Abstract
Biosensores enzimáticos de microelectrodos han sido ampliamente utilizados para medir la señalización extracelular en tiempo real. La mayor parte de su uso se ha limitado a secciones de cerebro y cultivos de células neuronales. Recientemente, esta tecnología se ha aplicado a los órganos enteros. Los avances en el diseño del sensor han hecho posible la medición de la señalización celular en vivo en los riñones perfundidos con sangre. Los actuales protocolos enumeran los pasos necesarios para medir el ATP y H 2 O 2 de señalización en el intersticio de riñón de rata. Dos diseños de sensores separados se utilizan para la ex vivo y en los protocolos in vivo. Ambos tipos de sensor se recubren con una capa biológica enzimática delgada en la parte superior de una capa de permeabilidad selectiva para dar respondieron rápido, biosensores sensibles y selectivos. La capa permselectividad protege la señal de los interferentes en el tejido biológico, y la capa enzimática utiliza la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol-3-phosfosfato oxidasa en presencia de ATP para producir H 2 O 2. El conjunto de sensores utilizados para los estudios ex vivo detecta más analito mediante la oxidación de H 2 O 2 en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Los sensores para los estudios in vivo se basan en su lugar la reducción de H 2 O 2 en un electrodo de oro mediador recubierta diseñada para el tejido perfundido con sangre. Cambios concentración final son detectados por amperometría en tiempo real seguido de calibración para concentraciones conocidas de analito. Además, la especificidad de la señal amperométrica se puede confirmar mediante la adición de enzimas como la catalasa y la apirasa que descomponen H 2 O 2 y ATP correspondientemente. Estos sensores también se basan en gran medida en las calibraciones precisas antes y después de cada experimento. Los dos protocolos siguientes establecen el estudio de la detección en tiempo real de ATP y H 2O 2 en los tejidos renales, y puede ser modificado adicionalmente para extender el método descrito para su uso en otras preparaciones biológicas u órganos enteros.
Introduction
Biosensores microelectrodos enzimática (También denominada sensores en el presente manuscrito) han sido una herramienta valiosa para el estudio de procesos de señalización dinámica en las células y tejidos vivos. Los sensores proporcionan una mayor resolución temporal y espacial de las moléculas de señalización celular en concentraciones biológicamente relevantes. En lugar de toma de muestras y el análisis de los fluidos extracelulares tomadas a intervalos durante largos períodos de tiempo, estos sensores responden tan rápido como sus enzimas reaccionan con el analito, produciendo de ese modo mediciones en tiempo real 1,2. Detección rápida de las concentraciones intersticiales de factores autocrinos y paracrinos, como purinas o el peróxido de hidrógeno, y la dinámica de su liberación se puede utilizar para establecer un perfil de los efectos de las drogas en condiciones normales y patológicas 3. En la actualidad, la mayoría de las aplicaciones que utilizan sensores de haber estado en cortes de tejido del cerebro y cultivos celulares 4-10. Los protocolos detallados en este objetivo manuscrito aestablecer los medios para medir con precisión las concentraciones en tiempo real de analitos en los riñones enteros.
Los siguientes protocolos se desarrollaron para estudiar ATP intersticial y H 2 O 2 de señalización en los riñones. En el entorno natural de los riñones, el ATP extracelular se cataboliza rápidamente por ectonucleotidasas endógenos en sus derivados (ADP, AMP y adenosina). Los sensores utilizados aquí son muy selectivos a la ATP sobre otras purinas o productos de degradación de ATP 11. Esto ofrece una gran ventaja, ya que permite la monitorización precisa de las concentraciones constantes y dinámicos de la liberación de ATP y su función de señalización. La concentración de ATP intersticial se mide usando la combinación de dos microelectrodos, un sensor de ATP y un sensor de Null. El sensor de Null en combinación con aplicaciones de catalasa es capaz de detectar intersticial H 2 O 2 concentraciones 12. Los siguientes protocolos utilizan dos diseños diferentes de sensors que tienen características óptimas para ya sea ex vivo o in vivo. aplicaciones
Ambos diseños se basan en la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol oxidasa-3-fosfato contenida en una capa enzimática del sensor y está impulsado por la presencia de ATP. En el conjunto de sensores utilizados en los estudios ex vivo, H 2 O 2, el producto final de reacción enzimática, se detecta por oxidación en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Sensores para estudios in vivo en cambio se basan en H 2 O 2 reducción en un electrodo de oro mediador recubierto diseñado para el tejido perfundido con sangre. Se muestra en la Figura 1 es un esquema de ambos protocolos descritos en este manuscrito. El sensor Null es idéntica a su sensor de ATP correspondiente, excepto que carece de las enzimas unidas. Por lo tanto, además de la detección de H 2 O 2 con la enzima catalasa, la mea sensor NullSures interferencias no específicas. Concentraciones de ATP se calculan restando el Null detecta interferencias no específicas y fondo H 2 O 2 de la señal del sensor de ATP. Varios sensores también están disponibles comercialmente para detectar otros analitos incluyendo adenosina, ionosine, hipoxantina, la acetilcolina, colina, glutamato, glucosa, lactato, D-serina para aplicaciones ex vivo o adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo cuando se combina con el Null correspondiente sensor.
La capacidad del sensor para detectar con precisión analitos depende de la pre adecuada y calibraciones posteriores 13. Esto asegura que el análisis representa la deriva en la sensibilidad del sensor que se produce durante el uso en los tejidos biológicos. El sensor tiene un depósito de glicerol que se utiliza como reactivo en las reacciones enzimáticas del sensor. Si el sensor no se utiliza en soluciones de baño que contiene glicerol, que se lave con el tiempo. Shorter rtiempos ecording son entonces necesarias para minimizar la deriva del sensor. Además del sensor de ensuciamiento por proteasas endógenas y los fragmentos de proteínas puede disminuir en gran medida la sensibilidad de los sensores 14.
El presente manuscrito establece el uso de microelectrodos de biosensores enzimáticos para ex vivo e in vivo en forma de preparados de riñón. Cuantificación de analitos en tiempo real ofrece un detalle sin precedentes de la señalización celular que puede revelar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades renales y agentes farmacológicos.
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Protocol
Los siguientes procedimientos con animales adheridos a la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La aprobación previa se obtuvo de el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC).
NOTA: Revisión de las instrucciones del fabricante del sensor se debe hacer durante el diseño de experimento y antes de su uso. Siguiendo estas instrucciones producirá resultados óptimos al utilizar los sensores.
1. Calibración del sensor
- Prepare nuevas soluciones madre antes del inicio del experimento.
- Crear Tampón A que contiene 10 mM de tampón NaPi, NaCl 100 mM, 1 mM de MgCl 2, y glicerol 2 mM. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH. Almacenar a 2-8 ° C.
- Utilizando una concentración de solución madre de ATP (100 mM) se almacena a -20 ° C, crear una solución de calibración fresca 10 mM ATP mediante la adición de 10 l de stock a 90 l de tampón A.
- Rehidratar el sensor de ATP mediante la colocación de la punta (Figura 2) en tél cámara de rehidratación que contiene tampón A por lo menos durante 10 minutos a 2-8 ° C.
NOTA: Después de la rehidratación, los sensores no debe ser expuesto al aire durante más de 20 segundos o la sensibilidad del sensor puede ser reducida. Si se anticipan largas exposiciones al aire, sumergir el sensor brevemente en una solución de glicerol. Los sensores pueden ser utilizados para múltiples experimentos pero estos deben ocurrir en el mismo día como la rehidratación sensor. Los sensores pueden ser almacenados en la cámara de rehidratación con Tampón A para un máximo de 24 hr. - Encienda el potenciostato de doble canal (Figura 3) e iniciar el software del sistema de grabación.
- Preparar una cámara de calibración con 3 ml de tampón A. colocar el electrodo de referencia en la cámara de calibración. Tome cada sensor de la cámara de rehidratación, a continuación, colóquelo en el manipulador y la inserta en la solución de cámara de calibración.
NOTA: Utilice una silicona recubierto plato de petri estándar como una cámara de calibración. Llevar a cabo todas las calibraciones y studies en una jaula de Faraday en una mesa de aire de laboratorio de alto rendimiento para reducir el ruido de la señal durante las grabaciones amperometría (Figura 4). Las calibraciones se hacen mejor lo más cerca del inicio de la recolección de datos posible. Para aplicaciones en vivo el momento óptimo para la calibración es durante el período de recuperación después de la cirugía animal. - Ex vivo de calibración
- Realizar voltametría cíclica en la cámara de calibración en bicicleta a los sensores de -500 mV a 500 mV a una velocidad de 100 mV / s durante 10 ciclos. Esto mejora en gran medida la sensibilidad de los sensores. Consulte la Figura 5 para las huellas observadas a partir de los 10 ciclos.
- Polarizar los sensores a 600 mV después del último ciclo. La corriente del sensor decaerá a una asíntota. Una lectura constante se logra después de un mínimo de 5 min. Registre la lectura de cero.
- En la calibración del sensor vivo
- No realice la voltametría cíclica en el in vivo sensors. En su lugar, polarizar el sensor en la cámara de calibración para 30 seg a 500 mV. A continuación, establezca el potenciostato a 0 mV y deje que el sensor de corriente a la altura de una asíntota. La corriente del sensor tomará por lo menos 2 minutos para asíntota. Registre la lectura de cero.
- Añadir consecutivamente cantidades fijas de solución de ATP en la cámara para producir una línea de calibración que abarca un rango de detección deseada. La solución ATP produce un pico agudo en la señal del sensor inicialmente, seguido por un decaimiento como difumina la ATP de manera uniforme en toda la cámara. Valores de la señal de registro una vez que el nivel de la señal se ha estabilizado después de cada adición de ATP. Figuras 6A y 7 muestran rastros y sugirió concentraciones de ATP, tanto ex vivo y los estudios in vivo, respectivamente.
NOTA: Es importante para confirmar la selectividad de los electrodos mediante el uso de eliminadores de los analitos. El presente protocolo utilizado apirasa para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP y catalasa para la H <sub> 2 O 2 de la señal (Figuras 6B). Si los medicamentos se administran, las mediciones de su reactividad con los sensores se deben determinar antes del estudio. - Añadir 3 l de apirasa de un stock de 2 mg / ml (89 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor de ATP (la corriente producida por la aplicación de ATP debe reducir hasta el nivel cero (Figura 7).
- Añadir 3 l de catalasa de un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) para poner a prueba la especificidad del sensor nula (la corriente producida por H 2 O 2 aplicación debería reducir a la lectura de cero).
2. Cirugía Animal de Estudios de sensores
- Cirugía para la ex vivo
- Anestesiar el animal experimental con isoflurano (5% de inducción, de 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / grado O médica 2 u otro método aprobado. 15 '12 Los animales deben ser monitoreados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Sttasa de reacción y de los pies pizca respiratoria capaz se utilizan para confirmar la anestesia adecuada.
Nota: La eutanasia del animal de acuerdo con los protocolos del IACUC aprobados. A la finalización de todos los procedimientos no-supervivencia eutanasia a animales profundamente anestesiados por toracotomía inducir neumotórax para asegurar la desaparición humanitario de los animales 12. - Coloque la rata en una mesa quirúrgica con control de temperatura en una posición supina. Mientras se mantiene una profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón izquierdo y exponer la aorta abdominal distal.
- Envuelva una ligadura alrededor del celíaco y las arterias mesentérica superior y la aorta abdominal por encima de estas arterias pero no ligar. Envolver dos ligaduras alrededor de la aorta abdominal por debajo de las arterias renales.
- Sujete la aorta abdominal por encima de las ligaduras. Ate la ligadura inferior. Cateterizar la aorta abdominal con tubo de polietileno (PE50). Asegure el catéter con la segunda ligadura aorta.
- Retire la abrazadera y ligar las arterias mesentéricas y celíacos. Perfundir el riñón a 6 ml / min con Hanks Balanced Salt Solution a TA durante 2-3 min hasta que el riñón está completamente palideció.
- Extirpar el riñón y el catéter, conectado porción de la aorta. Coloque el riñón en una placa de Petri de 3 ml lleno de solución del baño.
Nota: protocolo de experimento se puede realizar a temperatura ambiente. La solución del baño contiene en mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH ajustado con NaOH 7,35.
- Anestesiar el animal experimental con isoflurano (5% de inducción, de 1,5 a 2,5% de mantenimiento) / grado O médica 2 u otro método aprobado. 15 '12 Los animales deben ser monitoreados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Sttasa de reacción y de los pies pizca respiratoria capaz se utilizan para confirmar la anestesia adecuada.
- Cirugía en in vivo
- Anestesiar la rata utilizando protocolos IACUC aprobados. Para el análisis in vivo anestesiar las ratas con ketamina (20 mg / kg IM) y inactina (50 mg / kg ip). Los animales deben ser controlados continuamente para garantizar un nivel adecuado de anestesia. Una reacción tasa y puntera pizca respiratoria estable se utiliza para confirmar la anestesia adecuada.
- Después de la profundidad de anestesia adecuada es obtenered, coloque la rata en una posición supina sobre una superficie a tierra de temperatura controlada situado en la mesa de aire. La superficie debe ser precalentado y se mantiene a 36 ° C.
- Mientras se mantiene la profundidad anestésica adecuada, hacer una incisión en la línea media de aproximadamente 5 cm en línea con el riñón.
- Utilice una sutura para desviar y anclar el tejido cutáneo y subcutáneo de manera que todo el riñón es visible. Coloque el riñón en una taza de riñón para minimizar los artefactos de movimiento.
- Utilice una infusión IV de 2% BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr a través de la vena yugular para mantener el volumen de sangre. Canular ambos uréteres para la recolección de orina. Coloque los lazos alrededor de las arterias mesentéricas celíacas y superiores y la aorta distal para la manipulación de la presión de perfusión renal (Figuras 10A).
- Si se requiere la aplicación de agentes farmacológicos durante los experimentos in vivo, la inserción de un catéter intersticial se recomienda (Figuras 10B
Configuración 3. Adquisición de Datos
- Abra el programa de adquisición de datos y establecer su polaridad tanto ex vivo e in vivo a anódica positiva. Ajuste el programa para guardar datos como código ASCII.
- Coloque los micromanipuladores para la inserción rápida de los sensores en los riñones.
NOTA: También puede utilizar una sonda ficticio unido al micromanipulador para ayudar a lograr la colocación deseada de sensores. - Adquisición de datos Ex vivo
- Perfundir el riñón con solución de baño (de 2.1.6) a través de la aorta canulado a una velocidad constante de 650 l / min. Con unas tijeras quirúrgicas, retire con cuidado la cápsula renal, la cual es necesaria para la inserción del sensor.
- Asegurar el riñón con bandas de goma atadas sobre el riñón y unidos al plato recubierto de silicona con alfileres.
- Coloque el electrodo de referencia cerca del riñón en la placa de Petri con su punta sumergida enla solución tampón.
- En la adquisición de datos in vivo
- Coloque el riñón en una taza de riñón. Dependiendo de la cepa y edad del animal utilizar un tamaño de copa que sostiene el riñón sin apretar. La Figura 8 muestra dos tamaños de copas de riñón. Tazas similares se utilizan para diferentes enfoques fisiológicos se centraron en el análisis de la función renal como micropunción etc 16.
Nota: La posición de la copa renal es fundamental para eliminar el ruido mecánico producido por la respiración animal, pero no debe interferir con o bloquear la perfusión renal o el flujo de orina. - Permitir 45 minutos de tiempo de recuperación antes de realizar la recolección de datos.
- Usando una aguja 26-30G, hacer un agujero de punción en el lugar deseado y la profundidad del sensor en el riñón. Seque el agujero superficie para eliminar la sangre exudada. Añadir solución de glicerol a la superficie del riñón. Esto evitará que la superficie de riñón se seque durante el experimento. Retire el primer sensor de la cámara de la rehidratación y adjuntarlo a la micromanipulador. Rápidamente, dentro de los 20 segundos, inserte el electrodo en el agujero recién creado en el riñón. Repita los pasos 3,5 a 3,9 para el sensor nulo.
- Insertar el electrodo de referencia en el riñón, aproximadamente 1 cm a partir de los sensores.
- Coloque el riñón en una taza de riñón. Dependiendo de la cepa y edad del animal utilizar un tamaño de copa que sostiene el riñón sin apretar. La Figura 8 muestra dos tamaños de copas de riñón. Tazas similares se utilizan para diferentes enfoques fisiológicos se centraron en el análisis de la función renal como micropunción etc 16.
- Encienda la potenciostato y activar el programa de grabación en el equipo. La Figura 9 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón ex vivo. La Figura 10 muestra la configuración final de la adquisición de datos de riñón in vivo con un catéter insertado.
Análisis 4. Datos
- Importe el archivo de datos ASCII en origen o cualquier otro software similar.
- Relación actual Concentración
- Utilice la función de ajuste / extrapolar lineal para construir una concentración lineal (eje x) a la corriente (eje y) la relación de la ATP o H 2 2 puntos de calibración (Figuras 6 y 7).
línea de ajuste lineal: y = mx + b
- Utilice la función de ajuste / extrapolar lineal para construir una concentración lineal (eje x) a la corriente (eje y) la relación de la ATP o H 2 2 puntos de calibración (Figuras 6 y 7).
- Equiparar la corriente y la concentración
- Restar las huellas medidos del sensor nula de los del sensor de ATP para obtener la corriente real producida por el ATP intracelular.
- Convertir los valores de ATP en pA obtenidos por amperometría a nM usando la ecuación de calibración se detalla en 4.2.1. Determinar la concentración de la traza de datos resta del sensor de ATP mediante la importación de cada corriente ajustada en el valor de "x" y resolviendo para y (la concentración de analito).
- Del mismo modo, el cálculo de H 2 O 2 concentración de su ecuación de calibración si es necesario.
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Representative Results
El diseño del biosensor microelectrodo enzimática permite la detección en tiempo real de analitos en los riñones enteros. El diseño experimental general para ya sea ex vivo o in vivo estudios se ilustra en la Figura 1 .Los sensores utilizados y los procedimientos quirúrgicos difieren dependiendo de si el estudio es ex vivo o in vivo.
Para obtener resultados reproducibles, pre precisa y calibraciones posteriores son críticos. La Figura 6A muestra una traza representante de la señal de visto desde el sensor ex vivo ATP durante calibraciones. Tenga en cuenta que la apirasa rápidamente eliminado la señal de ATP. La catalasa no tuvo efecto sobre la señal de ATP y demuestra su especificidad a la H 2 O 2 que crea (Figura 6B). El procedimiento de calibración produce un ajuste lineal que se utiliza para calcular los cambios dinámicos de ATP (Figura 6A, panel derecho). En vicalibración del sensor vo produce una traza similar a la del sensor ex vivo. Sin embargo, este sensor detecta reductiva en lugar de corrientes oxidativo y, como tal, la corriente producida es negativo. La calibración de estos sensores también produce un ajuste lineal en un rango de 0.3 a 80 mM (panel de la derecha Figura 7A). Especificidad de sensor in vivo de ATP sobre otros productos de purina se muestra en la Figura 7B.
El enfoque descrito aquí nos permite medir tanto los niveles basales de sustancias endógenas y los cambios agudos en respuesta a la infusión del fármaco 12. Se muestra en la Figura 11 son Ang cambios de concentración endógena intersticial de H 2 O 2 en ratas resistentes a la sal y sensibles a la sal II-inducida. Para estos experimentos, los riñones recién aisladas de Sprague Dawley (SD) o Dahl (SS) ratas sensibles a la sal fueron perfundidos con 1 M Ang II bajo flujo laminar constante (650 l / min). Como shown en la figura 11, Ang II induce la liberación aguda de H 2 O 2 en los riñones de ratas SD y las SS. Sin embargo, la amplitud máxima de cada respuesta fue significativamente elevado en ratas SS, especialmente cuando los animales fueron alimentados con una dieta alta en sal 12. Se muestra en la Figura 12 es una aplicación representativa de los biosensores en vivo. La infusión de catalasa (5 g / ml) completamente bloquea el 2 O 2 H señal detectada por el biosensor. Estos experimentos ilustran el uso de biosensores enzimáticos específicos combinados con la técnica amperométrica para la detección de niveles basales de sustancias endógenas y mediciones en tiempo real de su liberación en respuesta a la intervención farmacológica. Otras aplicaciones de este enfoque para el estudio de la función de señalización purinérgico y peróxido de hidrógeno mejorará nuestro conocimiento y comprensión de las patologías renales, como la hipertensión sensible a la sal, buey renalestrés idative y la enfermedad renal crónica.
Figura 1. Esquema de los Protocolos. Calibración con analito de interés y probar su especificidad se realiza inmediatamente antes del comienzo de los experimentos. El protocolo in vivo se debe seguir para los experimentos fisiológicos complejos y ex vivo para aplicaciones farmacológicas. Calibración experimento Publicar debe hacerse y se tenga en cuenta en el análisis de datos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2. Sensor enzimática microelectrodos. Los dostamaños de sensores utilizados para aplicaciones ex vivo se muestran, a 50 micras y 125 micras de diámetro. Cada cable del sensor se extiende en un tubo capilar para conectarse a un conector de extremo de oro (no mostrado). El recuadro muestra una punta del sensor recubierto con enzimas para la detección de ATP. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Dual Channel Potenciostato. Los canales potenciostato etiquetados CH1 y CH2. 1) CH1 la conexión del sensor ATP y 2) CH2 las conexiones nulos sensor de conexión 3) que se acoplan eléctricamente al electrodo de referencia. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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La Figura 4. Configuración del sensor. La adquisición de datos se lleva a cabo en una jaula de Faraday para reducir el ruido eléctrico y en una mesa de laboratorio de alto rendimiento para una superficie de trabajo libre de vibraciones. 1) Una mesa quirúrgica con control de temperatura se utiliza para mantener la temperatura corporal de los animales durante los experimentos fisiológicos 2) los micromanipuladores están unidos a los adaptadores de montaje magnéticos para un posicionamiento flexible de los sensores durante el experimento 3) Se necesita una fuente de luz para procedimientos quirúrgicos y la inserción del sensor 4 ) de doble canal potenciostato 5) Soporte para los sensores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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La Figura 5. Voltametría cíclica. Para los estudios ex vivo, voltametría cíclica del sensor se lleva a cabo durante 10 ciclos de entre -0,5 y 0,5 V antes del protocolo de calibración. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 6. Amperometry calibración para ex vivo. (A) Calibración utiliza la adición de concentraciones de ATP que se sabe que la solución del baño. Correspondiente valores amperométricas registrados a nivel asíntota (trazo negro). Las corrientes obtenidas crean una ecuación de calibración. Un ejemplo se muestra en el panel derecho. La línea roja es el current del sensor de Null que responde a sólo la adición del H 2 O 2. (B) El sensor Null se calibra con la adición de conocida H 2 O 2 concentraciones (flechas rojas) para la solución del baño y las asíntotas se registran valores amperométricos (flechas negras finas). La adición de catalasa para la solución del baño (espesor flecha negro) se traduce en una rápida decadencia actual. El panel derecho muestra la ecuación de calibración del sensor Null. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 7. Amperometry calibración para;. In Vivo La calibración del in vivo electrodos se lleva a cabo en una manera similar a la detallada en los estudios ex vivo, excepto reacciones de reducción causar una corriente inversa (polaridad). (A) La adición de concentraciones de ATP conocidas produce una corriente amperométrica en el sensor de ATP (traza negro) pero no tiene efecto en el sensor de Null (trazo rojo). La adición de apirasa extingue la corriente del sensor de ATP. (B) La especificidad del sensor ATP se confirma por la adición de 10 mM de diferentes agentes purinérgicos (UTP, UDP y adenosina). Otras aplicaciones de ATP proporcionar una corriente amperométrica detectable estable. (C) Microfotografía de los sensores en vivo basado en un electrodo de oro mediador recubierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
La Figura 8. Copas de riñón. En los estudios in vivo, los riñones se llevan a cabo utilizando todavía las copas de riñón de acero inoxidable que se muestran. Dos tamaños de tazas se utilizan para dar cabida a la variación del tamaño renal. Estas copas reducir los artefactos de movimiento que se generan por la respiración del animal. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Ex Vivo aislado y perfundido de riñón. El riñón aislado se coloca en un plato 1) Petri recubierta con un SI de espesorparte inferior licone para la inserción pin 2) la arteria renal se canula y se une a una bomba de jeringa para la perfusión constante durante el experimento 3) el sensor de ATP, 4) y el sensor de Null se insertan en el riñón 5) el electrodo de referencia se coloca cerca del riñón sumergida en la solución del baño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. In Vivo sanguíneo del riñón perfundido. (A) El riñón izquierdo se expone y se coloca en una taza de riñón, el riñón derecho permanece intacta en el interior del animal. Ambos sensores se insertan en el riñón. BSA: NaCl se infunde a través de la vena yugular sondaje para contrarrestar la pérdida de líquidos causada by se añade el gran incisión en la línea media (B) Ejemplo de experimento in vivo con un catéter intersticial implantado para aplicaciones farmacológicas directas 1) el riñón está en manos de una taza de riñón 2) Sensor de ATP 3) Sensor Null y 4) electrodo de referencia en la superficie ventral del riñón 5) catéter implantado en el riñón y unido a una bomba peristáltica para infusiones farmacológicas laminares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11. Análisis Ex Vivo de H 2 sub> O 2 en el riñón. perfusión Ang II hace que el H 2 O 2 de liberación en la corteza renal de rata. (A) los cambios en tiempo real de la media de H 2 O 2 concentración (barras grises muestran el error estándar) de un total de N = 8 aplicaciones (4 riñones de 4 ratas diferentes). Bares en la parte superior representan aplicación Ang II. (B) El H 2 O 2 máximo valores de amplitud de concentración durante la Ang II perfusión de Sprague Dawley (SD) y (SS) ratas Dahl sensibles a la sal alimenta a bajas y altas dietas de sal, respectivamente. * - P <0,05 en comparación con ratas SD. La cifra es una adaptación de referencia 12 con permiso. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 12. Análisis in vivo de H 2 O 2. Ejemplo de la evaluación in vivo de H 2 O 2 intersticial concentración en la médula de una rata SS alimentados con una dieta baja en sal (como se muestra en la Figura 10B). La aplicación intersticial de la catalasa a través de un catéter implantado para el intervalo de 5 min produjo un bloqueo completo de la H 2 O 2 de la señal en la médula renal. Reducción de la catalasa, de lavado por el flujo sanguíneo renal, dio lugar a una recuperación parcial de la señal, que fue bloqueado de nuevo por una aplicación catalasa adicional (10 min). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los actuales protocolos fueron desarrollados para proporcionar una resolución temporal y espacial mejorada de ATP y H 2 O 2 de señalización para ex vivo aislados, perfundidos e in vivo riñones perfundidos sangre. Las diferencias entre los protocolos y los sensores utilizados aquí proporcionan la adquisición de datos óptima, ya sea para agentes farmacológicos o estudios fisiológicos. Los protocolos consisten en 1) la calibración del sensor, 2) procedimiento quirúrgico, 3) de configuración de adquisición de datos, y 4) el análisis de datos. Permiten a las mediciones en tiempo real de los analitos para numerosas condiciones experimentales. Esto conducirá a mayores conocimientos sobre las enfermedades renales y el desarrollo de tratamientos farmacológicos más eficaces. Aquí hemos utilizado los sensores para analizar ATP y H 2 O 2. Sin embargo, los sensores para otras sustancias también están disponibles y pueden ser utilizados. Los protocolos descritos aquí se han aplicado para estudiar ATP y H 2 O 2 en los riñones de ratas, pero el mismo method se puede ajustar fácilmente para su aplicación en ratones. Por lo tanto, este enfoque tiene un gran potencial teniendo en cuenta la abundancia de modelos de roedores genéticos.
El diseño básico de biosensores enzimáticos microelectrodos se desarrolló en la década de 1960 por Clark y Lyon 2. Siguiendo el desarrollo inicial de los biosensores, se ha avanzado tanto en el diseño 17-19 y aplicaciones 20. Llaudet et al. 21,22 desarrollado el diseño principio de los sensores de ATP usados en las presentes protocolos durante el uso de métodos de Cosneir et al. 23 para el recubrimiento de la enzima. Estos sensores han detectado la señalización de ATP en una serie de procesos fisiológicos, incluyendo la liberación de ATP a partir de astrocitos cerebrales 8, la regulación de la respiración 4,24, y el músculo esquelético regulación arteriola 25. Recientemente, el protocolo ex vivo se ha usado para medir la señalización de ATP en los riñones 12. El objetivo de este manuscrito is para proporcionar direcciones y puntos de vista eficaces para la detección de sustancias endógenas como ATP en los riñones.
Biosensores enzimáticos microelectrodos tienen muchas ventajas sobre los medios existentes de medición de analitos en vivo. Sin embargo, las precauciones especiales deben ser utilizados para este enfoque como por cualquier otro método nuevo. Validación con un enfoque establecido proporciona confianza en los datos obtenidos. Por ejemplo, se hicieron mediciones de microdiálisis como se describió previamente 26,27. No se observó ninguna diferencia significativa entre las concentraciones máximas determinadas por los sensores y los obtenidos de las muestras de diálisis 12. La limitación de microdiálisis es que sólo mide los niveles de estado estacionario de analito. Como tal, la evaluación de los cambios dinámicos en la señalización celular sólo se puede lograr con el uso de los biosensores enzimáticos de microelectrodos. Las especificaciones de manufactura de los tiempos de respuesta del sensor difieren entre el sensortipos. ex vivo sensores tienen un tiempo de respuesta de 5-10 segundos y en los sensores in vivo de 30-35 seg para el aumento de la señal de 10 a 90%. Las trazas de calibración (Figuras 6 y 7) demuestran la resolución de tiempo de la adición de analito / extracción. Para ambos enfoques los sensores y de microdiálisis, se requiere el uso de enzimas específicas para bloquear la señal producida por analitos para asegurar la especificidad.
Los protocolos descritos tienen varios desafíos. Como con cualquier sensor de inserción en el tejido, se produce daño en los tejidos. Esto podría activar las vías de señalización que pueden influir en las mediciones 28. Para minimizar el daño celular, se necesitarían sensores más delgadas. Sin embargo, es difícil de penetrar la cápsula renal con los sensores así que se utilizan agujas para hacer un agujero de entrada pequeña. Sensores delgadas son más propensas a doblarse y alteran su revestimiento sobre la inserción. Sensores de mayor diámetro de curvatura más resistente y Resultados de la Búsquedadaños nt a su revestimiento. Figura 3 muestra un sensor delgado y grueso. Además de la resistencia del sensor de espesor a la flexión, que contienen una capa más gruesa de recubrimiento, proporcionando una mayor protección para la capa enzimática. La preocupación de daño tisular causado por el uso de sensores de espesor fue considerablemente menor en los riñones de lo que sería en el tejido cerebral. La profundidad de inserción es aproximada y la colocación final debe ser verificada después de que se completaron las mediciones sobre el riñón. Estimación entre las capas de corteza y médula utilizando la longitud punta del sensor como una guía de inserción y es suficiente que la punta del sensor es de 0,5 mm y la corteza renal es de 2-3 mm de espesor. El ensuciamiento del sensor también se produce a una tasa mayor en la sangre, lo que limita el uso del sensor en tiempo en los protocolos in vivo para un experimento. Los tiempos de grabación de 1 a 1 ½ horas resultó en sólo una pequeña desviación del sensor. Los principales criterios a la hora de evaluar el rendimiento del sensor reducida es la baja sensibilidadal analito durante el proceso de calibración. El aumento de ruido eléctrico y la inestabilidad de la corriente de línea de base también puede indicar que la punta del sensor está dañado. Para las mediciones precisas de ATP, ambos sensores (ATP y NULL) deben tener ruido y la estabilidad características similares para su posterior sustracción de la señal. De lo contrario, uno de los sensores debe ser reemplazado. Para el ruido bajo y la detección de pequeñas concentraciones de analito, se sugiere el uso de nuevos sensores para cada animal.
Varios pasos son cruciales para los resultados experimentales exitosos. Los sensores son muy frágiles y deben manejarse con cuidado para evitar dañar la punta del sensor. Además, después de la rehidratación, los sensores no deben ser expuestos al aire durante más de 20 seg. Se requieren grabaciones de bajo ruido para la detección exitosa de señales biológicas en los tejidos. Para ello, se requiere una mesa de aire de laboratorio de alto rendimiento y de puesta a tierra eléctrica adecuada. La adición de cantidades exactas de analito during los pasos de calibración es necesaria para la determinación de la concentración precisa en experimentos. El logro de una buena limpieza de los riñones en cirugías ex vivo de riñón dará como resultado grabaciones de éxito. El uso de enzimas apirasa y catalasa en las calibraciones y en experimentos permite la evaluación de la sensibilidad del sensor no específica y confirma las mediciones.
Estos protocolos proporcionan una mayor detalle en gran medida de la señalización extracelular en los riñones. La mejora de la sensibilidad y resolución temporal proporcionada por los sensores pueden permitir que resolvamos los cambios en el ATP de señalización en estados de enfermedad y siguientes manipulación farmacológica que antes eran indetectables. El protocolo in vivo es muy adecuado para estudios fisiológicos complejos, mientras ex vivo es óptimo para el estudio de aplicaciones farmacológicas en los riñones. El diseño del sensor in vivo utilizado aquí permite la resistencia sin precedentes contra la interferencia en bltejido ud-perfusión. Tomados en conjunto, estos sensores ofrecen una gran cantidad de aplicaciones que anteriormente no eran posibles con los protocolos y técnicas existentes.
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Disclosures
Sensores para la grabación de vídeo de este manuscrito fueron proporcionados por Sarissa Biomédica Limited (Coventry, Reino Unido).
Acknowledgments
Apreciamos Sarissa Biomédica por su trabajo en el desarrollo de los sensores usados en el presente manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre otorga HL108880 (A. Staruschenko), HL 116 264 (A. Cowley) y HL 122 662 (A. Staruschenko y A. Cowley), un proyecto financiado por el Colegio Médico de Comité de Asuntos de Investigación Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) y al desarrollo de un Programa de Investigación y Educación Saludable Wisconsin # 9520217, y el joven investigador de subvención de la Fundación Nacional del Riñón (O. Palygin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe null sensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 oC before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 G | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
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