Summary
Vävnadsteknik inkluderar ofta in vitro expansion i syfte att skapa autotransplantat för vävnadsregenerering. I denna studie en metod för vävnadsexpansion, regenerering, och återuppbyggnad in vivo utvecklades för att minimera behandlingen av celler och biologiska material utanför kroppen.
Introduction
De flesta vävnadstekniska studier transplantation till huden och urogenitalsystemet inkluderar autologa cell skördar från frisk vävnad och cellexpansion i specialutrustade cell odling anläggningar 1,2.
Efter cellexpansion, cellerna vanligtvis lagras för senare användning när patienten är beredd att ta emot den kroppsegna. Kväve frysar tillåta långvarig lagring vid låga temperaturer av -150 ° C eller lägre. Processen för frysning måste vara försiktig och kontrollerad för att inte förlora cellerna. En risk av celldöd är kristallisation av intracellulärt vatten under upptiningsprocessen, vilket kan leda till brott på cellmembranen. Cell frysning utförs vanligtvis genom långsam och kontrollerad kylning (-1 ° C per min), med användning av en hög koncentration av celler, fetalt bovinserum, och dimetylsulfoxid. Efter upptining av cellerna behöver bearbetas på nytt genom att ta bort frysmedium och odling på cellodlings plast eller enbiomaterial innan transplantation tillbaka till patienten.
Alla de ovan nämnda stegen är tidskrävande, arbetskrävande och kostsamma 3. Dessutom, alla in vitro-behandling av celler avsedda för patient transplantation är starkt reglerad och kräver välutbildad och ackrediterade personal och laboratorier 4. Allt som allt, att anskaffa en säker och tillförlitlig tillverkningsprocess, tekniken kan endast fastställas i ett mycket litet antal tekniskt avancerade centra och en bredare användning i vanliga kirurgiska sjukdomar är tveksamt.
I syfte att övervinna begränsningarna hos cellodling i laboratoriemiljön, är konceptet med att transplantera malda vävnaden för cell expansionen in vivo infördes genom att använda kroppen själv som en bioreaktor. För dessa ändamål, skulle auto företrädesvis att transplanteras på en 3D-form enligt den form som behövs för den slutliga rekonstruktionen av organ intresset 5-7.
Ursprungligen var tanken att transplantera malet epitel presenteras av Meek 1958 när han beskrev hur epitel växer från kanterna av ett sår. Han visade att en liten bit hud skulle öka sina marginaler och därmed dess potential för expansion cell med 100% genom att skära bit två gånger i vinkelräta riktningar (Figur 1) 8. Teorin har fått stöd genom användning av nät med partiell tjocklek hudtransplantation för hudtransplantation 9 och i huden sårläkningsmodeller 10.
Figur 1:. Meek teori Enligt Meek teori, växer epitel från kanterna av ett sår. Genom att öka området exponeras av malningen teknik, epithelializes malet vävnad sår från många platser.
Den aktuella studien är baserad på hypotesen att samma princip skulle kunna tillämpas på den subkutana vävnaden genom att placera malet epitel runt en form. Epitelcellerna skulle mobilisera från malet transplantationer (omorganisera), täcker de lindade områden (migrerar) och dividera (expandera) i syfte att bilda en kontinuerlig neoepithelium som täcker sårområdet och separerar det främmande föremålet (formen) från den inre kroppen ( Figur 2).
Figur 2:. Tecknad av en 3D-form med malet epitel för in vivo intrakorporeal expansions vävnad enligt teorin om Meek Genom att använda malda vävnaden placeras på en form och därefter transplanteras till den subkutana vävnaden, är hypotesen att epitelcellerna migrera från kanterna av den malda vävnaden, omorganisera, och expandera för att bilda en kontinuerlig neoepithelium som täcker sårområdet och separerar det främmande föremålet (formen) från den inre kroppen.
Även tidigare in vivo-studier visar lovande resultat, kan ytterligare förbättringar uppnås genom att förstärka de auto så att regenere epitel kunde motstå mekanisk trauma bättre 7. För dessa ändamål, var viktiga förutsättningar för en framgångsrik biomaterial identifierats, såsom: enkel diffusion av näringsämnen och avfallsprodukter, möjlighet att mögel i en 3D sätt och enkelheten i kirurgisk behandling. Slutsatser gjordes att dessa behov kan tillgodoses genom att lägga till en sammansatt biomaterial till malet vävnaden.
Den aktuella studien syftar till att utveckla en byggnadsställning som består av malet vävnad i plast-komprimerade kollagen innehållande en förstärkande kärna av en biologiskt nedbrytbar tyg. På detta sätt kan livskraftiga celler migrera från malet vävnadspartiklar och föröka sig med morfologiska egenskaper som kännetecknar den ursprungliga epitel (hud eller urothelium). Med hjälp av plast kompression, ställningen var att minskad i storlek från 1 cm till omkring 420 um som det malda partiklarna var innesluten i det övre skiktet kollagen. Stomfilten kan vara vilken som helst polymer men behöver modifieras med en hydrofil yta i syfte att koppla samman med de täckande kollagenskikt 11.
Metoden gav en förbättrad ställnings integritet genom att införliva en stickad mesh bestående av poly (ε-kaprolakton) (PCL) inom två plast komprimerad kollagengeler använder den som en byggnadsställning för odling malet blåsan slemhinnan eller malet hud från svin. Konstruktet bibehölls i cellodlingsbetingelser i upp till 6 veckor in vitro, vilket demonstrerar framgångsrik bildning av en skiktad, flerskiktad urotelium eller skvamöst huden epitelet på toppen av en väl konsoliderad hybrid konstrukt. Konstruktionen var lätta att hantera och kan sys på plats för blås augmentation ändamål eller beläggning av skalet. Alla delar av vävnadsbyggnadsställning är FDA-godkända och teknikenskulle kunna användas för förfaranden enstegs genom vävnadsskörd, mals, plast kompression, och transplantera tillbaka till patienten som en enda-iscensatt ingripande. Det förfarande skulle kunna utföras för expansion vävnad och rekonstruktion under sterila betingelser i någon allmän kirurgi enhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll var i förväg godkänts av Stockholms läns kommittén på djur och alla förfaranden överensstämde med reglerna för djuranvändning, samt relevanta federala lagar.
1. djurförsök
- Förbereda djur för kirurgi
- Förbered operationsbordet med alla material och instrument som behövs för verksamheten under sterila förhållanden. Utföra operationen uteslutande under sterila förhållanden för att minska risken för infektion och optimera förhållandena i överlevnad kirurgi.
- Snabb djuret för 12 timmar före operation och mäta dess vikt. Administrering av en intramuskulär injektion av azaperon (2 mg / kg) som premedicinering. Söva djuret med intramuskulära injektioner av tiletamin hypochloride (2,5 mg / kg), zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg), medetomidin (25 ^ g / kg) och atropin (25 ^ g / kg).
- Injicera phenobarbiturate (15 mg / kg) före endotracheal intubation och fortsätta narkos med 0,8% -2% isofluran. Sätt en perifer venkateter i ena örat och ingjuta glukos (25 mg / ml) intravenöst under förfarandet för att bibehålla välbefinnande djuret.
- Placera övervakningsanordningar på örat eller svansen för att kontrollera temperatur, blodtryck, mättnad och perifer puls. Kontroll anestesi av smärta stimulering av öronen eller hovar. Applicera salva till ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Excision av urinblåsan biopsiprov
- ANVÄNDA KATETER blåsan med användning av en 10-fransk silikonkatetern genom att införa ett spekulum för att visa urinröret och föra in katetern genom urinröret och in i urinblåsan för att tömma urin enligt semi-sterila betingelser. Fylla blåsan med steril koksaltlösning till ett tryck av 20 till 25 cm H2O, ca 100-300 ml, och sedan tom till 20 cm H2O (approx. 8 ml / kg kroppsvikt).
- med the gris vände försiktigt till en sidoläge, utföra en grundläggande preoperativ sterilisering av huden med tillämpning av klorhexidinglukonat. Applicera en diatermi platta till axeln efter avlägsnande av pelage med rakning sax.
- Vrid grisen försiktigt i ryggläge och ta bort buken pelage använder rakning sax och göra en grundläggande preoperativ sterilisering av bukhuden med tillämpning av klorhexidinglukonat.
- Bädda extremiteter med fina kläder för att minimera risken för översträckning skador på lederna i armar och ben. Sterilisera den abdominala huden på djuret med successiva tillämpningar av klorhexidinglukonat och placera steril drapering runt det kirurgiska området.
- Före hud snitt, tillämpa en intravenös analgetisk bestående av buprenorfin (45 ^ g / kg), karprofen (3 mg / kg) och lokal injektion av lidokain i mittlinjen nedanför naveln. Kontrollera om smärta reaktion genom att ta tag i skin med pincett. Gör en lägre mittlinjen snitt genom fascia och bukhinnan med diatermi för kontroll av blödning. Lokalisera blåsan som har ett fullt intraperitoneal läge i grisen och kan fritt exponeras genom att mobilisera den genom operationssåret.
- Ta tag i urinblåsan med pincett och mäta det med en steriliserad måttband och markera en elliptisk formade biopsiprov ca 2 cm på längden och 1 cm på tvären, eller mindre, med hjälp av en steriliserad penna (grisen tål fjärdedel minskning av blåsstorlek väldigt bra). Excidera det markerade området, med användning av en skalpell, och placera blåsan biopsiprov i DMEM under sterila betingelser.
- Utföra autotransplantation med BioTransplant eller stänga blåsan genom att sy den med 5-0 Vicryl i två lager. Stäng buken fascia försiktigt med 2-0 eller 3-0 kör Vicryl. Stäng huden med 3-0 Vicryl och huden med 3-0 Ethilon. Placera en dressing på såret och noggranttenderar att djuret tills den har återhämtat sig tillräckligt från anestesi och inte uttrycka smärta.
- Flytta djuret till djuromsorg möjlighet att trygga förutsättningarna för postoperativ vård. Placera djuret i en enda bur med en värmelampa och sköta djuret tills full återhämtning från anestesi och sedan låta djuren fastnat i par.
- Tillhandahålla en händelselös återhämtning när det gäller smärta och välbefinnande och administrera buprenorfin (45 mikrogram / kg) intramuskulärt för postoperativ smärtlindring och trimetoprim (4 mg / kg) och sulfonamid (20 mg / kg) två gånger dagligen i tre dagar och en gång dagligen under fem dagar för att minska risken för postoperativa infektioner.
- Excision av hudbiopsi Specimen
- Förbered operationsbordet med allt nödvändigt material. Söva djuret som tidigare beskrivits i 1.1. Ta bort pelage använder vax, tvätta och sterilisera snittet med Betadine och 70% alkohol och sedan placera steril drapering around snittet området.
- Använd en dermatom att skörda en 0,3 mm partiell tjocklek hudbiopsi prov. Placera huden förlagan i DMEM före malning, som beskrivs i 2.2. Täcka såret med fet salva och en dressing.
2. Köttfärs Vävnadsberedning
- blåsan Mucosa
- Tvätta blåsan biopsi två gånger i DMEM. Placera blåsan biopsiprov på en steriliserad dissekera platta med slemhinnan vänd uppåt och fixera en av sidorna till plattan med hjälp av dissektion stift.
- Separera slemhinnevävnaden från detrusormuskeln med fina sax och pincett (Figur 3) och hålla slemhinnan fuktig genom droppande saltlösning eller DMEM över den.
- Använd malningen anordningen genom att placera den på slemhinnan och sedan passera enheten från ena änden till den andra vertikalt och horisontellt, applicera manuellt tryck för att erhålla bitar av malet vävnad av 0,8 mm x 0,8 mm (0,8 mm är avståndet mellan roteg skärstål).
- Hud
- Om huden biopsis är tjock: placera huden på en steril dissekera platta och använda kirurgisk sax för att separera epidermis från underhudsfett och dermis. Epidermis är tunn och genomskinlig (ca. 0,3 mm) när den är klar för malning.
- Använd malning anordningen genom att placera den på epidermis. Med tryck, passerar enheten från ena änden till den andra vertikalt och horisontellt för att erhålla bitar av malet vävnad av 0,8 mm x 0,8 mm.
3. Beredning av plast Komprimerade PCL / Kollagen auto
- Lägg alla ingredienser på is för att hålla kylan. Redskap som behövs: Falcon rör, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH och råttsvanskollagen typ 1.
- Blanda 2 ml 10x DMEM (noggrant för att undvika bubblor) med 12 ml av kollagen typ 1. Tillsätt 1 N NaOH, droppe för droppe, för att få pH till 7,4-8 (färg i mediet skall ange pH genom att byta från intensiv gul till stiftk). Dessutom använder en pH remsa.
- Tillsätt försiktigt 2 ml 1x DMEM och blanda lösningen. Plattan ungefär 2 ml av kollagen i varje brunn av stålet rektangulära formen (20x30x10 mm) och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 10 minuter.
OBS: Koncentrationen av kollagen bör vara 2,06 mg / ml i 0,6% ättiksyra och mängden kollagen 1 ml / cm 2. - När kollagen sätter in i formen, placera biomaterial (PCL) ovanpå kollagengelen (20 mm x 30 mm) och häll den återstående kollagen (ca 6 ml) ovanpå det. Inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 20 min.
- Placera det malda vävnaden (för 1: 6 expansion) på toppen av kollagengel. Trycker ut vattnet ur konstruktionen genom mekanisk kraft att använda plast kompression enligt följande (fig 3 och 4).
- Placera ett tjockt lager av gaskuddar på en steril yta. Placera ett nät av rostfritt stål (400 | j, m tjock) på toppen av gauze kuddar och sedan ett ark av nylonnät (110 um tjock). Överför försiktigt kollagengelen / malet vävnad på nylonnät och försiktigt bort den rektangulära stålform.
- Placera ett nytt lager av nylonnät på toppen av kollagengel / malet vävnad. Placera en andra stålnät ovanpå nylonnät. Placera på plats trycket eller lastplatta som väger minst 120 g (dvs. en glasskiva) under 5 min.
- Ta maskorna vikt, nylon och stål. De auto är nu redo att sys fast grisblåsan i full tjocklek hudsår eller odlas in vitro.
- För in vitro-odling, skär den tunna konstruktionen i små bitar som passar 12-brunnsplattor. Tillsätt 1 ml keratinocyt medium. Placera plattorna i inkubatorn vid 37 ° C, 5% CO2 och kultur upp till 6 veckor och ändra mediet 3 gånger per vecka.
4. Sutur av autotransplantat
- Sutur av autograft medmalet blåsan slemhinnan till grisblåsan
- Håll autograft fuktig i DMEM under väntetiden. Sutur autograft med fina rinnande monofilamentsuturer. Använda icke-absorber 5-0 Ethilon för forskningsändamål.
- Kontrollera om vattentätt genom att fylla urinblåsan med saltlösning genom den inneboende urinkateter. Om det är möjligt, täcka autograft med ett lager av större omentum. Stänga bukväggen, subkutan vävnad och hud, såsom beskrivs i 1.2.6. Applicera ett sårförband.
- Sutur av Autograft med malet Skin epidermis en full tjocklek sår
- Håll autograft fuktig i DMEM under väntetiden.
- Sutur autograft till botten av huden av full tjocklek lindas av avbrutna suturer i hörnen och i mitten av autograft för att hålla autograft nära anknytning till den underliggande ytan.
- Täcka såret med ett plast förband som håller såret fuktigt.
- Stillsam djuret med intramuskulär injektion av zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg) och medetomidin (25 mikrogram / kg) före uppsägning och tillämpa övervakningsanordningar till örat eller svansen för att kontrollera puls och blodtryck.
- Avliva djuret genom att administrera en letal dos av pentobarbital-natrium (60 till 140 mg / kg) intravenöst. Kontrollera puls och blodtryck tills döden har inträffat.
6. In vitro-kultur
OBS: För att utvärdera histologiskt utvecklingen av malet vävnaden i PCL / kollagenkonstruktioner in vitro, kollagen / PCL / malet patchar odlas i 12-brunnsplattor med hjälp av keratinocyt medium.
- Framställning av keratinocyt medium:
- Sterilisera en 500 ml glasflaska.
- Blanda 400 ml DMEM med 100 ml Hams F12 (4: 1-blandning). Komplettera med 10% fetalt bovint serum, 5 | ig / ml insulin,0,4 | ig / ml hydrokortison, 21 fig / ml adenin, 10 -10 mol / L koleratoxin, 2 x 10 -9 mol / L trijodtyronin, 5 | ig / ml transferrin, 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor, 50 U / ml penicillin och 50 | j, g / ml streptomycin.
- Sterilisera genom filtrering genom ett 0,2 pm filter och samla upp filtratet i den sterila 500 ml flaska.
7. Immunohistokemi
OBS! Immunohistokemi protokollet i allmänhet delas in i följande steg: (1) fixering och paraffininbäddning, (2) mikrosektionering till 5 pm skivor, placering på objektglas, avparaffinering och rehydrering, (3) antigen avslöjande, färgning och montering . Innan du börjar de sista stegen i immunohistokemi förfarandet förbereda tvättbuffertar och antigen avslöjande lösning (se separata material detaljer). Förbereda ABC komplexlösningen minst 30 min före användning.
- Fixering
NEJTE: Vid slutet av in vitro-kultur, fixa plåster enligt följande:- Förbered Eppendorf-rör med 1 ml 4% buffrad formaldehyd (PFA) (Varning:. Formaldehyd är giftigt Läs säkerhetsdatablad innan du arbetar med denna kemikalie Använd handskar och skyddsglasögon och förbereda lösningen inuti ett dragskåp.).
- Överför varje kollagen patchar till ett Eppendorf-rör innehållande 4% PFA. Fixa över natten vid rumstemperatur.
- Placera proverna i 70% etanol för långtidsförvaring vid 4 ° C. Prover är nu redo för uttorkning och inbäddning i paraffinblock innan snittning.
- rehydrering
- Placera glasen i en färgnings burk med X-tra solv för 15 min. Upprepa genom att använda en ny färgning burk med X-tra solv. Placera glasen i en färgnings burk med absolut etanol under 10 min. Upprepa genom att använda en ny färgning burk med absolut etanol. Placera objektglasen i en färgnings burk med 95% etanol för 10 min och därefteri en färgnings burk med 70% etanol under 10 min. Skölj objektglasen två gånger under 5 min med destillerat vatten.
- antigen demaskering
- Sätta objektglasen i ett Coplin-kärl med TE-lösningen och placera burken i ett vattenbad för att koka i 20 min. Ta burken ur vattenbadet noggrant. Kyla objektglasen till rumstemperatur under 30 min och tvätta två gånger under 5 min i Tris-buffert. Placera glasen i en färgnings burk med 3% väteperoxid under 10 min. Tvätta bilderna två gånger under 5 min i Tris-buffert. Rita en cirkel runt proverna med användning av en vattenavvisande märkpenna.
- Blockera ospecifik bindning av antikroppen med användning 100-300 | il blockeringslösning. Avlägsna den blockerande lösningen och tillsätt 100-300 ^ il av primär antikropp upplöstes vid den rekommenderade koncentrationen i Tris-buffert. Inkubera över natten. Avlägsna antikropplösningen och tvätta sektioner i Tris-buffert två gånger under 5 min.
- Inkubera med den sekundära antikroppen i 1 h vid rumstemperature. Tvätta två gånger under 5 minuter i Tris-buffert. Inkubera 30 min med hjälp av ABC Elite Kit (följ tillverkarens instruktioner). Tvätta två gånger i Tris-buffert.
- Utveckla antikroppsreaktionen genom användning av Vector VIP Kit, enligt tillverkarens instruktioner (1-7 min inkubation ger i allmänhet en klar violett intensitet). Sätt glasen i destillerat vatten. Kontrast med Mayers hematoxylin under 30 sekunder.
- Tvätta i rinnande vatten under 5 min. Placera glasen i en färgnings burk med 70% etanol under 1 min. Upprepa genom att använda en ny färgning burk med 70% etanol. Placera glasen i en färgnings burk med 95% etanol under 1 min. Upprepa genom att använda en ny färgning burk med 95% etanol.
- Placera objektglasen i en färgnings burk med X-tra solv under 5 min. Ta bort, en i taget för att hålla fuktig. Placera en droppe monteringsmedium ovanpå varje bild och sätta en täckglaset ovanpå (gör så försiktigt för att undvika luftbubblor). Låt bilderna torka över natten och visa bilder i en mikroomfattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie presenterar en metod som visar hur man kan producera ett biomaterial för transplantation med användning av plast komprimering av kollagen och malda vävnaden.
Bladder slemhinna och hud kan skördas och sedan mekaniskt malet i små partiklar (Figur 3). Genom plastisk komprimering, är det malda partiklar inkorporeras inuti kompositbyggnadsställning består av en centralt placerad bionedbrytbar polymer som är mekaniskt stark inom ytterskikt av en kollagengel (Figur 4). Malet vävnadspartiklar kan separeras för att möjliggöra en 1: expansionstakt 6. Genom att trycka ut vatteninnehållet i kollagen, är en BioTransplant för autolog rekonstruktiv kirurgi klar.
Biotransplants kan användas för auto till djuret för in vivo forskningsstudier eller odlas i en vanlig cellodlingsmiljö för ytterligare in vitro-studier.
T han komposit autograft kan gripa och suturering och upprätt kirurgisk behandling (Figur 5). Processen från vävnad skörd och beredning av cellinnehållande autograft för rekonstruktiv kirurgi tar ungefär 20 minuter och syftar till att utföras som en enda iscensatt förfarande.
I in vitro-studier celler migrerar, expandera och omorganisera till ytan av autograft in i en encellig kontinuerligt skikt i två veckor. Efter fyra veckor, är den kontinuerliga epitel cirka 4 cellskikt tjock (Figur 6). Immunohistokemi på olika tidpunkter visar att celler förökar sig, migrera och omorganisera i en kontinuerlig epitel med en mikroarkitektur typisk för cellfenotyp. Samma resultat gäller för auto med malet hud epitel som för malet blåsslemhinnan.
1 / 53061fig3.jpg "/>
Figur 3:. Malet vävnadspreparat och plast kompression Framställningen av blåsslemhinnan (A) för malning (C) och plast komprimering (D - F) med användning av hack anordningen i (B) och formen i (D) för att producera en 420-im tjock transplantation (H). Notera att kollagen själv är en bra extracellulära matrisen men är svår att hantera mekaniskt (G); genom att placera en bionedbrytbar väv som ett förstärkningskärnan, blir transplantatet lätt att förstå (H).
Figur 4: Plast kompression En animerad film som visar processen av plast kompression med malet partiklar..
Figur 5:. Kirurgisk behandling full tjocklek hudsår modell i en råtta demonstrerar sys plast-komprimerade biomaterial med malet hud för auto märkt som T (trans autograft) suture biomaterial utan malet hud markerats som S (sham). I detta fall malet hud epitel transplanteras för en 1: expansionstakt 3.
Figur 6: Immunohistokemisk färgning för att visualisera fortskridandet av 3D kultur i det kollagen biomaterial malet hud och urinblåsa slemhinnor (A - D) Hematoxylin / eosin färgning av (A) nativ hud, (B) nativ blåsa, (C) malet. huden efter 5 veckor i odling och (D) malet blåsan efter 6 veckor i odling. Uttrycket av epiteliala och proliferationsmarkörer med MNF116 (E) och Ki 67 antikroppar (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie presenteras en enkel att använda tillvägagångssättet för att producera blåsväggen fläckar med autolog vävnad för transplantation vid operationsbordet. Plåstren är bildade genom kombinationen av en biologiskt nedbrytbar polymer stickning i mitten och kollagen med och utan malda vävnaden i de yttre ytorna i kombination med plast komprimering. Plast komprimering är en metod som tidigare beskrivits av andra författare och kan definieras som en snabb utdrivning av vätska från kollagengeler 12,13. Malet vävnad i urinblåsan slemhinna eller hud ympas in i denna byggnadsställning och bildandet av en blåsa eller hud epitel kunde följas under 6 veckor. Immunhistokemiska analyser visade bildandet av ekvivalenter är karakteristiska för normal vävnad. Dessa resultat tillåter inte bara en modell för att studera återepitelisering och sårläkning in vitro, utan bildar även ett biomaterial för autolog vävnadstransplantation. Viktigast för urologi syfte, autografts kan användas för in vivo-tillämpningar av vävnadsteknik i rekonstruktiv urologi som engineered autologa vävnads plåster utan krav för in vitro-odling före transplantation 11.
Med avseende på cellexpansion och in vitro odlingstekniker, hud epitel och uroepithelium har gemensamma egenskaper. Motivet för att presentera tekniken för plast kompression och malning för både epitelvävnader i denna studie var att avverkning och in vivo-studier för huden epitel är lättare än för blås uroepithelium. På detta sätt kan biomaterial och huden epitel studeras som ett första steg för att bekräfta biokompatibilitet och fysikaliska egenskaper innan du utför mer invasiva studier i urogenitalorganen.
I tidigare in vivo-studier, med hjälp av begreppet malet vävnad med blåsslemhinnan för vävnadsregenerering av ledningar, var resultaten som the små transplanterade partiklar krävs några mekaniskt stöd för att klara mekanisk trauma och att stanna på plats under den inledande ta av de transplanterade malet partiklarna och under läkningsprocessen och vävnadsregenerering 6,7.
För att övervinna dessa brister, studien syftar till att utveckla en hybrid konstruktion med en biologiskt nedbrytbar kärna av en polymer trikå och plast-komprimerade kollagen 11,14. Kollagenet ger en gynnsam yta för cellbindning och tillväxt och möjliggör direkt och snabb integration av malet vävnaden i ställningen. Eftersom emellertid de mekaniska egenskaperna hos kollagen, även efter plast kompression, fortfarande är svaga och skulle inte tåla de sammandragningar och förlängningar av de naturliga urinblåsan rörelser ades en stödkärna byggställning för kollagen tillsätts. För mer komplexa strukturer, kunde transplanterad vävnad expanderas runt en prefabricerad form för att producera en tredimensionell epithelialized struktur med en central lumen.
I dessa studier använde vi PCL som en stabiliserande polymer och kärnan i biograft. PCL används ofta i en mängd olika biomedicinska enheter såsom tandfyllningar, absorberbara syntetiska kirurgiska nät och suturmaterial 14. För att anskaffa mognaden av regenererad vävnad, dvs innervation, glatt muskelvävnad och extracellulär matrix, valde vi en PCL polymer med en långsam nedbrytning takt under flera månader. Emellertid kan nedbrytningshastigheten regleras genom valet av polymer, tjocklek och densitet 11,16.
Kollagen valdes som en del av den sammansatta konstruktionen på grund av välkända biokompatibilitet, säkerhet och god läkning egenskaper. Kollagen främjar inväxt av granulationsvävnad, re-modellering och mognad av extracellulär matris 15. Eftersom kollagen är nedbruten, kärlnybildning och granulationsvävnad stödjer transplantateted malet partiklar som omorganisera, migrera och expandera 5-7,11,16. Dessutom är kollagen en viktig naturlig komponent av den extracellulära matrisen både i huden och i urinblåsan och har använts för att skapa byggnadsställningar både in vitro och in vivo, inklusive sårläkningsstudier och rekonstruktioner i urogenitala systemet 17,18.
De kritiska stegen i protokollet är lätthanterlig. För det första biopsiprover måste hållas under fuktiga och gynnsamma förhållanden före införande i transplantatet annars celltillväxt kommer att försenas eller utebli. En andra fallgrop kan innebära att få rätt soliditet kollagen. Man måste se till att kollagenet blir stel under framställningen av auto genom att undvika bubblor i kollagengelen. Bubblor undviks genom noggrann pipettering och små bubblor kan brytas med en nål. Kollagen med bubblor ska kasseras.
Det är enLSO viktigt att få rätt storlek på det malda vävnaden; före malning vävnaden, se till att bara den tunna blåsan slemhinnan används i fall av urinblåsan expansion eller bara överhuden i fall av expansion hud. Den sista fallgrop är när suturering: se till att flytta vinkelrätt mot transplantatet med nålen för att undvika att separera de olika skikten. Kanterna av autograft måste också hanteras varsamt för att inte separera kollagen från polymeren. Efter att sy arken kommer att bli svårare att separera. Dessa är vanliga problem som kan uppstå när man lär sig tekniken.
En begränsning med denna teknik är att cellerna i malet partiklarna är beroende av diffusion av näringsämnen och syre. Därför har tjockleken på auto att vara mindre än 1 mm och måste placeras i en väl vaskulariserad plats. Detta kan vara en nackdel på grund av risken för läckage av urin genom den transplanterade delen av urinblåsan. Beroende på plastic komprimering kan olika permeabilitets konstanter uppnås. I vårt fall var det hydrauliska permeabilitet (k) värde 0,034 enligt tidigare studier 19. I en klinisk miljö räknar vi med att vi skulle behöva hålla blåsan tom med katetrar i ungefär 1-2 veckor för att ge tid för urotelceller att bygga upp en flerskiktad kontinuerlig urotelium som gör plåstret un-genomträngligt innan aktiv användning.
En annan begränsning är antagandet av en hälsosam organ för vävnad skörd och expansion. I allvarligare fall när blåsan saknas eller är olämpliga för expansion, till exempel när drabbats av cancer, tekniken kanske inte lämpar sig.
Liksom för andra vävnadstekniska cellkonstruktioner, kan slutsatser om funktionella och morfologiska resultat endast besvaras långsiktigt in vivo-studier. Vårt nästa steg blir att analysera våra resultat i långsiktiga djurstudier med avseende på VIABbilitet och fysiologiska egenskaper efter transplantation.
Betydelsen av den presenterade tekniken är möjligheten att expandera vävnad in vivo efter endast en enda kirurgisk procedur. Andra tekniker för närvarande utvärderas är alla beroende av att expandera cellerna in vitro före transplantation. De in vitro förfaranden har nackdelen av att vara förenat med höga kostnader, vilket kräver avancerade laboratoriepersonal, och är tidskrävande. Det kan ta upp till 2 månader mellan skörd av vävnad eller celler och vävnadstekniska autograft; i motsats till mindre än 1 h, enligt den teknik som beskrivs i denna studie.
I framtiden kan malet vävnad i komprimerade kollagen tekniker utökas och användas i andra organ, såsom bukväggen defekter, diafragmabråck, och andra tillstånd där en defekt inte lätt rekonstruerade med befintlig vävnad.
in vivo. Proceduren för framställning av en autograft är lätt att göra och kan användas under sterila betingelser i en vanlig kirurgisk miljö. Den autograft motstår kirurgisk hantering och är biologiskt nedbrytbar. Kärnan av autogent transplantat kan vara sammansatt av olika biologiskt nedbrytbara polymerer, beroende på preferenser när det gäller graden av nedbrytning och andra egenskaper, såsom elasticitet, tjocklek och porositet, och i enlighet med patientens specifika behov. I en klinisk miljö, skulle patienten genomgå vävnads skörd, beredning av kompositauto och auto som ett enda steg. Dessutom är alla delar av de cellinnehållande bioconstructs för närvarande godkända av FDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
