Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Hakket Tissue i Compressed Kollagen: A Cell holdig Biotransplant for Single-iscenesatt rekonstruktiv Repair

doi: 10.3791/53061 Published: February 24, 2016

Summary

Tissue engineering inkluderer ofte in vitro ekspansjon for å skape autografts for vev gjenfødelse. I denne studien ble en metode for vev ekspansjon, regenerering, og rekonstruksjon in vivo ble utviklet for å minimere behandling av celler og biologisk materiale utenfor kroppen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De fleste vev ingeniørstudier på transplantasjon til huden og urogenitaltractus inkluderer autologe celle avlinger fra friskt vev og celle ekspansjon i spesialutstyrte celle-dyrking fasiliteter 1,2.

Etter celle ekspansjon, blir cellene vanligvis lagres for senere bruk når pasienten er forberedt på å motta autograft. Nitrogen frysere tillate langtidslagring ved lave temperaturer på -150 ° C eller lavere. Fremgangsmåte for frysing må være forsiktig og kontrollert for ikke å miste cellene. En risiko for celledød er krystallisering av intracellulært vann i løpet av tineprosessen, noe som kan føre til ødeleggelse av cellemembraner. Celle frysing utføres vanligvis ved langsom og kontrollert avkjøling (1 ° C per minutt), ved anvendelse av en høy konsentrasjon av celler, føtalt bovint serum, og dimetylsulfoksyd. Etter tining ble cellene må bearbeides på nytt ved å fjerne frysemediet og dyrking av cellekultur plast eller enbiomateriale før transplantasjon tilbake til pasienten.

Alle de ovennevnte fremgangsmåten er tidkrevende, arbeidskrevende og kostbar tre. I tillegg er alle in vitro behandling av celler som er ment for pasienten transplantasjon er svært regulert og krever godt trente og akkrediterte personell og laboratorier 4. Alt i alt, å skaffe en trygg og pålitelig produksjonsprosessen, teknikken kan bare være etablert i et svært lite antall teknisk avanserte sentre og en bredere bruk i vanlige kirurgiske lidelser er tvilsomt.

For å overvinne begrensningene ved celledyrking i laboratorieomgivelser, er begrepet transplantere vev hakket for celle ekspansjon in vivo innføres ved hjelp av kroppen selv som en bioreaktor. For disse formålene, ville autografts fortrinnsvis bli transplantert på en 3D-form i henhold til den form som er nødvendig for den endelige gjenoppbyggingen av organet interest 5-7.

Opprinnelig var ideen om å transplantere hakket epitel presentert av Meek i 1958 da han beskrev hvordan epitel vokser fra kantene av et sår. Han viste at en liten del av huden vil øke dets marginer og derved dets potensial for celle utvidelse med 100% ved å skjære stykket to ganger i perpendikulære retninger (figur 1) 8. Teorien har vært støttet av bruk av stormasket delvis tykkelse hud grafts for hudtransplantasjon 9 og i huden sårtilheling modeller 10.

Figur 1
Fig. 1: Meek teori Ifølge Meek teori, vokser epitelet fra kantene av et sår. Ved å øke området avslørt av hakking teknologi, epithelializes hakket vev sår fra mange steder.

Denne studien er basert på hypoOppgaven at samme prinsipp kan anvendes på det subkutane vev ved å plassere hakket epitel rundt en form. Epitelcellene ville mobiliserer fra hakket transplantasjoner (reorganisere), dekke såret områder (migrerer) og dividere (ekspandere) i for å danne en sammenhengende neoepithelium at dekker sårområdet og skiller fremmedlegeme (mold) fra den indre legemet ( Figur 2).

Figur to
Fig. 2: Cartoon over en 3D mould med kvernet epitelet i in vivo intracorporal ekspansjon vevet ifølge teorien om Meek ved hjelp av hakket vev legges på en form og deretter transplantert til det subkutane vev, er hypotesen at epitelceller migrere fra kantene til kvernet vevet, omdanne, og ekspandere for derved å danne en kontinuerlig neoepithelium det dekker sårområdet og skiller fremmedlegeme (mold) fra den indre legemet.

Selv om tidligere in vivo studier viser lovende resultater, kan ytterligere forbedringer oppnås ved å forsterke de autografts slik at det regenererte epitel kunne motstå mekanisk traume bedre 7. For disse formålene, ble viktige forutsetninger for en vellykket biomateriale identifisert, for eksempel: enkel diffusjon av næringsstoffer og avfallsprodukter, mulighet til å forme i en 3D måte og easiness av kirurgisk behandling. Konklusjoner ble gjort at disse behov kan oppfylles ved å tilsette en kompositt biomateriale til hakket vev.

Studien sikte på å utvikle et stillas som består av kvernet vev i plast-komprimert kollagen som inneholder en forsterkende kjerne av et biologisk nedbrytbart stoff. Ved hjelp av disse midler, kan levedyktige celler migrere fra hakket vevspartikler og proliferere med morfologiske egenskaper karakteristisk for den opprinnelige epitel (hud eller urothelium). Ved hjelp av plastiske kompresjon, stillaset var redusered i størrelse fra 1 cm til omtrent 420 um som hakket partiklene ble innesluttet i det øvre lag kollagen. Kjernen stoff kan være noen polymer, men må endres med en hydrofil overflate for å interlink med dekker kollagen lag 11.

Fremgangsmåten ga en forbedret stillaset integritet ved inkorporering av en strikket maske som består av poly (ε-kaprolakton) (PCL) i løpet av to plast komprimert kollagen geler ved å bruke det som et stillas for dyrking av kvernet blære slimhinner eller kvernet hud fra svin. Konstruksjonen ble opprettholdt i celledyrkningsforholdene i opptil seks uker in vitro, demonstrere vellykkede dannelsen av en lagdelt, flerlags urothelium eller plateepitel hud epitel på toppen av en godt konsolidert hybrid konstruksjon. Konstruksjonen var lett å håndtere og kan sys på plass i blæren forsterkningsformål eller tildekking av hud defekter. Alle deler av vev stillaset er FDA-godkjent og teknikkenkunne brukes til ett-trinns prosedyrer ved vev høsting, hakking, plast komprimering, og transplantere tilbake til pasienten som en enkelt-iscenesatt intervensjon. Fremgangsmåten kan utføres for vev ekspansjon og rekonstruksjon under sterile betingelser i en hvilken som helst generell kirurgi enhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyr protokoller ble forhåndsgodkjent av Stockholms fylkesnemnda på dyr og alle prosedyrer dannet regelverket for bruk av dyr, samt relevante føderale lover.

1. Animal Prosedyrer

  1. Klargjøre Animal for kirurgi
    1. Klargjør den kirurgiske bordet med alle materialer og virkemidler som er nødvendig for drift under sterile forhold. Utføre operasjonen utelukkende under sterile betingelser for å redusere risikoen for infeksjon og optimalisere betingelsene i overlevelse kirurgi.
    2. Fast dyret i 12 timer før operasjonen og måle dens vekt. Ved intramuskulær injeksjon av azaperon (2 mg / kg) for premedisinering. Bedøve dyret med intramuskulære injeksjoner av tiletamin hypochloride (2,5 mg / kg), zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg), medetomidin (25 ug / kg) og atropin (25 ug / kg).
    3. Injisere phenobarbiturate (15 mg / kg) før endotracheal intubasjon og fortsette generell anestesi med 0,8% -2% isofluran. Sett inn en perifer venekateter i det ene øret og sette mot glukose (25 mg / ml) intravenøst ​​under prosedyren for å opprettholde velferden til dyret.
    4. Plasser overvåking enheter på øret eller hale for å sjekke temperatur, blodtrykk, metning og perifer puls. Kontroll anestesi ved smerter stimulering av ørene eller hover. Påfør salven øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
  2. Eksisjon av blæren Biopsi Specimen
    1. Kateterisere blæren ved hjelp av en 10-fransk silikon kateter ved å innføre en spekulum til å vise urinrøret og inn katetret gjennom urinrøret og inn i urinblæren for å tømme urin etter semi-sterile forhold. Fylle blæren med steril saltoppløsning til et trykk på 20-25 cm H 2 O, ca 100-300 ml, og deretter tomme til 20 cm H 2 O (ca. 8 ml / kg kroppsvekt).
    2. med the gris nøye slått til en sidestilling, utføre en enkel preoperativ sterilisering av huden med bruk av klorheksidinglukonat. Påfør en diatermi plate til skulderen etter å ha fjernet pelage med barbering sakser.
    3. Snu grisen forsiktig inn en liggende stilling og fjern mage pelage bruker barber saks og gjøre en grunnleggende preoperativ sterilisering av abdominal hud med bruk av klorheksidinglukonat.
      1. Embed ekstremiteter med myke klær for å minimere risiko for overs skade på leddene i ekstremiteter. Steriliser abdominal huden på dyret med suksessive anvendelser av klorheksidinglukonat og plassere sterile drapering rundt operasjonsområdet.
    4. Før hud innsnitt, gjelder en intravenøs smertestillende som består av buprenorfin (45 mikrogram / kg), carprofen (3 mg / kg) og lokal injeksjon av lidokain i midtlinjen under navlen. Sjekk for smerte reaksjon ved å ta tak i ski med tang. Lag en lavere midtlinjen snitt gjennom fascien og bukhinnen med diatermi for kontroll av blødning. Lokalisere blære som har en fullt ut intraperitoneal stilling i piggen og kan fritt eksponert ved å mobilisere det gjennom det kirurgiske sår.
    5. Ta tak i blæren med pinsett og måle den med en sterilisert målebånd og markere en elliptisk formet biopsiprøve ca 2 cm på langs og 1 cm på tvers, eller mindre, ved hjelp av en sterilisert penn (grisen tåler en fjerdedel reduksjon av blære størrelse veldig bra). Eksisere markerte området, ved hjelp av en skalpell, og plasser blære biopsiprøve i DMEM under sterile forhold.
    6. Utfør autotransplantasjon med biotransplant eller lukke blæren ved å sy det med 5-0 Vicryl i to lag. Lukk abdominal fascia nøye med 2-0 eller 3-0 kjører Vicryl. Lukk underhuden med 3-0 Vicryl og huden med 3-0 Ethilon. Plasser en dressing på såret og nøye påhar en tendens til dyret før det har kommet seg tilstrekkelig fra bedøvelsen og gir ikke uttrykk for smerte.
    7. Flytt dyret til anlegget for dyrehold for å sikre forhold for postoperativ pleie. Sett dyret i et enkelt bur med en varmelampe og delta på dyret før full gjenoppretting av bedøvelsen, og deretter la dyrene bli stanset i par.
    8. Tilveiebringe et begivenhetsløst utvinning av smerte og trivsel og administrere buprenorfin (45 ug / kg) intramuskulært for postoperativ analgesi og trimetoprim (4 mg / kg) og sulfonamid (20 mg / kg) to ganger daglig i tre dager og en gang daglig i fem dager for å redusere risikoen for postoperative infeksjoner.
  3. Eksisjon av hud Biopsi Specimen
    1. Klargjør den kirurgiske bordet med alle nødvendige materialer. Bedøve dyret som tidligere beskrevet i 1.1. Fjern pelage bruker voks, vaske og sterilisere innsnitt området med Betadine og 70% alkohol og deretter plassere sterile drapering around innsnitt området.
    2. Bruk en dermatome å høste en 0,3 mm delvis tykkelse huden biopsiprøve. Plasser hudprøve i DMEM før hakking, som beskrevet i 2.2. Dekk såret med fet salve og en dressing.

2. Minced Tissue Forberedelse

  1. blære Slimhinner
    1. Vask blæren biopsi to ganger i DMEM. Plasser blære biopsiprøve på et sterilisert dissekere plate med slimhinnen vendt oppover og feste en av sidene til platen ved hjelp av disseksjon nålene.
    2. Separer den mucosal vev fra detrusor hjelp av gode sakser og pinsetter (figur 3) og holde mucosa fuktig ved drypping saltvann eller DMEM over den.
    3. Bruk hakking enheten ved å plassere den på slimhinnen og deretter sende enheten fra den ene enden til den andre vertikalt og horisontalt, bruk manuell press for å få biter av hakket vev av 0,8 mm x 0,8 mm (0,8 mm er avstanden mellom rotating knivene).
  2. Hud
    1. Hvis huden biopsis er tykk: Plasser huden på en steril dissekere plate og bruke kirurgisk saks for å skille epidermis fra underhudsfett og dermis. Overhuden er tynn og gjennomsiktig (ca. 0,3 mm) når den er klar for hakking.
    2. Bruk hakking enheten ved å plassere den på overhuden. Med trykk, passerer anordningen fra den ene enden til den andre vertikalt og horisontalt for å oppnå stykker av opphakket vev fra 0,8 mm x 0,8 mm.

3. Utarbeidelse av plast komprimerte PCL / Kollagen autografts

  1. Legg alle ingrediensene på is for å holde kulden. Redskaper som trengs: Falcon tube, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH og rottehalecollagen type 1.
    1. Bland 2 ml 10x DMEM (forsiktig for å unngå bobler) med 12 ml av kollagen type 1. Tilsett 1 N NaOH, dråpe for dråpe, for å bringe pH-verdien opp til 7,4 til 8 (farge i mediet bør indikere pH-verdien ved å endre fra intens gul til pink). I tillegg bruker en pH stripe.
    2. Nøye tilsett 2 ml 1x DMEM og bland løsningen. Platen ca 2 ml av kollagen i hver brønn av stål rektangulære formen (20x30x10 mm) og inkuber ved 37 ° C i 5% CO 2 i 10 min.
      MERK: Konsentrasjonen av kollagen bør være 2,06 mg / ml i 0,6% eddiksyre og mengden av kollagen 1 ml / cm 2.
    3. Når kollagen setter inn formen, plasser biomateriale (PCL) på toppen av kollagen gel (20 mm x 30 mm) og hell den gjenværende kollagen (ca. 6 ml) på toppen av det. Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i 20 minutter.
    4. Plasser hakket vev (for 1: 6 ekspansjon) på toppen av kollagen gel. Trykker vannet ut av konstruksjonen ved hjelp av mekaniske kraft plastiske kompresjon på følgende måte (figur 3 og 4).
    5. Legg et tykt lag av gasbind pads på en steril overflate. Plasser en rustfritt stål (400 mikrometer tykk) på toppen av gauze pads og deretter et ark av nylon mesh (110 um tykk). overføre nøye kollagen gel / hakket vev på nylon mesh og fjerne den rektangulære stål mold nøye.
    6. Legg et nytt lag med nylon mesh på toppen av kollagen gel / hakket vev. Sett en annen stålnett på toppen av nylon mesh. Plasser i posisjon trykk eller lasteplate som veide et minimum på 120 g (det vil si en glassplate) i 5 minutter.
    7. Fjern vekt, nylon og stål maskene. De autografts er nå klar til å bli sutureres til grisen blæren i full tykkelse hudsår eller dyrket in vitro.
    8. For in vitro dyrking, skjæres den tynne konstruksjonen i små biter som passer 12-brønners plater. Tilsett 1 ml keratinocyte medium. Plasser platene i inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 og kultur opp til 6 uker og endre medium 3 ganger per uke.

4. Sutur av autografts

  1. Sutur av autograft medhakket blære mucosa til piggen blæren
    1. Hold autograft fuktig i DMEM i løpet av ventetiden. Sy autograft med fine løpemonofilament sting. Bruk ikke-absorberbare 5-0 Ethilon for forskningsformål.
    2. Sjekk om vanntette ved å fylle blæren med saltvann gjennom den iboende urinkateter. Hvis det er mulig, dekke autograft med et lag av større omentum. Lukk bukveggen, underhud, og hud som beskrevet i 1.2.6. Påfør et sår dressing.
  2. Sutur av autograft med hakket Skin Epidermis til en full-tykkelse Wound
    1. Hold autograft fuktig i DMEM i løpet av ventetiden.
    2. Suturere autograft til bunnen av huden full tykkelse viklet av avbrutte suturer i hjørnene og i midten av autograft å holde autograft tett knyttet til den underliggende overflaten.
    3. Dekke såret med et plastisk bandasje som holder såret fuktig.

  1. Sedate dyret med intramuskulær injeksjon av zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg) og medetomidin (25 mikrogram / kg) før oppsigelse og gjelder overvåking enheter til øret eller hale for å sjekke puls og blodtrykk.
  2. Avlive dyret ved administrering av en dødelig dose av pentobarbital-natrium (60-140 mg / kg) intravenøst. Sjekk puls og blodtrykk til døden har inntruffet.

6. In vitro-kultur


MERK: For å evaluere histologisk progresjon av kvernet vev i PCL / kollagen konstruksjoner in vitro, kollagen / PCL / hakket patcher er dyrket i 12-brønners plater ved hjelp av keratinocyte medium.

  1. Utarbeidelse av keratinocyte medium:
    1. Sterilisere en 500 ml glassflaske.
    2. Bland 400 ml DMEM med 100 ml av Hams F12 (4: 1-blanding). Supplere med 10% føtalt bovint serum, 5 ug / ml insulin,0,4 ug / ml hydrokortison, 21 ug / ml adenin, 10 -10 mol / l koleratoksin, 2 x 10 -9 mol / l trijodtyronin, 5 ug / ml transferrin, 10 ng / ml epidermal vekstfaktor, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin.
    3. Steriliser ved filtrering gjennom et 0,2 um filter og samle opp filtratet i sterile 500 ml flaske.

7. Immunohistokjemi

MERK: immunhistokjemi protokollen er vanligvis delt inn i følgende trinn: (1) fiksering og parafin embedding, (2) mikro seksjonering til 5 mikrometer skiver, plassering på lysbilder, deparaffination og rehydrering, (3) antigen avsløring, flekker og montering . Før de siste trinnene i immunhistokjemi prosedyren, forberede vaske buffere og antigenet avsløre løsningen (se egne materielle detaljer). Klargjør ABC kompleksoppløsning i minst 30 min før bruk.

  1. Fiksering
    NEITE: Ved slutten av den in vitro-kultur, løse lapper som følger:
    1. Forbered Eppendorf-rør med 1 ml 4% bufret formaldehyd (PFA) (OBS:. Formaldehyd er giftig Vennligst les produktdatablad før arbeid med dette stoffet Bruk hansker og vernebriller og forberede løsningen inne i en avtrekkshette.).
    2. Overfør hver av kollagen lapper til et Eppendorf-rør inneholdende 4% PFA. Fiks over natten ved romtemperatur.
    3. Plasser prøver i 70% etanol for langsiktig lagring ved 4 ° C. Prøvene er nå klare for dehydrering og innstøping i parafinblokker før seksjonering.
  2. rehydrering
    1. Plasser lysbildene i en farging krukke med X-tra solv for 15 min. Gjenta ved hjelp av en ny farging krukke med X-tra solv. Plassere objektglassene i en fargings krukke med absolutt etanol i 10 min. Gjenta ved hjelp av en ny farging krukke med absolutt etanol. Plasser glir i en fargings krukke med 95% etanol i 10 minutter og deretterinn i en farging krukke med 70% etanol i 10 min. Til slutt vaskes lysbildene to ganger i 5 min med destillert vann.
  3. antigen avsløring
    1. Sette glir i en Coplin krukke med TE-løsning og sette glasset i et vannbad til å koke i 20 min. Ta glasset ut av vannbadet nøye. Avkjøl skinnene til romtemperatur i 30 minutter og vaskes to ganger i 5 minutter i Tris-buffer. Plassere objektglassene i en krukke farging med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. Vask objektglassene to ganger i 5 min i Tris-buffer. Tegn en sirkel rundt prøvene ved hjelp av en vannavvisende tusjpenn.
    2. Blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffet ved hjelp 100-300 ul blokkeringsløsning. Fjern blokkeringsløsningen og tilsett 100-300 mL av primært antistoff oppløst ved den anbefalte konsentrasjon i Tris-buffer. Inkuber over natten. Fjern det antistoffløsning og vask seksjoner i Tris-buffer to ganger i 5 min.
    3. Inkuber med det sekundære antistoff i 1 time ved værelses Temperature. Vask to ganger i 5 minutter i Tris-buffer. Inkuber 30 min ved hjelp av ABC Elite Kit (følg produsentens anvisninger). Vask to ganger i Tris-buffer.
    4. Utvikle antistoff-reaksjon ved hjelp av Vector VIP Kit, å følge produsentens instruksjoner (1-7 min inkubasjon gir generelt en klar fiolett intensitet). Sett lysbildene i destillert vann. Counterstain med Mayers hematoksylin i 30 sek.
    5. Vask i rennende vann i 5 min. Plassere objektglassene i en fargings krukke med 70% etanol i 1 min. Gjenta ved hjelp av en ny farging krukke med 70% etanol. Plasser lysbildene i en farging krukke med 95% etanol i 1 min. Gjenta ved hjelp av en ny farging krukke med 95% etanol.
    6. Plasser lysbildene i en flekker krukke med X-tra solv for 5 min. Fjern, en om gangen for å holde fuktig. Plasser en dråpe montering medium på toppen av hvert lysbilde og sette et dekkglass på toppen (ikke så nøye for å unngå luftbobler). La lysbilder tørke over natten og vise lysbilder under en mikroomfang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne studien viser en metode som viser hvordan man skal fremstille et biomateriale for transplantasjon ved hjelp av plastiske kompresjon av kollagen og hakket vev.

Blære slimhinner og hud kan høstes og deretter mekanisk hakket opp i små partikler (figur 3). Av plast kompresjon, blir hakket partiklene innlemmet i kompositt stillaset består av en sentralt plassert bionedbrytbar polymer som er mekanisk sterk innenfor ytre lag av en kollagen-gel (figur 4). Hakket vevspartikler kan adskilles for å tillate en 1: 6 utvidelsesverdi. Ved å trykke ut den vanninnholdet i kollagen, er et biotransplant for autolog rekonstruktiv kirurgi fullført.

Biotransplants kan brukes for autotransplantasjon til dyr for in vivo-undersøkelser eller dyrket i et vanlig cellekultur miljø for videre in vitro studier.

T han kompositt autograft kan fatte og suturering og opprett kirurgisk behandling (figur 5). Prosessen fra vev høsting og forberedelse av cellen som inneholder autograft for rekonstruktiv kirurgi tar ca 20 min og er rettet skal utføres som en enkelt-iscenesatt prosedyre.

I in vitro-studier celler migrere, utvide og reorganisere seg til overflaten av den autograft inn i en enkeltcelle kontinuerlig lag i to uker. Etter fire uker, er den kontinuerlige epitelet omtrent 4 cellelag tykke (figur 6). Immunhistokjemi på ulike tidspunkter viser at celler spre seg, vandrer, og omorganisert i en kontinuerlig epitel med en mikroarkitektur typisk for cellen fenotype. De samme resultatene gjelder for autografts med kvernet hud epitel som for kjøttdeig blæreslimhinnen.

1 / 53061fig3.jpg "/>
Fig. 3: Hakket vevspreparat og plastiske kompresjon Fremstillingen av blæreslimhinnen (A) for hakking (C) og plastiske kompresjon (D - F), ved hjelp av trippanordningen i (B) og støpeformen i (D) for å fremstille en 420-mikrometer tykk transplantasjon (H). Legg merke til at kollagen i seg selv er en god ekstracellulær matriks, men er vanskelig å håndtere mekanisk (G); ved å plassere et biologisk nedbrytbart stoff som en forsterkende kjerne, blir transplantasjon lett å forstå (H).

Figur 4
Figur 4: Plastisk kompresjon En animert tegnefilm viser prosessen med plast komprimering med hakket partikler..

Figur 5
Figur 5:. Kirurgisk behandling Full-tykkelse huden sår modell i en rotte demonstrere sydd plast-komprimert biomateriale med hakket huden for autotransplantasjon merket som T (transplantert autograft) suturerte biomateriale uten hakket hud merket som S (humbug). I dette tilfelle var oppmalt hud transplantert epitel for en 1: 3 utvidelsesverdi.

Figur 6
Figur 6: Immunhistokjemisk farging for å visualisere utviklingen av 3D-kultur i kollagen-biomaterialet hakket hud og blære slimhinner (A - D) hematoksylin / eosin-farging av (A) opprinnelig hud, (B) naturlig blære, (C) hakket. huden etter 5 uker i kultur og (D) hakket blæren etter 6 uker i kultur. Ekspresjonen av epithelial og sprednings markører med MNF116 (E) og Ki-67-antistoffer (

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne studien viser en lett-å-bruke metode for å fremstille blærevegg plasteret med autologt vev for transplantasjon på operasjonsbordet. Flekkene blir dannet av en kombinasjon av en bionedbrytbar polymer strikking på midten og kollagen med og uten hakket vev i de ytre overflater i kombinasjon med plastiske kompresjon. Plastiske kompresjon er en metode beskrevet tidligere av andre forfattere, og kan defineres som en rask utstøting av væske fra kollagen geler 12,13. Hakket vev av blæren slimhinne eller hud podes inn i dette stillas og dannelse av en blære eller hud epitel kan bli fulgt i løpet av 6 uker. Immunhistokjemiske analyser viste dannelse av ekvivalenter som er karakteristiske for normale vev. Disse resultater tillater ikke bare en in vitro modell for å studere re-epitelialisering og sårheling, men danner også et biomateriale for autolog transplantasjon vev. Viktigst for urologi formål, autografts kan anvendes for in vivo anvendelser av vevsteknologi i rekonstruktiv urologi som modifiserte autologe vev flekker uten behov for in vitro dyrking før transplantasjon 11.

Med hensyn til celle ekspansjon og in vitro-dyrkningsteknikker, hud epitel og uroepithelium har felles karakteristika. Motivet for å presentere teknikken for plast komprimering og tripper for begge epitelvev i denne studien var at høsting og in vivo studier for hud epitel er enklere enn for blære uroepithelium. Av disse midlene, kan biomaterialer og hud epitel studeres som et første skritt for å bekrefte biokompatibilitet og fysiske egenskaper før du utfører mer invasive studier i urogenitale organer.

I forrige in vivo studier, bruker begrepet hakket vev med blæreslimhinnen for vev gjenfødelse av rørledninger, funnene var at the små transplanterte partikler kreves noen mekanisk støtte for å tåle mekanisk traume og holder seg på plass under den første ta av de transplanterte hakket partikler og under healing prosessen og vev gjenfødelse 6,7.

For å overvinne disse svakheter, studien sikte på å utvikle en hybrid konstruksjon med en biologisk nedbrytbar kjerne av en polymer strikket stoff og plast-komprimert kollagen 11,14. Kollagen gir et gunstig overflate for celleadhesjon og cellevekst og tillater direkte og rask integrering av det oppmalte vevet inn i stillaset. Men siden de mekaniske egenskapene til kollagen, selv etter komprimering plast, som fremdeles svak og vil ikke opprettholde de sammentrekninger og utvidelser av de naturlige bevegelser blæren, ble en støttende kjerne stillas for kollagen tilsatt. For mer komplekse strukturer, kunne transplantert vev utvides rundt en prefabrikert støpeformen for å fremstille en tredimensjonal epithelialized struktur med et sentralt lumen.

I disse studiene har vi brukt PCL som en stabiliserende polymer og kjernen av biograft. PCL er mye brukt i en rekke biomedisinske enheter som tannfyllingsmaterialer, absorberbare syntetiske kirurgiske masker og suturmaterialer 14. For å skaffe modning av regenerert vev, det vil si innervasjon, glatt muskelvev og ekstracellulær matriks, valgte vi en PCL-polymer med en langsom nedbrytning hastighet over flere måneder. Imidlertid kan nedbrytningshastigheten reguleres ved valg av polymer, tykkelse og tetthet 11,16.

Kollagen ble valgt som en komponent i den sammensatte konstruksjon på grunn av velkjente biokompatibilitet, sikkerhet og god helbredende egenskaper. Kollagen fremmer innvekst av granulasjonsvev, re-modellering og modning av ekstracellulære matriks 15. Ettersom kollagen er forringet, neovaskularisering og granulasjonsvev støtter transplantasjoned hakket partikler som reorganisere, migrere og utvide 5-7,11,16. Dessuten er kollagen en viktig naturlig komponent av den ekstracellulære matriks både på huden og i blæren, og har vært brukt for opprettelse av stillas både in vitro og in vivo, inkludert sårheling studier og rekonstruksjoner i det urogenitale system 17,18.

De kritiske trinnene i protokollen er lett håndterlig. Først lige snitt må holdes under fuktige og gunstige forhold forut for innføring i transplantasjon eller annet cellevekst vil bli forsinket eller fraværende. En annen fallgruve kan innebære å få riktig soliditet av kollagen. Man må sørge for at kollagen blir stiv under utarbeidelsen av autograft ved å unngå bobler inni kollagen gel. Bobler unngås ved forsiktig pipettering, og små bobler kan brytes med en nål. Kollagen med bobler skal kastes.

Det er enLSO viktig å få riktig størrelse på hakket vev; før hakking vevet, sørg for at bare den tynne blæreslimhinnen blir brukt i tilfeller av blæren utvidelse eller bare overhuden i tilfeller av hud ekspansjon. Den siste fallgruve er når suturering: Sørg for å flytte vinkelrett på transplantasjon med nålen for å unngå å skille de forskjellige lagene. Kantene av autograft også må håndteres forsiktig for ikke å separere kollagenet fra polymeren. Etter å sy arkene vil bli vanskeligere å skille. Dette er vanlige problemer som kan oppstå når lære teknikken.

En begrensning med denne teknikken er at cellene i hakket partiklene er avhengige av diffusjon av næringsstoffer og oksygen. Derfor er tykkelsen av autograft å være mindre enn 1 mm, og har til å bli plassert i et godt vaskularisert område. Dette kan være en ulempe på grunn av faren for lekkasje av urin gjennom det transplanterte del av blæren. Avhengig av plastic komprimering, kan forskjellige permeabilitetskonstanter oppnås. I vårt tilfelle den hydrauliske permeabilitet (k) verdien var 0,034 i henhold til tidligere studier 19. I en klinisk setting forventer vi at vi trenger å holde blæren tom med kateter i ca 1-2 uker for å gi tid for urotelialceller å bygge opp et flerlags kontinuerlig urothelium som gjør oppdateringen un-gjennomtrengelig før aktiv bruk.

En annen begrensning er forutsetningen om en sunn organ for vev innhøsting og ekspansjon. I mer alvorlige tilfeller når blæren mangler eller er uegnet for utvidelse, for eksempel når berørt av kreft, teknikken er kanskje ikke egnet.

Som for andre vev konstruert celle konstruksjoner, kan endelige konklusjoner om funksjonelle og morfologiske resultater bare besvares i langsiktige in vivo studier. Vårt neste skritt vil være å analysere våre resultater i langsiktige dyrestudier i forhold til viability og fysiologiske egenskaper etter transplantasjon.

Betydningen av den present teknikk er muligheten til å utvide vev in vivo etter bare en enkelt operasjon. Andre teknikker for tiden vurderes er alle avhengige av å utvide cellene in vitro før transplantasjon. In vitro prosedyrer har ulempen av å bli assosiert med høye kostnader, krever avanserte laboratoriepersonell, og det å være tidkrevende. Det kan ta opptil 2 måneder mellom høsting av vev eller celler og vev-konstruert autograft; i motsetning til mindre enn en time, i henhold til den teknikk som er beskrevet i denne studien.

I fremtiden kan hakket vev i komprimerte kollagen teknikker utvides og brukes i andre organer, som for eksempel bukveggen defekter, diaphragmatic brokk, og andre forhold hvor en feil ikke er lett rekonstruert med eksisterende vev.

in vivo. Fremgangsmåten for fremstilling av en autograft er lett å gjøre, og kan anvendes under sterile betingelser i en vanlig kirurgisk innstilling. Den autograft motstår kirurgisk behandling og er biologisk nedbrytbart. Kjernen i autograft kan være sammensatt av forskjellige bionedbrytbare polymerer, avhengig av preferanser vedrørende nedbrytningshastigheten og andre egenskaper, slik som elastisitet, tykkelse og porøsitet, og i henhold til pasientens behov. I en klinisk setting, vil pasienten gjennomgå vev innhøsting, utarbeidelse av den sammensatte autograft og autotransplantasjon som en ett-trinns prosedyre. I tillegg er alle deler av celleholdige bioconstructs for tiden godkjent av FDA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone catheter 10-French Preparing the animal for surgery, Section 1
DMEM 10x Gibco 31885-023 Plastic compression section 4
24 well plates Falcon 08-772-1 Plastic compression section 4
3',3',5-Triiodothyronine Sigma-Aldrich IRMM469 In vitro culture; Section 5
4% PFA Labmed Solutions 200-001-8 Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol Histolab Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit Vector PK6102 Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol Histolab 1399.01 Immunocytochemistry; Section 6
Adenine Sigma-Aldrich A8626 In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain Preparing the animal for surgery, Section 1
Azaperone 2 mg/kg  Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria Preparing the animal for surgery, Section 1
Biosafety Level 2 hood  Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. Vector The blocking solution depends of the  origin of  first antibody Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA Preparing the animal for surgery, Section 1
Carprofen 3 mg/kg    Rimadyl, Orion Pharma, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
Chlorhexidine gluconate  Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England Preparing the animal for surgery, Section 1
Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling Histolab 6150 Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made Plastic compression; Section 4
DMEM Gibco 3188-5023 Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor Sigma-Aldrich E9644 In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) Ethicon Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10437-036 Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth) Preparing the animal for surgery, Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)  Preparing the animal for surgery, Section 1
Ham's F12 Gibco 31765-027 Plastic compression section 4
Hematoxylin Histolab 1820 Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber DALAB Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888 In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30% Sigma-Aldrich H1009 Immunocytochemistry; Section 6
Insulin Sigma-Aldrich I3536 In vitro culture; Section 5
Isoflurane Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL Preparing the animal for surgery, Section 1
Lidocaine 5 mg/ml Xylocaine, AstraZeneca, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
Lucose 25 mg/ml Baxter, Deerfield, IL Preparing the animal for surgery, Section 1
Marker pen pap pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg  Domitor, Orion Pharma, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
Mincing device Applied Tissue Technologies LLC Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament) Ethicon Surgery, Section 1
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1 N Merck Millipore 106462 Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection APL Vnr 336164 Surgery, Section 1
PBS Gibco 14190-094 Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg Pentobarbital, APL, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
PCL Knitted fabric Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen First LINK, Ltd, UK 60-30-810 Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade - 15 Preparing the animal for surgery, Section 1
Shaving shears Preparing the animal for surgery, Section 1
Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size Plastic compression; Section 4
Steril gloves Preparing the animal for surgery, Section 1
Sterile gowns Preparing the animal for surgery, Section 1
Sterile drapes
Sterilium Bode Chemie HAMBURG Preparing the animal for surgery, Section 1
Suture Thread Ethilon Preparing the animal for surgery, Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg Preparing the animal for surgery, Section 1
Transferrin Sigma-Aldrich T8158 In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC  Sigma-Aldrich T6066 Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate kit Vector SK4600 Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded) Ethicon Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water.
X-tra solv (solvent) DALAB 41-5213-810 Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride Zoletil, Virbac, France Preparing the animal for surgery, Section 1
Depilatory wax strips Veet Preparing the animal for surgery, Section 1
Pentobarbital sodium Lundbeck Termination, Section 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  2. Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
  3. Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
  4. Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
  5. Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
  6. Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
  7. Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
  8. Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
  9. Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
  10. Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
  11. Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
  12. Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
  13. Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
  14. Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
  15. Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
  16. Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
  17. Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
  18. Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
  19. Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
Hakket Tissue i Compressed Kollagen: A Cell holdig Biotransplant for Single-iscenesatt rekonstruktiv Repair
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chamorro, C. I., Zeiai, S., Reinfeldt Engberg, G., Fossum, M. Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair. J. Vis. Exp. (108), e53061, doi:10.3791/53061 (2016).More

Chamorro, C. I., Zeiai, S., Reinfeldt Engberg, G., Fossum, M. Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair. J. Vis. Exp. (108), e53061, doi:10.3791/53061 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter