo njurpreparat. Realtid analyt kvantifiering ger oöverträffad detaljrikedom av cellsignalering som kan avslöja nya insikter mekanismerna för njursjukdomar och farmakologiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande djurförsök anslutit sig till NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Förhandsgodkännande erhölls från Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
OBS: Översyn av sensortillverkarens anvisningar bör göras under försöket design och före deras användning. Efter dessa instruktioner kommer att ge optimala resultat när du använder sensorerna.
1. Sensor kalibrering
- Bered nya stamlösningar före starten av experimentet.
- Skapa Buffert A innehållande 10 mM NaPi-buffert, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2 och 2 mM glycerol. Justera pH till 7,4 med användning av NaOH. Förvara vid 2-8 ° C.
- Användning av en stam ATP-koncentration (100 mM) lagrades vid -20 ° C, skapa en färsk 10 mM ATP kalibreringslösning genom att tillsätta 10 | il lager till 90 pl av buffert A.
- Rehydrera ATP sensorn genom att placera dess spets (Figur 2) till than rehydrering kammare innehållande buffert A under minst 10 min vid 2-8 ° C.
OBS: Efter rehydratisering sensorerna bör inte utsättas för luft under mer än 20 sek eller sensorkänslighet kan minskas. Om långa exponeringar till luft förväntas, doppa givaren en kort stund i en lösning av glycerol. Sensorerna kan användas för flera experiment, men dessa måste ske på samma dag som sensor rehydrering. Sensorerna kan lagras i rehydrering kammaren med buffert A för upp till 24 timmar. - Slå på tvåkanals potentiostaten (Figur 3) och starta inspelningen systemprogramvaran.
- Bered en kalibreringskammare med 3 ml av buffert A. Placera referenselektroden i kalibreringskammaren. Ta varje sensor från vätskeersättning kammaren, sedan bifoga det till manipulatorn och sätt in den i kalibreringskammarlösningen.
OBS: Använd en vanlig silikonbelagt petriskål som en kalibreringskammare. Utför alla kalibreringar och studies i Faradays bur på en högpresterande labb luftbord för att minska signalbruset under amperometri inspelningarna (Figur 4). Kalibreringar bäst så nära till början av datainsamling som möjligt. För tillämpningar in vivo den optimala tiden för kalibrering är under djuret efter operationen återhämtningsperioden. - Ex vivo-kalibrering
- Utför cyklisk voltametri i kalibreringskammaren genom att cykla sensorerna från -500 mV till 500 mV vid en hastighet av 100 mV / s under 10 cykler. Detta förbättrar avsevärt känsligheten hos sensorerna. Se figur 5 för spåren observerade från 10 cykler.
- Polarisera sensorerna till 600 mV efter den sista cykeln. Sensor strömmen avklinga till en asymptote. En stadig avläsning uppnås efter minst 5 min. Spela in noll läsning.
- In vivo-sensorkalibrering
- Utför inte den cykliska voltammetri på in vivo sensors. Istället polarisera sensorn i kalibreringskammaren för 30 sek till 500 mV. Ställ sedan in potentiostaten till 0 mV och låta sensorströmmen att stiga till en asymptote. Sensorströmmen kommer att ta minst två minuter till asymptote. Spela in noll läsning.
- Följd lägga inställda mängder av ATP-lösning in i kammaren för att åstadkomma en kalibreringslinje som omfattar ett önskat detektionsområde. Den ATP-lösning ger en skarp topp i sensorsignalen initialt, följt av en avklingning som ATP diffunderar jämnt i hela kammaren. Spela signalvärden när signalnivån har stabiliserats efter varje ATP-tillsats. Figurerna 6A och 7 visar spår och föreslog ATP-koncentrationer för både ex vivo och in vivo-studier, respektive.
OBS: Det är viktigt att bekräfta selektivitet elektroderna genom att använda rengöringsmedel av analyterna. Föreliggande protokoll som används apyras att testa specificiteten av ATP-sensor och katalas för H <sub> 2 O 2 signal (figur 6B). Om läkemedel skall administreras, bör mätning av deras reaktivitet med sensorerna bestämmas innan studien. - Tillsätt 3 il apyras från ett lager av 2 mg / ml (89 UN / mg) för att testa specificiteten av ATP sensorn (nuvarande produceras av ATP ansökan bör minska till nollnivån (Figur 7).
- Tillsätt 3 il katalas från ett lager av 2 mg / ml (100 UN / mg) för att testa specificiteten av nollsensorn (nuvarande produceras av H2O 2 ansökan bör reduceras till noll behandlingen).
2. Djur Kirurgi för Sensor Studies
- Kirurgi för ex vivo
- Söva försöksdjur med isofluran (5% induktion, 1,5 till 2,5% underhåll) / medicinsk kvalitet O2 eller annan godkänd metod. 15 "12 Djur skall kontinuerligt övervakas för att säkerställa en tillräcklig bedövning. Stkan andningsfrekvens och tå nypa reaktion används för att bekräfta korrekt anestesi.
Obs: Euthanize djuret enligt godkända IACUC protokoll. Vid slutförandet av alla procedurer för icke-överlevnad avliva djupt bedövade djur genom torakotomi inducera pneumothorax att säkerställa humana nedläggningen av djuret 12. - Placera råttan på en temperaturstyrd operationsbordet i ryggläge. Samtidigt upprätthålla en lämplig anestesidjups, göra en mittlinje snitt på cirka 5 cm i linje med den vänstra njuren och exponera distal bukaorta.
- Linda en ligatur runt celiaki och överlägsen mesenteriska artärer och bukaorta ovanför dessa artärer men inte ligera. Vira två ligaturer runt bukaorta under njurartärerna.
- Kläm bukaorta ovanför ligaturer. Knyt den nedre ligatur. ANVÄNDA KATETER bukaorta med polyeten slang (PE50). Säkra katetern med andra aorta ligatur.
- Ta bort klämman och ligera mesenteriska och celiaki artärer. Perfundera njuren vid 6 ml / min med Hanks balanserade saltlösning vid RT i 2-3 min tills njuren är helt vitkokas.
- Skära ut njuren och katetern, anslutna delen av aortan. Placera njuren i en 3 ml petriskål fylld med badlösningen.
Anm: Experiment protokoll kan utföras vid RT. Badlösningen innehåller i mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,35 justerad med NaOH.
- Söva försöksdjur med isofluran (5% induktion, 1,5 till 2,5% underhåll) / medicinsk kvalitet O2 eller annan godkänd metod. 15 "12 Djur skall kontinuerligt övervakas för att säkerställa en tillräcklig bedövning. Stkan andningsfrekvens och tå nypa reaktion används för att bekräfta korrekt anestesi.
- Kirurgi för in vivo
- Söva råttan med godkända IACUC protokoll. För in vivo-analys söva råttorna med ketamin (20 mg / kg im) och Inactin (50 mg / kg ip). Djur måste övervakas kontinuerligt för att säkerställa en tillräcklig bedövning. En stabil andningsfrekvens och tå nypa reaktion används för att bekräfta korrekt anestesi.
- Efter korrekt anestesi djup är fåEd, placera råttan i ryggläge på en temperaturstyrd jordad yta ligger på luftbordet. Ytan skall förvärmas och hölls vid 36 ° C.
- Samtidigt upprätthålla god anestesidjups, göra en mittlinjeincision ca 5 cm i linje med njurarna.
- Använd en sutur för att avleda och förankra den kutana och subkutana vävnaden så att hela njuren är synlig. Placera njure i en njure kopp för att minimera eventuella rörelseartefakter.
- Använd en IV infusion av 2% BSA: 0,9% NaCl vid 1 ml / 100 g / h via jugularvenen för att bibehålla blodvolymen. Kanylera båda urinledarna för urinsamling. Placera band runt de överlägsna mesenteriska och celiac artärer och den distala aorta för manipulering av renal perfusionstryck (fig 10a).
- Om det krävs av tillämpningen av farmakologiska medel under experimenten in vivo, är insättning av en interstitiell kateter rekommenderas (figurerna 10B
3. Data Acquisition Setup
- Öppna datainsamlingsprogram och sätta sin polaritet för både ex vivo och in vivo-experiment till Anodisk Positiv. Ställ in programmet för att spara data som ASCII-kod.
- Placera mikromanipulatorer för snabb insättning av sensorerna i njurarna.
OBS: Alternativt kan du använda en dummy sond fäst vid mikromanipulator för att uppnå den önskade placeringen av sensorer. - Ex vivo datainsamling
- Perfundera njuren med badlösningen (från 2.1.6) via kanyl aortan med en konstant hastighet av 650 | j, l / min. Med hjälp av kirurgisk sax, försiktigt bort njurkapseln, vilket är nödvändigt för sensor insättning.
- Säkra njuren med gummiband fastspänd över njuren och fästa till det silikonbelagda skålen med stift.
- Placera referenselektroden nära njuren i petriskål med sin spets nedsänkt ibuffertlösningen.
- In vivo-datainsamling
- Placera njure i en njure cup. Beroende på stammen och djurets ålder använder en storlek på kopp som håller njuren löst. Fig 8 visar två storlekar av njur koppar. Liknande koppar används för olika fysiologiska metoder fokuserade på en analys av njurfunktionen, såsom micropuncture etc 16.
Obs: Läget för njur koppen är avgörande för att ta bort den mekaniska ljud som alstras av djuret andas, men bör inte störa eller blockera njur perfusion eller urinflödet. - Låt 45 minuter på återhämtning tid innan du utför datainsamling.
- Med användning av en 26-30G nål, göra en punktionshålet i det önskade läget och djupet av sensorn i njuren. Blot ytan hålet för avlägsnande utsöndrade blod. Lägg glycerollösning till ytan av njuren. Detta kommer att förhindra njurytan från att torka ut under experimentet. Ta bort den första sensorn från vätskeersättning kammaren och bifoga det till mikromanipulator. Snabbt, inom 20 sekunder, sätta in elektroden i den nyligen skapade hål i njuren. Upprepa steg 3,5-3,9 för noll sensorn.
- Sätt referenselektroden in i njuren, ungefär 1 cm från från sensorerna.
- Placera njure i en njure cup. Beroende på stammen och djurets ålder använder en storlek på kopp som håller njuren löst. Fig 8 visar två storlekar av njur koppar. Liknande koppar används för olika fysiologiska metoder fokuserade på en analys av njurfunktionen, såsom micropuncture etc 16.
- Slå på potentiostat och aktivera inspelningsprogrammet på datorn. Figur 9 visar den slutliga installationen av ex vivo njur datainsamling. Figur 10 visar den slutliga installationen av in vivo njur datainsamling med en införd kateter.
4. Dataanalys
- Importera ASCII datafilen till Origin eller andra liknande program.
- Koncentration aktuella relationen
- Använd linjär anpassning / SLUTA SIG TILL funktion för att bygga en linjär koncentration (x-axeln) till nuvarande (y-axeln) förhållande till ATP eller H 2 2 kalibreringspunkter (figur 6 och 7).
linjär anpassade linjen: y = mx + b
- Använd linjär anpassning / SLUTA SIG TILL funktion för att bygga en linjär koncentration (x-axeln) till nuvarande (y-axeln) förhållande till ATP eller H 2 2 kalibreringspunkter (figur 6 och 7).
- Likställa strömmen till koncentrationen
- Subtrahera de uppmätta spår av nollsensorn från dem av ATP sensorn för att erhålla den faktiska ström som produceras genom intracellulär ATP.
- Konvertera ATP värdena i pA erhållits genom amperometri till nM användning av kalibreringsekvationen beskrivs i 4.2.1. Bestäm koncentrationen av den subtraherade uppgifter spår av ATP sensorn genom att importera varje justerade ström in värdet "x" och lösa för y (koncentrationen av analyt).
- På liknande sätt beräknar H2O 2 koncentration från dess kalibreringsekvationen om det behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformningen av den enzymatiska mikroelektroden biosensorn tillåter realtidsdetektion av analyter i hela njurar. Det allmänna försöket designen för antingen ex vivo eller in vivo studier illustreras i Figur 1 .De sensorer som används och de kirurgiska förfaranden är olika beroende på huruvida studien är ex vivo eller in vivo.
För att få reproducerbara resultat, korrekt före och efter kalibreringar är kritiska. Figur 6A visar ett representativt spår av signalen sett från ex vivo ATP givare under kalibreringar. Observera att apyras snabbt elimineras ATP-signalen. Katalas hade ingen effekt på ATP-signalen och visar sin specificitet till H2O 2 det skapar (figur 6B). Kalibreringsproceduren ger en linjär anpassning som används för att beräkna de dynamiska förändringar av ATP (figur 6A, högra panelen). I VIvo sensorkalibrering ger ett liknande spår med den för ex vivo-sensorn. Men upptäcker denna sensor reduktiva stället för oxidativa strömmar och som sådan den nuvarande produceras är negativ. Kalibrering av dessa sensorer producerar också en linjär anpassning i en 0,3 till 80 ^ M intervall (Figur 7A högra panelen). Specificitet för in vivo-sensorn till ATP över andra purin produkter visas i figur 7B.
Tillvägagångssättet beskrivs här ger oss möjlighet att mäta både basala nivåer av endogena substanser och akuta förändringar till följd av läkemedelsinfusion 12. Visas i figur 11 är Ang II-inducerade förändringar av interstitiell endogena koncentration av H2O 2 i salttåliga och saltkänsliga råttor. För dessa experiment var nyligen isolerade njurar från Sprague Dawley (SD) eller Dahl saltkänsliga (SS) råttor perfunderades med en iM Ang II under konstant laminärt flöde (650 ul / min). Som shown i fig 11, Ang II inducerar akut frisättning av H2O 2 i njurar från både SD- och SS råttor. Men den maximala amplituden för varje svar var signifikant förhöjd i SS råttor, särskilt när djuren matas med en hög saltdiet 12. Visas i figur 12 är en representativ tillämpning av biosensorer in vivo. Infusionen av katalas (5 | ig / ml) fullständigt blockerar H2O 2 signalen som detekteras av biosensorn. Dessa experiment illustrerar användningen av specifika enzymatiska biosensorer kombination med den amperometriska teknik för detektering av basala nivåer av endogena substanser och realtidsmätningar av deras frigivning som svar på farmakologisk intervention. Ytterligare tillämpningar av denna metod för att studera betydelsen av purinergisk signalering och väteperoxid kommer att förbättra vår kunskap och förståelse för njur patologier som saltkänslig hypertension, renal oxeidative stress och kronisk njursjukdom.
Figur 1. Schematisk av protokollen. Kalibrering med analyt av intresse och testa dess specificitet görs omedelbart före starten av experimenten. In vivo-protokoll bör följas för komplexa fysiologiska experiment och ex vivo för farmakologiska tillämpningar. Post experiment kalibrering bör göras och beaktas vid dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Enzymatisk mikroelektrod Sensor. De tvåsensorstorlekar som används för ex vivo tillämpningar visas, 50 um och 125 um diameter. Varje sensortråd sträcker sig in i ett kapillärrör för att ansluta till en guld ändkontakten (ej visad). Infällda bilden visar en sensor spets belagd med enzymer för ATP-detektions. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dual Channel Potentiostat. Potentiostaten kanalerna märkta CH1 och CH2. 1) CH1 ATP sensoranslutning och 2) CH2 Nollsensoranslutning 3) anslutningar som är elektriskt kopplade till referenselektrod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ass = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figur 4. Sensor Setup. Datainsamlings utförs i en Faradays bur för att minska elektriskt brus och en högpresterande lab bord för ett vibrationsfritt arbetsyta. 1) En temperaturstyrd operationsbordet används för att upprätthålla djurkroppstemperatur under fysiologiska experiment 2) De mikromanipulatorer är kopplade till magnetiska monterings adaptrar för flexibel placering av sensorerna under experiment 3) En ljuskälla behövs för kirurgiska ingrepp och sensorinför 4 ) tvåkanals potentiostat 5) hållare för sensorerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg "/>
Figur 5. Cyklisk voltammetri. För ex vivo-studier, är sensorn cyklisk voltammetri utfördes under 10 cykler mellan -0,5 och 0,5 V innan kalibreringsprotokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Amperometri Kalibrering för ex vivo. (A) Kalibreringen använder tillsats av kända ATP-koncentrationer till badet lösningen. Motsvarande amperometriska värden som registrerats vid asymptoten nivå (svart spår). Strömmarna erhållna skapa en kalibreringsekvation. Ett exempel visas på den högra panelen. Den röda kurvan är Current av Null sensorn som svarar på endast tillsats av H2O 2. (B) Null sensorn är kalibrerad med tillsats av kända H2O två koncentrationer (röda pilarna) till badlösningen och asymptoterna amperometriska värdena registreras (tunna svarta pilar). Tillsats av katalas till badlösningen (tjock svart pil) resulterar i snabb ström förfall. Den högra panelen visar Null sensorkalibreringsekvationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Amperometri Kalibrering för;. In vivo Kalibrering av in vivo-elektrod utförs på ett liknande sätt som beskrivs i detalj i de ex vivo-försök med undantag av reduktionsreaktioner orsaka en backström (polaritet). (A) Tillsatsen av kända ATP-koncentrationer ger en amperometrisk ström på ATP sensorn (svart spår) men har ingen effekt på Null sensorn (röd spår). Tillsats av apyras släcker ström av ATP sensorn. (B) Specificiteten för ATP sensorn bekräftas genom tillsats av 10 | iM av olika purinerga medel (UTP, UDP och adenosin). Ytterligare tillämpningar av ATP ger en stabil påvisbar amperometrisk ström. (C) mikrofotografi av in vivo sensorer baserade på en medlare belagd guldelektrod. Klicka här för att se en större version av denna Figure.
Figur 8. Njur Koppar. I studierna in vivo, är njurar hålls fortfarande använder de rostfria njur koppar visas. Två storlekar av koppar användas för att rymma njurstorleksvariation. Dessa koppar minskar rörelse artefakter som genereras av djurets andning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Ex vivo Isolerad och perfunderades Njure. Den isolerade njuren placeras i en 1) petriskål belagd med en tjock silicone botten för stift införing 2) njurartären kanyleras och fäst vid en sprutpump för konstant perfusion under experimentet 3) ATP-sensor, 4) och Null sensorn införes i njuren 5) referenselektroden är placerad nära njuren nedsänkt i badet lösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. In vivo blod perfusion Njure. (A) Den vänstra njuren exponeras och placeras i en njure kopp, höger njure förblir intakt inuti djuret. Båda givarna är införda in i njuren. BSA: NaCl infunderas via kateter halsvenen för att motverka vätskeförlusten orsakade by den stora mittlinjen snitt (B) Exempel på in vivo-experiment med en implanterad interstitiell kateter för direkta farmakologiska tillämpningar 1) njuren innehas av en njure cup 2) ATP sensor 3) Null sensor och 4) referenselektrod infogas i den ventrala ytan av njuren 5) kateter implanteras i njuren och fäst vid en peristaltisk pump för laminära farmakologiska infusioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11. Ex vivo analys av H 2 sub> O 2 i njuren. Ang II perfusion orsakar H2O 2 release i råttnjure cortex. (A) Realtids förändringar av medelvärdet H2O 2 koncentration (grå staplarna visar standardfel) av totalt N = 8 ansökningar (4 njurar från 4 olika råttor). Barer på toppen representerar Ang II programmet. (B) Den maximala H2O 2 koncentration amplitudvärden under Ang II perfusion för Sprague Dawley (SD) och Dahl saltkänsliga (SS) råttor som matats en låga och höga saltdieter, respektive. * - P <0,05 i förhållande till SD-råttor. Siffran är anpassad från referens 12 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg "/>
Figur 12. In vivo analys av H 2 O 2. Exempel på bedömningen av interstitiell H in vivo 2 O 2 koncentration i märgen av en SS råtta livnärde en saltfattig kost (som visas i figur 10B). Den interstitiell applicering av katalas via en implanterad kateter för 5 minuters intervall gav en fullständig blockering av H 2 O 2-signalen i njurmärgen. Minskning av katalas från washout av renal blodflöde, resulterade i en partiell återhämtning av signalen, som blockerades igen med ytterligare katalas ansökan (10 min). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande protokoll har utvecklats för att ge ökad tidsmässiga och geografiska av ATP och H2O 2 signalering för ex vivo isolerade, perfusion och in vivo blod perfusion njurar. Skillnaderna mellan protokollen och sensorer som används här ger optimal datainsamling för antingen farmakologiska medel eller fysiologiska studier. Protokollen består av 1) sensorkalibrering, 2) kirurgiska ingrepp, 3) datainsamlings inställning, och 4) analys av data. De gör det möjligt för realtidsmätningar av analyter för talrika experimentella betingelser. Detta kommer att leda till större insikter i njursjukdomar samt utveckling av effektivare farmakologisk behandling. Här har vi använt sensorerna för att analysera ATP och H2O 2. Emellertid sensorer för andra ämnen finns också tillgängliga och kan användas. De protokoll som beskrivs här applicerades för att studera ATP och H2O 2 i råttnjurar, men samma metod kan enkelt justeras för användning i möss. Sålunda har denna metod en stor potential med tanke på överflödet av genetiska gnagarmodeller.
Den grundläggande designen av enzymatiska mikroelektrod biosensorer utvecklades på 1960-talet av Clark och Lyons 2. Efter den inledande utvecklingen av biosensorer, har framsteg gjorts i både design 17-19 och applikationer 20. Llaudet et al., 21,22 utvecklat principen utformningen av ATP sensorer som används i föreliggande protokoll medan användning av metoder från Cosneir et al., 23 för enzymbeläggningen. Dessa sensorer har upptäckt ATP signalering i ett antal fysiologiska processer, inklusive ATP-frisättning från hjärnastrocyter 8, reglering av andning 4,24, och skelettmuskler arteriole reglering 25. Nyligen ex vivo protokoll har använts för att mäta ATP-signalering i njurar 12. Målet med detta manuskript is för att tillhandahålla effektiva riktningar och insikter för detektion av endogena substanser såsom ATP i njurarna.
Enzymatiska mikroelektrod biosensorer har många fördelar jämfört med befintliga medel för att mäta analyter in vivo. Dock bör särskilda försiktighetsåtgärder användas för detta tillvägagångssätt som för någon annan ny metod. Validering med en etablerad metod ger förtroende för de erhållna data. Till exempel, har mikrodialys mätningar som beskrivits tidigare 26,27. Ingen signifikant skillnad observerades mellan toppkoncentrationerna bestäms av sensorerna och de som erhållits från dialysprover 12. Begränsningen av mikrodialys är att det bara mäter steady-state-nivåer av analyt. Som sådan, kan bedömningen av dynamiska förändringar i cellsignalering endast uppnås med användning av de enzymatiska mikroelektrod biosensorer. Manufactory specifikationerna för sensorsvarstider skiljer sig åt mellan sensortyper. Ex vivo-sensorer har en responstid på 5-10 sek och in vivo sensorer av 30-35 sek för signalstigningen från tio till 90%. Kalibrerings spår (figur 6 och 7) visar tidsupplösningen av analyt tillägg / borttagning. För både sensor- och mikrodialys tillvägagångssätt, krävs användningen av specifika enzymer för att blockera signalen producerad av analyter för att säkerställa specificitet.
De beskrivna protokoll har flera utmaningar. Som med alla sensor införing i vävnad uppstår vävnadsskada. Detta skulle kunna aktivera signalvägar som kan påverka mätningarna 28. För att minimera skadorna cell skulle tunnare sensorer behövs. Det är emellertid svårt att penetrera njurkapseln med sensorerna så nålar används för att göra ett litet ingångshål. Tunna sensorer är mer benägna att böja och störa deras beläggning på insättning. Sensorer med större diameter är mer resistenta böjning och resultant skada på deras beläggning. Figur 3 visar en tunn och tjock sensorn. Förutom den tjocka sensorns motstånd mot böjning, de innehåller ett tjockare skikt av beläggning, som ger ökat skydd för den enzymatiska skiktet. Oron av vävnadsskada orsakad av att använda tjocka sensorer var betydligt mindre i njurarna än den skulle vara i hjärnvävnad. Insticksdjupet approximeras och slutliga placeringen bör kontrolleras efter mätningar på njurarna är klara. Uppskattningen mellan cortex och medulla skikt med hjälp av sensorspetsen längd som en insatsstyr och är tillräcklig som sensorspetsen är 0,5 mm och njurbark är 2-3 mm tjock. Nedsmutsning av sensorn också sker vid en högre hastighet i blod, vilket begränsar sensor användning i långa in vivo-protokoll till ett experiment. Inspelningstider på 1-1 ½ timme resulterade i endast en liten sensordrift. De viktigaste kriterierna vid bedömningen av reducerade sensorprestanda är det låg känslighettill analyten under kalibreringsprocessen. Ökad elektriskt brus och instabilitet av baslinjen strömmen kan också indikera att sensorn spetsen är skadad. För exakta mätningar av ATP, bör båda sensorerna (ATP och NULL) har liknande brus och stabilitetsegenskaper för vidare subtraktion av signalen. Annars en av sensorerna bör ersättas. För lågt brus och detektering av små koncentrationer av analyt, är användningen av nya sensorer för varje djur som föreslås.
Flera steg är avgörande för framgångsrika experimentella resultat. Sensorerna är mycket bräcklig och bör hanteras varsamt för att undvika skador på givarspetsen. Dessutom, efter rehydratisering, sensorerna bör inte utsättas för luft under mer än 20 sek. Låga ljudinspelningar krävs för att kunna upptäcka biologiska signaler i vävnader. För detta ändamål krävs en högpresterande labb luft bord och korrekt elektrisk jordning. Tillsatsen av exakta mängder analyt during kalibreringsstegen är nödvändig för noggrann koncentrationsbestämning i experiment. Uppnå god clearing av njurarna hos ex vivo njur operationer kommer att resultera i framgångsrika inspelningar. Användningen av enzymer apyras och katalas i kalibreringar och experiment gör det möjligt att bedöma sensorn ospecifik känslighet och bekräftar mätningarna.
Dessa protokoll ger kraftigt förbättrad detalj av extracellulärt signalering i njurarna. Den förbättrade känslighet och temporal upplösning som ges av sensorerna kan tillåta oss att lösa förändringar i ATP signalering i sjukdomstillstånd och efter farmakologisk manipulation som tidigare var omöjlig att upptäcka. Den in vivo-protokollet är väl lämpad för komplexa fysiologiska studier medan ex vivo är optimalt för att studera farmakologiska program på njurarna. Utformningen av in vivo-sensor som används här möjliggör motstycke motstånd mot störningar i blood-perfuserad vävnad. Sammantaget ger dessa sensorer erbjuder en stor mängd tillämpningar som tidigare inte är möjligt med befintliga protokoll och tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sensorer för videoinspelning av detta manuskript lämnades av Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Storbritannien).
Acknowledgments
Vi uppskattar Sarissa Biomedical för sitt arbete med att utveckla sensorer som används i föreliggande manuskriptet. Denna forskning stöds av National Heart, Lung, and Blood Institute beviljar HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) och HL 122.662 (A. Staruschenko och A. Cowley), ett projekt som finansieras av Medical College of Utskottet Wisconsin forskningsärenden # 9306830 (O. Palygin) och Advancing en mer sund Wisconsin Forskning och utbildning Program # 9520217, och Young Investigator Grant av National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
