Summary
La ingeniería de tejidos incluye a menudo la expansión in vitro con el fin de crear autoinjertos para la regeneración de tejidos. En este estudio se desarrolló un método para la expansión del tejido, la regeneración, y la reconstrucción in vivo con el fin de reducir al mínimo el procesamiento de células y materiales biológicos fuera del cuerpo.
Introduction
La mayoría de los estudios de ingeniería de tejidos en el trasplante a la piel y el tracto urogenital incluyen cosechas de células autólogas a partir de tejido sano y la expansión de células en los centros de cultivo de células especialmente equipados 1,2.
Después de la expansión de células, las células se suelen almacenar para su uso posterior, cuando se prepara al paciente para recibir el autoinjerto. congeladores de nitrógeno permiten el almacenamiento a largo plazo a bajas temperaturas de -150 ° C o inferior. El proceso de congelación debe ser cuidadoso y controlado con el fin de no perder las células. Uno de los riesgos de la muerte celular es la cristalización del agua intracelular durante el proceso de descongelación, lo que puede conducir a la ruptura de las membranas celulares. congelación de células se realiza generalmente por un enfriamiento lento y controlado (-1 ° C por minuto), utilizando una alta concentración de células, suero bovino fetal, y sulfóxido de dimetilo. Después de la descongelación, las células necesitan ser procesados de nuevo mediante la eliminación del medio de congelación y el cultivo sobre plástico de cultivo de células o unabiomaterial antes del trasplante de nuevo al paciente.
Todas las etapas mencionadas anteriormente requieren mucho tiempo, laboriosa y costosa 3. Además, todo el procesamiento in vitro de células destinados a trasplantes paciente son altamente regulado y requiere de personal y laboratorios 4 bien entrenados y acreditados. Con todo, para procurar un proceso de fabricación seguro y fiable, la técnica sólo se puede establecer en un número muy reducido de centros de tecnología avanzada y un uso más amplio de trastornos quirúrgicos comunes es dudosa.
Con el fin de superar las limitaciones de cultivo de células en el entorno de laboratorio, el concepto de trasplantar tejido picado para la expansión de células in vivo se introduce por el uso del cuerpo como un biorreactor. A estos efectos, los autoinjertos preferentemente se trasplantaron en un molde 3D de acuerdo a la forma que se necesita para la reconstrucción final del órgano de interés 5-7.
Originalmente, la idea de trasplantar epitelio picada fue presentado por Meek en 1958 cuando describió cómo el epitelio crece a partir de los bordes de una herida. Demostró que un pequeño trozo de piel aumentaría sus márgenes y por lo tanto su potencial para la expansión de células en un 100% por el corte de la pieza dos veces en direcciones perpendiculares (Figura 1) 8. La teoría ha sido apoyado por el uso de injertos de piel de espesor parcial en malla para el trasplante de piel 9 y en la piel de la herida modelos 10 de cicatrización.
Figura 1:. Teoría Meek Según la teoría de Meek, epitelio crece a partir de los bordes de una herida. Al aumentar el área expuesta por la tecnología de picar carne, tejido picado epithelializes heridas de muchos puntos.
El presente estudio se basa en el hipotesis de que el mismo principio podría aplicarse al tejido subcutáneo mediante la colocación de epitelio picada alrededor de un molde. Las células epiteliales se movilizarían de trasplantes picados (reorganizar), cubren las áreas de heridas (migrar) y dividir (ampliar) con el fin de formar un neoepithelium continua que cubre el área de la herida y separa el cuerpo extraño (el molde) del cuerpo interior ( la Figura 2).
Figura 2:. Dibujos animados de un molde 3D con epitelio picada para la expansión del tejido in vivo intracorporal según la teoría de Meek Mediante el uso de tejido picado colocado en un molde y luego trasplantadas en el tejido subcutáneo, la hipótesis es que las células epiteliales migran desde el bordes del tejido picado, reorganizan, y se expanden con el fin de formar un neoepithelium continua que cubre el área de la herida y se separa el cuerpo extraño (el molde) del cuerpo interior.
Aunque estudios previos in vivo muestran resultados prometedores, mejoras adicionales podrían alcanzarse mediante el refuerzo de los autoinjertos de modo que el epitelio regenerado podría soportar trauma mecánico mejor 7. A estos efectos, se identificaron requisitos importantes para un biomaterial éxito, tales como: fácil difusión de nutrientes y productos de desecho, posibilidad de molde de una manera 3D y facilidad de manejo quirúrgico. Conclusiones Se hicieron que estas necesidades podrían satisfacerse mediante la adición de un biomaterial compuesto al tejido picado.
El estudio tuvo como objetivo desarrollar un andamio compuesto de tejido colágeno en picada plástico comprimido que contiene un núcleo de refuerzo de un tejido biodegradable. Por estos medios, las células viables podrían migrar de las partículas de tejido desmenuzado y proliferar con características morfológicas característica del epitelio original (piel o urotelio). Uso de la compresión de plástico, el andamio era reducird en tamaño de 1 cm a alrededor de 420 micras como las partículas picadas se encerrado en el colágeno de la capa superior. El tejido básico podría ser cualquier polímero pero necesita ser modificado con una superficie hidrófila con el fin de interconectar con las capas de colágeno que cubren 11.
El método proporciona una integridad andamio mejorada mediante la incorporación de una malla tejida que consiste en poli (ε-caprolactona) (PCL) dentro de los dos geles de colágeno de plástico comprimido de usarlo como un andamio para el cultivo de la mucosa de la vejiga o de la piel picada picada a partir de cerdos. La construcción se mantiene en condiciones de cultivo celular para un máximo de 6 semanas in vitro, lo que demuestra la formación con éxito de una, de varias capas urotelio o epitelio estratificado escamoso de piel en la parte superior de una construcción híbrida bien consolidada. La construcción era fácil de manejar y puede ser suturado en su lugar con fines de aumento de la vejiga o de cobertura de defectos de la piel. Todas las partes del andamio de tejido están aprobados por la FDA y la técnicapodría ser utilizado para los procedimientos de una sola etapa por la recolección de tejido, picado, compresión de plástico, y el trasplante de nuevo al paciente como una intervención por etapas sola. El procedimiento puede ser realizado por la expansión del tejido y la reconstrucción en condiciones estériles en cualquier unidad de cirugía general.
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Protocol
Todos los animales protocolos fueron aprobados previamente por el Comité del Condado de Estocolmo sobre los animales y todos los procedimientos se ajustaban a las normas para el uso de animales, así como las leyes federales pertinentes.
1. Procedimientos de Animales
- Preparación del animal para la cirugía
- Preparar la mesa de operaciones con todos los materiales y los instrumentos necesarios para la operación en condiciones estériles. Realizar la cirugía exclusivamente en condiciones estériles para reducir el riesgo de infección y de optimizar las condiciones en la cirugía de la supervivencia.
- Ayunar el animal durante 12 horas antes de la cirugía y medir su peso. Administrar una inyección intramuscular de azaperona (2 mg / kg) para la premedicación. Anestesiar al animal con inyecciones intramusculares de hipoclorito de tiletamina (2,5 mg / kg), hipoclorito de zolazepam (2,5 mg / kg), medetomidina (25 mg / kg) y atropina (25 mg / kg).
- Inyectar phenobarbiturate (15 mg / kg) antes de la endotracheAl continuar con la intubación y anestesia general con 0,8% y el 2% de isoflurano. Insertar un catéter de la vena periférica en un oído y de infundir la glucosa (25 mg / ml) por vía intravenosa durante el procedimiento para mantener el bienestar del animal.
- Colocar dispositivos en el oído o en la cola de control para comprobar la temperatura, la presión arterial, la saturación y el pulso periférico. La anestesia de control por el estímulo del dolor de los oídos o cascos. Aplique un ungüento para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- La escisión de la vejiga La biopsia de muestras
- Cateterizar la vejiga mediante un catéter de silicona 10-francesa mediante la introducción de un espéculo para observar la uretra e insertar el catéter a través de la uretra hasta la vejiga urinaria para vaciar la orina en condiciones semi-estériles. Llenar la vejiga con solución salina estéril hasta una presión de 20 a 25 cm H 2 O, alrededor de 100 a 300 ml, y luego vacío a 20 cm H 2 O (aprox. 8 ml / kg de peso corporal).
- con THe cerdo volvió cuidadosamente a una posición lado, realizar una esterilización preoperatoria básica de la piel con la aplicación de gluconato de clorhexidina. Aplicar una placa de diatermia en el hombro después de retirar el pelaje con unas tijeras de afeitar.
- Girar el cerdo cuidadosamente en una posición supina y retire el pelaje abdominal utilizando tijeras de afeitar y hacer una esterilización preoperatorio básico de la piel del abdomen con la aplicación de gluconato de clorhexidina.
- Incrustar las extremidades con la ropa suave para reducir al mínimo el riesgo de dañar la hiperextensión de las articulaciones de las extremidades. Esterilizar la piel abdominal del animal con aplicaciones sucesivas de gluconato de clorhexidina y colocar drapeado estéril alrededor del campo quirúrgico.
- Antes de la incisión de la piel, aplicar un analgésico intravenosa que consta de buprenorfina (45 mg / kg), carprofeno (3 mg / kg) y la inyección local de lidocaína en la línea media por debajo del ombligo. Compruebe si hay reacción al dolor agarrando el skcon fórceps. Hacer una incisión en la línea media inferior a través de la fascia y el peritoneo mediante diatermia para el control de la hemorragia. Localizar la vejiga que tiene una posición completamente intraperitoneal en el cerdo y puede ser expuesto libremente mediante la movilización a través de la herida quirúrgica.
- Echa mano de la vejiga con el fórceps y medir con una cinta métrica esterilizada y marque una muestra de biopsia con forma elíptica-aproximadamente 2 cm longitudinalmente y 1 cm transversalmente, o menor, utilizando una pluma esterilizada (el cerdo tolera una reducción trimestre del tamaño de la vejiga muy bien). Escindir el área marcada, utilizando un bisturí, y coloque la muestra de biopsia de vejiga en DMEM bajo condiciones estériles.
- Realizar autotrasplante con el Bio Transplant o cerrar la vejiga mediante la sutura con 5-0 Vicryl en dos capas. Cerrar la fascia abdominal cuidadosamente con 2-0 o 3-0 Vicryl corriendo. Cierre la hipodermis con Vicryl 3-0 y 3-0 con la piel Ethilon. Colocar un apósito en la herida y cuidadosamentetienden al animal hasta que se ha recuperado suficientemente de la anestesia y no expresar dolor.
- Mover el animal a la instalación de cuidado de los animales para asegurar las condiciones para el cuidado postoperatorio. Poner al animal en una jaula individual con una lámpara de calefacción y atender al animal hasta la recuperación completa de la anestesia y luego dejar que los animales a ser instaladas en pares.
- Proporcionar una recuperación sin complicaciones en relación con el dolor y el bienestar y la administración de buprenorfina (45 mg / kg) por vía intramuscular para la analgesia postoperatoria y trimetoprim (4 mg / kg) y sulfonamida (20 mg / kg) dos veces al día durante tres días y una vez al día durante cinco días para reducir el riesgo de infecciones postoperatorias.
- La escisión de la piel Biopsia de muestras
- Preparar la mesa de operaciones con todos los materiales necesarios. Anestesiar al animal como se describe anteriormente en 1.1. Retire el pelaje con cera, lavar y esterilizar el área de la incisión con betadine y alcohol al 70% y luego colocar drapeado estéril todas partes del mundod la zona de la incisión.
- Use un dermatoma para cosechar unas 0,3 mm de espesor parcial muestra de biopsia de piel. Colocar la muestra de piel en DMEM antes de ser picada, como se describe en 2.2. Cubrir el área de la herida con un ungüento graso y un vestidor.
2. Preparación del tejido picada
- La mucosa de la vejiga
- Se lava la biopsia de vejiga dos veces en DMEM. Coloque la muestra de biopsia de la vejiga en una placa de disección esterilizada con la mucosa hacia arriba y fijar uno de los lados a la placa usando pasadores de disección.
- Separar el tejido de la mucosa del músculo detrusor usando tijeras finas y pinzas (Figura 3) y mantener la mucosa húmeda por goteo de solución salina o DMEM sobre él.
- Utilice el dispositivo de picar carne colocándola en la mucosa y luego pasar el dispositivo de un extremo a otro en vertical y horizontal, aplicando presión manual para obtener piezas de tejido picado de 0,8 mm x 0,8 mm (0,8 mm es la distancia entre el rotating cuchillas de corte).
- Piel
- Si el Biosis piel gruesa son: colocar la piel sobre una placa de disección estéril y utilizar tijeras quirúrgicas para separar la epidermis de la dermis y la grasa subcutánea. La epidermis es delgada y translúcida (aprox. 0,3 mm) cuando está listo para picar.
- Utilice el dispositivo de picado colocándolo en la epidermis. Con la presión, pasar el dispositivo de un extremo a otro verticalmente y horizontalmente para obtener piezas de tejido picado de 0,8 mm x 0,8 mm.
3. Preparación de comprimidos de plástico PCL / autoinjertos de colágeno
- Colocar todos los ingredientes en el hielo para mantener fría. Utensilios necesarios: tubo Falcon, 10x DMEM, 1x DMEM, NaOH 1 N y cola de rata colágeno tipo 1.
- Mezclar 2 ml de 10x DMEM (con cuidado para evitar burbujas) con 12 ml de colágeno de tipo 1. Añadir 1 N NaOH, gota a gota, para llevar el pH hasta 7,4 a 8 (color en el medio debe indicar el pH mediante el cambio de la intensa amarillo a la clavijak). Además, utilizar una tira de pH.
- Añadir cuidadosamente 2 ml de 1x DMEM y se mezcla la solución. Plate aproximadamente 2 ml de colágeno en cada pocillo del molde rectangular de acero (20x30x10 mm) y se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 durante 10 min.
NOTA: La concentración de colágeno debería ser 2,06 mg / ml en ácido acético 0,6% y la cantidad de colágeno 1 ml / cm 2. - Una vez que el colágeno coloca en el molde, colocar el biomaterial (PCL) en la parte superior del gel de colágeno (20 mm x 30 mm) y se vierte el colágeno restante (aproximadamente 6 ml) en la parte superior de la misma. Incubar a 37 ° C en 5% de CO2 durante 20 min.
- Coloque el tejido picado (de 1: 6 de expansión) en la parte superior del gel de colágeno. Pulsar el agua fuera de la construcción por fuerza mecánica mediante la compresión de plástico de la siguiente manera (figuras 3 y 4).
- Coloque una capa gruesa de compresas de gasa sobre una superficie estéril. Colocar una malla de acero inoxidable (400 m de espesor) en la parte superior de la GAUZe almohadillas y luego una hoja de malla de nylon (110 m de espesor). Transferir cuidadosamente el gel de colágeno / tejido picado sobre la malla de nylon y retirar con cuidado el molde de acero rectangular.
- Colocar una nueva capa de malla de nylon en la parte superior del gel de colágeno del tejido / picada. Colocar una segunda malla de acero en la parte superior de la malla de nylon. Colocar en posición la placa de presión o carga con un peso mínimo de 120 g (es decir, una placa de vidrio) durante 5 min.
- Retire las mallas de peso, de nylon y acero. Los autoinjertos son ahora listo para ser suturado a la vejiga de cerdo en las heridas de espesor completo de la piel o cultivadas in vitro.
- Para el cultivo in vitro, cortar el constructo delgada en pequeñas piezas de montaje placas de 12 pocillos. Añadir 1 ml de medio de queratinocitos. Colocar las placas en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 y la cultura hasta 6 semanas y cambiar el medio 3 veces por semana.
4. Sutura de autoinjertos
- Sutura de autoinjerto con lapicada mucosa de la vejiga de la vejiga de cerdo
- Mantenga el autoinjerto húmeda en DMEM durante el tiempo de espera. Suturar el autoinjerto con suturas de monofilamento funcionando muy bien. Utilice no absorbible 5-0 Ethilon con fines de investigación.
- Compruebe si estanco llenando la vejiga con solución salina a través del catéter urinario permanente. Si es posible, cubrir el autoinjerto con una capa de epiplón mayor. Cierre de la pared abdominal, el tejido subcutáneo y la piel como se describe en 1.2.6. Aplicar un apósito de la herida.
- Sutura en el autoinjerto con la epidermis de la piel picada a una herida de espesor total
- Mantenga el autoinjerto húmeda en DMEM durante el tiempo de espera.
- Suturar el autoinjerto a la parte inferior de la piel de espesor total de la herida por suturas interrumpidas en las esquinas y en el centro del autoinjerto para mantener el autoinjerto estrechamente unida a la superficie subyacente.
- Cubra la herida con un apósito de plástico que mantiene la herida húmeda.
- Sedar al animal con la inyección intramuscular de hipoclorito de zolazepam (2,5 mg / kg) y medetomidina (25 mg / kg) antes de la terminación y aplicar los dispositivos de supervisión a la oreja o cola para comprobar el pulso y la presión arterial.
- La eutanasia a los animales mediante la administración de una dosis letal de pentobarbital sódico (60 a 140 mg / kg) por vía intravenosa. Compruebe el pulso y la presión sanguínea hasta que se produce la muerte.
6. Cultivo in vitro
NOTA: Para evaluar histológicamente la progresión de la tejido picado en los constructos PCL / colágeno in vitro, el colágeno / PCL / parches picada se cultivan en placas de 12 pocillos usando medio de queratinocitos.
- Preparación del medio de queratinocitos:
- Esterilizar una botella de vidrio de 500 ml.
- Mezclar 400 ml de DMEM con 100 ml de F12 de Ham (mezcla 4: 1). Suplemento con suero bovino fetal al 10%, insulina 5 mg / ml,0,4 mg / ml de hidrocortisona, 21 mg / ml de adenina, 10 -10 mol / L toxina del cólera, 2 x 10 -9 mol / L triyodotironina, 5 mg / ml de transferrina, 10 ng / ml factor de crecimiento epidérmico, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina.
- Esterilizar por filtración de través de un filtro 0,2 micras y recoger el filtrado en la botella 500 ml estéril.
7. La inmunohistoquímica
NOTA: El protocolo de inmunohistoquímica se divide generalmente en los siguientes pasos: (1) la fijación e inclusión en parafina, (2) micro-seccionar a 5 micras rodajas, la colocación en portaobjetos, desparafinación y rehidratación, (3) desenmascaramiento de antígeno, la tinción y montaje . Antes de comenzar los últimos pasos en el procedimiento de inmunohistoquímica, preparar los tampones de lavado y la solución de antígeno desenmascarar (ver detalles materiales separados). Preparar la solución del complejo ABC al menos 30 minutos antes de su uso.
- Fijación
NOTE: Al final del cultivo in vitro, fijar los parches de la siguiente manera:- Preparar tubos Eppendorf con 1 ml de formaldehído al 4% tamponado (PFA) (Precaución:. Formaldehído es tóxico Lea las hojas de datos de seguridad de materiales antes de trabajar con este producto químico Use guantes y gafas de seguridad y preparar la solución dentro de una campana de humos.).
- Transferir cada uno de los parches de colágeno a un tubo Eppendorf que contiene 4% PFA. Fijar durante la noche a temperatura ambiente.
- Colocar las muestras en etanol al 70% para el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C. Las muestras están ahora listos para la deshidratación y la incrustación en bloques de parafina antes de seccionar.
- rehidratación
- Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con X-tra solv durante 15 minutos. Repita mediante el uso de una nueva cubeta de tinción con solv X-tra. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con etanol absoluto durante 10 min. Repita mediante el uso de una nueva cubeta de tinción con etanol absoluto. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con etanol al 95% durante 10 minutos y, posteriormente,a una cubeta con 70% de etanol durante 10 min. Finalmente lavar los portaobjetos dos veces durante 5 minutos con agua destilada.
- El desenmascaramiento de antígeno
- Poner diapositivas en una jarra Coplin con TE-solución y poner el frasco en un baño de agua a hervir durante 20 minutos. Tome el frasco fuera del baño de agua con cuidado. Enfriar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min y se lava dos veces durante 5 minutos en tampón Tris. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min. Lavar los portaobjetos dos veces durante 5 min en tampón Tris. Dibujar un círculo alrededor de las muestras utilizando un repelente al agua pluma de marca.
- Bloquear la unión no específica del anticuerpo usando 100 a 300 l de solución de bloqueo. Eliminar la solución de bloqueo y añadir 100 a 300 l de anticuerpo primario disuelto a la concentración recomendada en tampón Tris. Incubar toda la noche. Retirar la solución de anticuerpo y lavar las secciones en tampón Tris dos veces por 5 min.
- Incubar con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperat habitaciónUre. Lavar dos veces durante 5 min en tampón Tris. Incubar 30 minutos utilizando el kit ABC Elite (siga las instrucciones del fabricante). Lavar dos veces en tampón Tris.
- Desarrollar reacción de anticuerpos utilizando el Kit de VIP Vector, siguiendo las instrucciones del fabricante (1-7 min de incubación generalmente produce una intensidad de color violeta claro). Poner los portaobjetos en agua destilada. Contratinción con hematoxilina de Mayer durante 30 seg.
- Lavar en agua corriente durante 5 min. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con 70% de etanol durante 1 min. Repita mediante el uso de una nueva cubeta de tinción con un 70% de etanol. Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con 95% de etanol durante 1 min. Repita mediante el uso de una nueva cubeta de tinción con un 95% de etanol.
- Colocar los portaobjetos en una cubeta de tinción con X-tra solv durante 5 min. Eliminar, uno a la vez para mantener la humedad. Coloque una gota de medio de montaje en la parte superior de cada diapositiva y poner una cubierta de vidrio en la parte superior (hacerlo con cuidado para evitar burbujas de aire). Deje que los portaobjetos se secan durante la noche y ver las diapositivas bajo un microalcance.
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Representative Results
Este estudio presenta un método que muestra cómo producir un biomaterial para el trasplante utilizando la compresión de plástico de colágeno y tejido picado.
Mucosa de la vejiga y la piel pueden ser cosechadas mecánicamente y luego picado en pequeñas partículas (Figura 3). Por compresión de plástico, las partículas picadas se incorporan dentro de la armazón de material compuesto compuesta de un polímero biodegradable colocado en posición central que es mecánicamente fuerte dentro de las capas exteriores de un gel de colágeno (Figura 4). partículas de tejido picado se pueden separar para permitir un 1: tasa de expansión 6. Pulsando el contenido de agua del colágeno, se completa un Bio Transplant para la cirugía reconstructiva autólogo.
Biotransplantes se pueden utilizar para autotrasplante al animal para estudios de investigación in vivo o cultivadas en un medio de cultivo celular normal para estudios adicionales in vitro.
T que autoinjerto compuesto permite agarrar y suturar y sostiene manejo quirúrgico (Figura 5). El proceso de la cosecha de tejidos y la preparación del autoinjerto que contiene células para la cirugía reconstructiva tarda aproximadamente 20 min y está dirigido para ser realizado como un procedimiento de etapas individual.
En los estudios in vitro las células migran, ampliar y reorganizar a la superficie del autoinjerto en una capa continua de una sola célula en dos semanas. Después de cuatro semanas, el epitelio continuo es de aproximadamente 4 capas de células de espesor (Figura 6). La inmunohistoquímica en diferentes puntos en el tiempo revela que las células proliferan, migran y se reorganizan en un epitelio continuo con una microarquitectura típico para el fenotipo celular. Los mismos resultados se aplican para los autoinjertos con epitelio de la piel picada de mucosa vesical picada.
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Figura 3:. Picada preparación del tejido y la compresión de plástico La preparación de la mucosa de la vejiga (A) para picar (C) y la compresión de plástico (D - F), utilizando el dispositivo de picar carne en (B) y el molde en (D) para producir una trasplante de 420 micras de espesor (H). Tenga en cuenta que el colágeno en sí es una buena matriz extracelular, pero es difícil de manejar mecánicamente (G); mediante la colocación de una tela biodegradable como un núcleo de refuerzo, el trasplante se convierte en fácil de entender (H).
Figura 4: la compresión de plástico un dibujo animado que muestra el proceso de compresión de plástico con partículas picadas..
Figura 5:. La manipulación quirúrgica modelo de herida en la piel de grosor completo en un biomaterial-plástico comprimido demostrando rata suturado con la piel picada de autotrasplante marcado como T (autoinjerto trasplantado) biomaterial se sutura la piel picada sin marcado como S (simulado). En este caso, el epitelio de la piel picada se trasplantó un 1: tasa de expansión 3.
Figura 6: La tinción inmunohistoquímica para visualizar la progresión de la cultura 3D en la piel y la vejiga mucosa picada colágeno-biomaterial (A - D) tinción con hematoxilina / eosina de (A) piel nativa, (B) de la vejiga nativa, (C) picada. piel después de 5 semanas en cultivo y (D) de la vejiga picada después de 6 semanas de cultivo. La expresión de marcadores epiteliales y de proliferación con MNF116 (E) y Ki 67 anticuerpos (
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Discussion
Este estudio presenta un enfoque fácil de usar para producir parches pared de la vejiga con tejido autólogo para el trasplante en la mesa quirúrgica. Los parches están formados por la combinación de un tejido de punto de polímero biodegradable en el medio y el colágeno, con y sin tejido picado en las superficies exteriores en combinación con la compresión de plástico. Compresión de plástico es un método descrito previamente por otros autores y se puede definir como una rápida expulsión de fluido a partir de geles de colágeno 12,13. tejido picado de la mucosa de la vejiga o de la piel se siembra en este andamio y la formación de un epitelio de la vejiga o de la piel podría ser seguido durante 6 semanas. Análisis inmunohistoquímico mostró la formación de equivalentes característicos de tejido normal. Estos resultados permiten no sólo un modelo in vitro para el estudio de re-epitelización y curación de la herida, pero también forma un biomaterial para el trasplante de tejido autólogo. Lo más importante para los propósitos de la urología, la autografts se pueden utilizar para aplicaciones in vivo de la ingeniería de tejidos en urología reconstructiva como parches de tejidos autólogos modificados sin el requisito para el cultivo in vitro antes del trasplante 11.
En relación a la expansión de células y en las técnicas de cultivo in vitro, epitelio de la piel y comparten características comunes uroepitelio. El motivo para presentar la técnica para la compresión de plástico y picado para ambos tejidos epiteliales en este estudio fue que la cosecha y en estudios in vivo para el epitelio de la piel es más fácil que para uroepitelio vejiga. Por estos medios, los biomateriales y epitelio de la piel pueden ser estudiados como un primer paso para confirmar la biocompatibilidad y propiedades físicas antes de realizar estudios más invasivos en los órganos urogenitales.
En previa en estudios in vivo, utilizando el concepto de tejido picado con la mucosa de la vejiga para la regeneración del tejido de conductos, los hallazgos fueron que THe pequeñas partículas trasplantados requieren algún soporte mecánico con el fin de soportar el trauma mecánico y permanecer en el lugar durante la toma inicial de las partículas picadas trasplantados y durante el proceso de cicatrización y regeneración tisular 6,7.
Para superar estas deficiencias, el estudio dirigido a desarrollar un híbrido construir con un núcleo biodegradable de un tejido de punto polímero y colágeno-plástico comprimido 11,14. El colágeno proporciona una superficie favorable para la unión celular y el crecimiento y permite la integración directa y rápida del tejido picado en el armazón. Sin embargo, ya que las propiedades mecánicas del colágeno, incluso después de la compresión de plástico, aún son débiles y no sostener las contracciones y extensiones de los movimientos de la vejiga naturales, se añadió un andamio núcleo de soporte para el colágeno. Para estructuras más complejas, tejido trasplantado podría ampliarse alrededor de un molde prefabricado para producir un ep tridimensionalestructura ithelialized con un lumen central.
En estos estudios se utilizó PCL como un polímero estabilizador y el núcleo de la biograft. PCL es ampliamente utilizado en una variedad de dispositivos biomédicos tales como empastes dentales, mallas quirúrgicas sintéticas absorbibles y materiales de sutura 14. Con el fin de conseguir la maduración del tejido regenerado, es decir, inervación, el tejido muscular liso y la matriz extracelular, se optó por un polímero de PCL con una velocidad de degradación lenta durante varios meses. Sin embargo, la velocidad de degradación se puede regular mediante la elección del polímero, espesor y densidad de 11,16.
El colágeno fue elegido como un componente de la construcción de material compuesto debido a la biocompatibilidad conocida, la seguridad y buenas características de curación. El colágeno promueve el crecimiento hacia dentro de tejido de granulación, re-modelado y la maduración de la matriz extra-celular 15. Como colágeno se degrada, la neovascularización y el tejido de granulación apoya el trasplanteed picada partículas que reorganizan, migran y se expanden 5-7,11,16. Además, el colágeno es un importante componente natural de la matriz extracelular tanto en la piel y en la vejiga y se ha utilizado para la creación de andamios, tanto in vitro e in vivo incluyendo los estudios de cicatrización de heridas y reconstrucciones en el 17,18 sistema urogenital.
Los pasos críticos en el protocolo son fácilmente manejables. En primer lugar, las muestras de biopsia tienen que ser mantenidos en condiciones de humedad y favorables antes de la inserción en el trasplante o el crecimiento celular más va a ser retrasado o ausente. Una segunda trampa puede implicar conseguir la solidez derecha del colágeno. Hay que asegurarse de que el colágeno se endurece durante la preparación del autoinjerto al evitar burbujas en el interior del gel de colágeno. Las burbujas se evitan mediante pipeteado cuidadoso y pequeñas burbujas se pueden romper con una aguja. El colágeno con burbujas debe ser desechada.
Es unlso importante para obtener el tamaño adecuado del tejido picado; con anterioridad al picado del tejido, asegúrese de que sólo la mucosa vesical fina se utiliza en los casos de ampliación de la vejiga o sólo la epidermis en los casos de expansión de la piel. El último escollo es cuando la sutura: asegúrese de moverse perpendicularmente al trasplante con la aguja con el fin de evitar la separación de las diferentes capas. Los bordes de la autoinjerto también deben ser manejados con cuidado a fin de no separar el colágeno a partir del polímero. Después de la sutura de las hojas será más difícil de separar. Estos son problemas comunes que pueden surgir al aprendizaje de la técnica.
Una limitación de esta técnica es que las células en las partículas picadas se basan en la difusión de nutrientes y oxígeno. Por lo tanto, el espesor de la autoinjerto tiene que ser de menos de 1 mm y tiene que ser colocado en un sitio bien vascularizada. Esto podría ser una desventaja debido al riesgo de fuga de orina a través de la parte transplantado de la vejiga. Dependiendo de la plastcompresión ic, se puede lograr de distintas constantes de permeabilidad. En nuestro caso el valor de permeabilidad hidráulica (k) era 0,034 de acuerdo con estudios previos 19. En un entorno clínico anticipamos que nos lo necesario para mantener la vejiga vacía con catéteres durante aproximadamente 1-2 semanas con el fin de dar tiempo a las células uroteliales para construir una urotelio continua de múltiples capas que hacen que el parche no-permeable antes de activo utilizar.
Otra limitación es la asunción de un órgano sano para la cosecha de tejidos y expansión. En los casos más severos cuando la vejiga está incompleto o no aptos para la expansión, por ejemplo, cuando se ven afectados por el cáncer, la técnica podría no ser adecuado.
En cuanto a otras construcciones de ingeniería tisular de células, las conclusiones finales sobre los resultados funcionales y morfológicos sólo pueden ser respondidas en el largo plazo los estudios in vivo. Nuestro próximo paso será analizar nuestros resultados en estudios en animales a largo plazo con respecto a VIABility y las características fisiológicas post-trasplante.
La importancia de la técnica presentada es la posibilidad de expandir el tejido in vivo después de sólo un único procedimiento quirúrgico. Otras técnicas que se están evaluando actualmente dependen todos de la expansión de las células in vitro antes del trasplante. Los procedimientos in vitro tienen la desventaja de ser asociado con altos costos, lo que requiere el personal de laboratorio avanzadas, y siendo mucho tiempo. Se puede tomar hasta 2 meses entre la recolección de células o tejidos y un autoinjerto de tejido de ingeniería; A diferencia de menos de 1 hora, de acuerdo con la técnica descrita en este estudio.
En el futuro, tejido picado en técnicas de colágeno comprimido se puede expandir y utilizar en otros órganos, tales como defectos de la pared abdominal, hernia diafragmática, y otras condiciones donde un defecto no se reconstruye fácilmente con el tejido existente.
in vivo. El procedimiento de preparación de un autoinjerto es fácil de hacer y se puede utilizar en condiciones estériles en un entorno quirúrgico ordinario. El autoinjerto se resiste a la manipulación quirúrgica y es biodegradable. El núcleo del autoinjerto puede estar compuesto de diferentes polímeros biodegradables dependiendo de las preferencias en cuanto a la tasa de degradación y otras características, tales como la elasticidad, espesor y porosidad, y de acuerdo a las necesidades específicas del paciente. En un entorno clínico, el paciente someterse a la cosecha de tejidos, la preparación del compuesto y autoinjerto autotrasplante como un procedimiento de una sola etapa. Además, todas las partes de las bioconstructs que contienen células están actualmente aprobados por la FDA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
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