Summary
Tissue engineering omfatter ofte in vitro ekspansion for at skabe autotransplantater til vævsregenerering. I denne undersøgelse blev udviklet en fremgangsmåde til vævsekspansion, regenerering og genopbygning in vivo for at minimere behandlingen af celler og biologiske materialer uden for kroppen.
Introduction
De fleste væv engineering undersøgelser om transplantation til huden og urogenitale tarmkanalen omfatter autologe celle høst fra sundt væv og celler ekspansion i særligt udstyrede celle-dyrkning faciliteter 1,2.
Efter celleekspansion celler sædvanligvis opbevares til senere anvendelse, når patienten er parat til at modtage autograft. Nitrogenholdige frysere tillader langtidsopbevaring ved lave temperaturer på -150 ° C eller lavere. Processen med frysning skal være forsigtig og kontrolleret for ikke at miste cellerne. En risiko for celledød er krystallisering af intracellulær vand under optøningsprocessen, hvilket kan føre til sprængning af cellemembranerne. Celle frysning udføres sædvanligvis ved langsom og kontrolleret afkøling (-1 ° C pr min), ved anvendelse af en høj koncentration af celler, føtalt bovint serum og dimethylsulfoxid. Efter optøning skal bearbejdes igen ved at fjerne frysning medium og dyrkning på cellekultur plast eller et cellernebiomaterialet før transplantation tilbage til patienten.
Alle de ovennævnte trin er tidskrævende, arbejdskrævende og bekostelig 3. Derudover alle in vitro-behandling af celler beregnet til patient transplantation er stærkt reguleret og kræver veluddannede og akkrediterede personale og laboratorier 4. Alt i alt, at skaffe en sikker og pålidelig fremstillingsproces, teknikken kunne kun være etableret i et meget lille antal teknisk avancerede centre og en bredere brug i almindelige kirurgiske lidelser er tvivlsomt.
For at overvinde begrænsningerne ved celledyrkning i laboratoriemiljøet er begrebet transplantere hakket væv for celle ekspansion in vivo indført ved hjælp af kroppen selv som en bioreaktor. Til disse formål, vil de autotransplantater fortrinsvis skal transplanteres på et 3D støbeform i overensstemmelse med formen, der er nødvendig ved den endelige rekonstruktion af organet af interest 5-7.
Oprindeligt var ideen om at transplantere hakket epitel præsenteret af Meek i 1958, da han beskrev, hvordan epitel vokser fra kanterne af et sår. Han påviste, at et lille stykke hud vil øge sine marginer og dermed dens potentiale for celle ekspansion med 100% ved at skære det stykke to gange i vinkelrette retninger (figur 1) 8. Teorien er blevet støttet af brugen af i indgreb delvise tykkelse hudtransplantationer for hudtransplantation 9 og i huden sårheling modeller 10.
Figur 1:. Meek teori Ifølge Meek teori, epitel vokser fra kanterne af et sår. Ved at øge området afsløret af hakningen teknologi, hakket væv epithelializes sår fra mange vinkler.
Den foreliggende undersøgelse er baseret på den hypotese, at det samme princip kunne anvendes til det subkutane væv ved at placere hakket epitel omkring en form. Epitelcellerne ville mobilisere fra hakket transplantationer (reorganisere), dække såret områder (migrere) og dividere (udvide) for at danne en kontinuerlig neoepithelium der dækker sårområdet og adskiller fremmedlegeme (formen) fra det indre legeme ( figur 2).
Figur 2:. Tegning af en 3D-form med hakket epitel til in vivo intracorporal vævsekspansion ifølge teorien om Meek Ved at bruge hakket væv anbringes på en form og derefter transplanteres til det subkutane væv, er hypotesen, at epitelcellerne vandrer fra kanter af det hakkede væv, omorganisere og ekspandere for således at danne en kontinuerlig neoepithelium der dækker sårområdet og adskiller fremmedlegeme (formen) fra det indre legeme.
Selvom tidligere in vivo undersøgelser viser lovende resultater, kunne yderligere forbedringer opnås ved at styrke de autotransplantater så regenereret epitel kunne modstå mekanisk traume bedre 7. Til disse formål, blev vigtige forudsætninger for en vellykket biomateriale identificeret, såsom: let diffusion af næringsstoffer og affaldsprodukter, mulighed for skimmel i en 3D måde og lethed af kirurgisk håndtering. Konklusioner blev foretaget, at disse behov kan opfyldes ved at tilføje et sammensat biomateriale til det hakkede væv.
Den nuværende undersøgelse med henblik på at udvikle et stillads bestående af hakket væv i plast-komprimeret collagen indeholdende en forstærkende kerne af en bionedbrydelig stof. Ved hjælp af disse, kan levedygtige celler migrere fra hakket vævspartikler og proliferere med morfologiske træk er karakteristiske for den oprindelige epitel (hud eller urothelium). Ved hjælp af plast kompression, skafottet var reducered i størrelse fra 1 cm til ca. 420 um som hakket partikler blev indkapslet i det øvre lag collagen. Kernen stof kunne være nogen polymer men skal ændres med en hydrofil overflade for at forbinde med de dækker kollagenlagene 11.
Den fremgangsmåde, en forbedret stillads integritet ved at indarbejde en strikket maske bestående af poly (ε-caprolacton) (PCL) inden for to plast komprimeret kollagengeler bruger det som et stillads til dyrkning hakket blære slimhinde eller hakket hud fra svin. Konstruktionen blev opretholdt i celledyrkningsbetingelser i op til 6 uger in vitro, hvilket viser vellykket dannelse af en lagdelt, flerlaget urothelium eller squamous hud epitel på toppen af en velkonsolideret hybrid konstruktion. Konstruktionen var let at håndtere og kan sutureres på plads til blære augmentation formål eller dækning af overfladefejl. Alle dele af vævet stillads er FDA-godkendt, og teknikkenkunne anvendes til procedurer ettrins ved vævshøst, hakning, plast kompression, og omplantning tilbage til patienten som en enkelt-iscenesat intervention. Proceduren kan udføres for væv ekspansion og genopbygning under sterile forhold i enhver almen kirurgi enhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller blev forhåndsgodkendt af Stockholms len Komité for Animals og alle procedurer var i overensstemmelse med reglerne for brug af dyr, samt relevante føderale vedtægter.
1. Animalske Procedurer
- Klargøring af Animal for Kirurgi
- Forbered den kirurgiske tabel med alle de materialer og redskaber, der er nødvendige for driften under sterile forhold. Udføre operationen udelukkende under sterile betingelser for at reducere risikoen for infektion og optimere betingelserne i overlevelse kirurgi.
- Fast dyret i 12 timer før kirurgi og måle dens vægt. Indgivelse af en intramuskulær injektion af azaperone (2 mg / kg) for præmedicinering. Bedøver dyret med intramuskulære injektioner af tiletamin hypochloride (2,5 mg / kg), zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg), medetomidin (25 ug / kg) og atropin (25 ug / kg).
- Injicer phenobarbiturate (15 mg / kg) forud for endotracheal intubation og fortsætte generel anæstesi med 0,8% -2% isofluran. Indsæt en perifer vene kateter i det ene øre og indgyde glucose (25 mg / ml) intravenøst under proceduren for at opretholde trivsel af dyret.
- Placer overvågning enheder på øret eller halen til at kontrollere temperatur, blodtryk, mætning og perifer puls. Kontrol anæstesi ved smerter stimulering af ørerne eller hove. Påfør salve til øjnene for at forhindre tørhed mens under anæstesi.
- Excision af Blære biopsi Specimen
- Selvkaterisation blæren anvendelse af en 10-fransk siliconekateter ved at indføre en speculum for at se urinrøret og indsætning af kateteret gennem urinrøret og ind i urinblæren at tømme urinen under semi-sterile betingelser. Fyld blæren med steril saltvandsopløsning til et tryk på 20-25 cm H2O, omkring 100-300 ml, og derefter tomme til 20 cm H2O (cirka. 8 ml / kg legemsvægt).
- med the gris omhyggeligt drejes til en sideleje, udføre en grundlæggende præoperativ sterilisering af huden med anvendelsen af chlorhexidingluconat. Påfør en diatermi plade til skulderen efter fjernelse af pelage med barbering saks.
- Drej grisen forsigtigt ind i en liggende stilling, og tag den abdominale pelage hjælp barbering saks og gøre en grundlæggende præoperativ sterilisering af den abdominale hud med anvendelse af chlorhexidingluconat.
- Indlejre ekstremiteterne med blødt tøj til at minimere risikoen for hyperekstension ledskader i ekstremiteterne. Sterilisere den abdominale hud af dyret med successive anvendelser af chlorhexidingluconat og placere sterilt drapering omkring operationsfeltet.
- Før incision i huden, anvende en intravenøs analgetikum bestående af buprenorphin (45 ug / kg), carprofen (3 mg / kg) og lokal injektion af lidocain i midtlinjen under navlen. Check for smerte reaktion ved at tage fat i ski med pincet. Lav en lavere midtlinie snit gennem fascia og bughinden bruge diatermi til kontrol af blødning. Lokalisere blære, der har et fuldt intraperitoneal position i grisen og kan frit eksponeret ved at mobilisere den gennem det kirurgiske sår.
- Tag fat i blæren med pincet og måle det med en steriliseret målebånd og markere en elliptisk formet biopsiprøve ca. 2 cm på langs og 1 cm i tværretningen, eller mindre, ved hjælp af en steriliseret pen (grisen tolererer en kvart reduktion af blære størrelse meget godt). Udskære markerede område, ved hjælp af en skalpel, og placere blære biopsi modellen i DMEM under sterile forhold.
- Udfør autotransplantation med biotransplant eller lukke blæren ved suturering den med 5-0 Vicryl i to lag. Luk abdominale fascia omhyggeligt med 2-0 eller 3-0 kører Vicryl. Luk underhuden med 3-0 Vicryl, og huden med 3-0 Ethilon. Placer en forbinding på såret og omhyggeligt påtendens til dyret, før den er kommet sig tilstrækkeligt fra anæstesi og ikke udtrykker smerte.
- Flyt dyret til dyret pleje facilitet til at sikre betingelserne for postoperativ pleje. Sæt dyret i et enkelt bur med en varmelampe og deltage til dyret, indtil fuld helbredelse fra anæstesi og så lade dyrene stå i par.
- Tilvejebringe en begivenhedsløs opsving vedrørende smerte og velbefindende og administrere buprenorphin (45 ug / kg) intramuskulært til postoperativ analgesi og trimetoprim (4 mg / kg) og sulfonamid (20 mg / kg) to gange daglig i tre dage og en gang dagligt i fem dage at reducere risikoen for postoperative infektioner.
- Excision af hudbiopsi Specimen
- Forbered kirurgisk bord med alle de nødvendige materialer. Bedøver dyret som tidligere beskrevet i 1.1. Fjern pelage hjælp voks, vaske og sterilisere snittet med betadin og 70% alkohol og derefter placere sterilt drapering, rundtd snittet området.
- Brug en dermatom at høste en 0,3 mm partiel tykkelse hud biopsiprøve. Placer huden modellen i DMEM inden det hakkes, som beskrevet i 2.2. Dæk såret med fede salve og en forbinding.
2. Hakket Vævspræparat
- Blære mucosa
- Vask blæren biopsi to gange i DMEM. Placer blære biopsi på en steriliseret dissekere plade med slimhinden opad og løse en af siderne til pladen ved hjælp dissektion ben.
- Adskil slimhindevævet fra detrusormusklen med fin saks og pincet (figur 3) og holde slimhinden fugtig ved dryp saltvand eller DMEM over det.
- Brug hakningen enheden ved at placere den på slimhinden og derefter sende enheden fra den ene ende til den anden vertikalt og horisontalt, påføring manuelt tryk til opnåelse stykker af hakket væv på 0,8 mm x 0,8 mm (0,8 mm er afstanden mellem rotereng skær).
- Hud
- Hvis huden biopsis er tykke: placere huden på en steril dissekere plade og bruge kirurgiske sakse til at adskille epidermis fra subkutant fedt og dermis. Epidermis er tynd og gennemskinnelige (ca.. 0,3 mm), når den er klar til hakning.
- Brug hakning enheden ved at placere den på overhuden. Med tryk, passerer enheden fra den ene ende til den anden lodret og vandret for at få stykker af hakket væv på 0,8 mm x 0,8 mm.
3. Udarbejdelse af Plastic Komprimerede PCL / Kollagen autografter
- Læg alle ingredienser på is for at holde kulde. Køkkenudstyr nødvendige: Falcon rør, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH og rotte hale collagen type 1.
- Bland 2 ml 10x DMEM (forsigtigt for at undgå bobler) med 12 ml af kollagen type 1. Tilføj 1 N NaOH, dråbe for dråbe, for at bringe pH op til 7,4-8 (farve i mediet skal angive pH ved at skifte fra intens gul til benk). Desuden bruger en pH-strimmel.
- tilsættes forsigtigt 2 ml 1x DMEM og blande opløsningen. Plade ca. 2 ml collagen i hver brønd af stålet rektangulære form (20x30x10 mm) og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 10 minutter.
BEMÆRK: Koncentrationen af kollagen bør være 2,06 mg / ml i 0,6% eddikesyre, og mængden af collagen 1 ml / cm2. - Når collagen synker ned i formen, placere biomaterialet (PCL) oven på kollagengelen (20 mm x 30 mm) og hæld den resterende kollagen (ca. 6 ml) oven på den. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 20 minutter.
- Placer det hakkede væv (1: 6 ekspansion) på toppen af kollagengel. Tryk vandet ud af konstruktionen ved mekanisk kraft under anvendelse af plast kompression som følger (figur 3 og 4).
- Læg et tykt lag af gaze puder på en steril overflade. Placer en stålnet rustfrit (400 um tyk) oven på Gauze puder og derefter et ark nylonnet (110 um tyk). overføre forsigtigt kollagen gel / hakket væv på nylonnet og fjern forsigtigt den rektangulære stål forme.
- Læg et nyt lag af nylon mesh oven på kollagengelen / hakket væv. Placer en anden stålnet oven på nylonnet. Placer i position trykket eller lastning plade vejer mindst 120 g (dvs. en glasplade) i 5 min.
- Fjern vægt, nylon, og stål masker. De autotransplantater er nu klar til at blive syet til grisen blæren i fuld tykkelse hudsår eller dyrket in vitro.
- Til in vitro dyrkning, skære den tynde konstruktion i små stykker passer plader med 12 brønde. Der tilsættes 1 ml keratinocyt medium. Placer pladerne i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2 og kultur op til 6 uger og ændre mediet 3 gange om ugen.
4. Sutur af autografter
- Sutur af autograft medhakket blære slimhinde til grisen blære
- Hold autograft fugtig i DMEM i ventetiden. Sy autograft med fine kørende monofilament suturer. Brug ikke-absorberbar 5-0 Ethilon til forskningsformål.
- Kontroller, om vandtætte ved at fylde blæren med saltvand gennem indlagte urin kateter. Hvis det er muligt, dække autograft med et lag af større omentum. Luk bugvæggen, subkutant væv og hud som beskrevet i 1.2.6. Anvende en sårforbinding.
- Sutur af autograft med hakket Skin Epidermis til en fuld tykkelse sår
- Hold autograft fugtig i DMEM i ventetiden.
- Suturere autograft til bunden af huden i fuld tykkelse sår ved afbrudte suturer i hjørnerne og i midten af autograft at holde autograft nær tilknytning til den underliggende overflade.
- Dække såret med en plast forbinding, der holder såret fugtigt.
- Adstadig dyret med intramuskulær injektion af zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg) og medetomidin (25 ug / kg) forud for opsigelsen og anvende overvågningsudstyr til øret eller halen for at tjekke for puls og blodtryk.
- Aflive dyret ved indgivelse af en dødelig dosis af pentobarbital-natrium (60-140 mg / kg) intravenøst. Tjek puls og blodtryk indtil døden er indtrådt.
6. In vitro kultur
BEMÆRK: For at evaluere histologisk progressionen af hakket væv i PCL / kollagenkonstruktioner in vitro, kollagen / PCL / hakket patches dyrkes i plader med 12 brønde under anvendelse af keratinocyt medium.
- Fremstilling af keratinocyt-medium:
- Sterilisere en 500 ml glasflaske.
- Bland 400 ml DMEM med 100 ml Hams F12 (4: 1-blanding). Supplere med 10% føtalt bovint serum, 5 ug / ml insulin,0,4 ug / ml hydrocortison, 21 ug / ml adenin, 10 -10 mol / l choleratoksin, 2 x 10 -9 mol / L triiodthyronin, 5 ug / ml transferrin, 10 ng / ml epidermal vækstfaktor, 50 U / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin.
- Der steriliseres ved filtrering gennem et 0,2 um filter, og filtratet opsamles i sterile 500 ml flaske.
7. Immunhistokemi
BEMÆRK: immunhistokemi protokol opdeles generelt i følgende trin: (1) fiksering og paraffin indlejring, (2) mikro-sektionering til 5 um skiver, placering på dias, deparaffination og rehydrering, (3) antigen demaskering, farvning og montering . Før du starter de sidste trin i immunhistokemi procedure, forberede vaske buffere og antigenet afsløring løsning (se separat materielle detaljer). Forbered ABC kompleks opløsning i mindst 30 minutter før brug.
- fiksering
INGENTE: Ved afslutningen af den in vitro-dyrkning, fastsætte plastrene som følger:- Forbered Eppendorf-rør med 1 ml 4% buffered formaldehyd (PFA) (OBS:. Formaldehyd er giftigt venligst læse materiale sikkerhedsdatablade før du arbejder med dette kemikalie Brug handsker og sikkerhedsbriller og forberede løsningen inde et stinkskab.).
- Overfør hver af kollagen patches til et Eppendorf-rør indeholdende 4% PFA. Fix natten over ved stuetemperatur.
- Anbring prøverne i 70% ethanol til langtidsopbevaring ved 4 ° C. Prøver er nu klar til dehydrering og indlejring i paraffinblokke før sektionering.
- rehydrering
- Placer dias i en farvning krukke med X-tra SOLV for 15 min. Gentag ved anvendelse af en ny farvning krukke med X-tra SOLV. Objektglassene anbringes i en farvning krukke med absolut ethanol i 10 min. Gentag ved anvendelse af en ny farvning krukke med absolut ethanol. Objektglassene anbringes i en farvning krukke med 95% ethanol i 10 minutter og derefteri en farvnings- krukke med 70% ethanol i 10 min. Endelig vaskes objektglassene to gange i 5 minutter med destilleret vand.
- Antigen afsløring
- Sæt dias i en Coplin krukke med TE-løsning og sætte krukken i et vandbad til at koge i 20 min. Tag glasset ud af badet vandet forsigtigt. Afkøl objektglassene til stuetemperatur i 30 min og vask to gange i 5 minutter i Tris-buffer. Objektglassene anbringes i en farvning krukke med 3% hydrogenperoxid i 10 min. Vaskes objektglassene to gange i 5 minutter i Tris-buffer. Tegn en cirkel omkring prøverne ved anvendelse af en vandafvisende markeringspen.
- Blokere ikke-specifik binding af antistoffet ved hjælp af 100-300 pi blokeringsopløsning. Den blokerende opløsning fjernes og der tilsættes 100-300 pi primære antistof opløst i den anbefalede koncentration i Tris-buffer. Inkuber natten over. Fjern antistofopløsningen og vask sektioner i Tris-buffer to gange i 5 min.
- Inkuber med sekundært antistof i 1 time ved stue Temperature. Vask to gange i 5 minutter i Tris-buffer. Inkuber 30 min ved hjælp af ABC Elite Kit (følg producentens anvisninger). Vask to gange i Tris-buffer.
- Udvikle antistof-reaktion ved anvendelse af vektoren VIP Kit, i overensstemmelse med producentens instruktioner (1-7 minutters inkubation generelt frembringer en klar violet intensitet). Sæt objektglassene i destilleret vand. Kontrastfarve med Mayers hematoxylin i 30 sek.
- Vask i rindende vand i 5 min. Objektglassene anbringes i en farvning krukke med 70% ethanol i 1 min. Gentag ved anvendelse af en ny farvning krukke med 70% ethanol. Objektglassene anbringes i en farvning krukke med 95% ethanol i 1 min. Gentag ved anvendelse af en ny farvning krukke med 95% ethanol.
- Placer dias i en farvning krukke med X-tra SOLV i 5 min. Fjerne, en ad gangen for at holde fugtig. Placer en dråbe montering medium på toppen af hvert objektglas og sætte et dækglas på toppen (gøre det forsigtigt for at undgå luftbobler). Lad objektglassene tørre natten over og se dias under en mikroanvendelsesområde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse viser en metode, der viser, hvordan man producerer et biomateriale til transplantation under anvendelse af plast kompression af collagen og hakket væv.
Blære slimhinde og hud kan høstes og derefter mekanisk hakket til små partikler (figur 3). Ved plastisk kompression er de hakket partikler inkorporeret i kompositstilladset sammensat af en centralt placeret bionedbrydelig polymer, der er mekanisk stærk i ydre lag af en kollagengel (figur 4). Hakket vævspartikler kan adskilles for at tillade en 1: 6 udvidelseshastighed. Ved at trykke ud indholdet af kollagen vand, er en biotransplant til autolog rekonstruktionskirurgi afsluttet.
Biotransplants kan anvendes til autotransplantation til dyret til in vivo undersøgelser eller dyrket i et almindeligt cellekultur miljø for yderligere in vitro studier.
T han sammensatte autograft tillader at gribe og suturering og opretholder kirurgisk håndtering (figur 5). Processen fra væv høst og forberedelse af cellen indeholder autograft for rekonstruktionskirurgi tager ca 20 min og har til formål at blive udført som en enkelt-iscenesat procedure.
I in vitro-undersøgelser celler migrerer, udvide og reorganisere til overfladen af autograft i en enkelt-celle kontinuerligt lag i to uger. Efter fire uger, den kontinuerlige epitel er ca 4 cellelag tykt (figur 6). Immunhistokemi på forskellige tidspunkter afslører, at cellerne prolifererer, migrerer, og omorganisere til en kontinuerlig epitel med en mikroarkitektur typisk for cellefænotype. De samme resultater gælder for autotransplantater med hakket hud epitel som for hakket blære slimhinde.
1 / 53061fig3.jpg "/>
Figur 3:. Hakket vævspræparat og plast kompression Fremstillingen af blære mucosa (A) til hakning (C) og plast kompression (D - F) ved anvendelse hakningen enheden i (B), og formen i (D) til fremstilling af en 420-um-tykke transplantation (H). Bemærk, at kollagen selv er en god ekstracellulær matrix, men er vanskeligt at håndtere mekanisk (G); ved at placere en bionedbrydelig stof som en forstærkende kerne, bliver transplantatet let at forstå (H).
Figur 4: Plast komprimering En animeret tegneserie, der viser processen med plast kompression med hakket partikler..
Figur 5:. Kirurgisk håndtering fuld tykkelse hudsår model i en rotte demonstrerer syet plast-komprimeret biomateriale med hakket hud for autotransplantation markeret som T (transplanteret autograft) sutureres biomateriale uden hakket hud markeret som S (fingeret). I dette tilfælde blev hakket hud epitel transplanteret til en 1: 3 ekspansion sats.
Figur 6: Immunohistokemisk farvning til visualisering progressionen af 3D kultur i collagen-biomateriale hakket hud og blære mucosa (A - D) Hematoxylin / eosin-farvning af (A) nativ hud, (B) nativ blære, (C) hakket. hud efter 5 uger i kultur og (D) hakket blæren efter 6 uger i kultur. Ekspressionen af epitel og proliferationsmarkører med MNF116 (E) og Ki 67 antistoffer (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser en let-at-bruge tilgang til frembringelse blærevæggen pletter med autologt væv til transplantation på operationsbordet. Plastrene er dannet ved kombinationen af en biologisk nedbrydelig polymer strikning i midten og kollagen med og uden hakket væv i de ydre overflader i kombination med plast kompression. Plastic komprimering er en metode, der tidligere er beskrevet af andre forfattere og kan defineres som en hurtig uddrivning af fluid fra kollagengeler 12,13. Hakket væv af blære slimhinde eller hud podes ind i dette stillads og dannelsen af en blære eller hud epitel kunne følges under 6 uger. Immunohistokemiske analyser viste dannelsen af ækvivalenter er karakteristiske for normalt væv. Disse resultater tillader ikke kun en in vitro model til undersøgelse af reepitelialisering og sårheling, men også danner et biomateriale til autolog vævstransplantation. Vigtigst for urologiske formål, autografts kan anvendes til in vivo anvendelser af tissue engineering i rekonstruktiv urologi som manipulerede autologe væv patches uden kravet om in vitro-dyrkning før transplantation 11.
Med hensyn til celle ekspansion og in vitro dyrkningsteknikker, hud epitel og uroepithelium har fælles karakteristika. Motivet at præsentere teknik til plast kompression og hakning for både epitelvæv i denne undersøgelse var, at høst og in vivo studier for huden epitel er nemmere end for blære uroepithelium. Med disse midler kan biomaterialer og hud epitel studeres som et første skridt til at bekræfte biokompatibilitet og fysiske egenskaber, før du udfører mere invasive undersøgelser i de urogenitale organer.
I tidligere in vivo-undersøgelser, ved hjælp af begrebet hakket væv med blære slimhinde til vævsregeneration af ledninger, resultater var, at the små transplanterede partikler krævede nogle mekanisk støtte for at kunne modstå mekaniske traumer og at forblive på plads under den indledende tage af de transplanterede hakket partikler og under helingsprocessen og væv regenerering 6,7.
For at overvinde disse svagheder, undersøgelsen til formål at udvikle en hybrid konstruktion med en biologisk nedbrydelig kerne af en polymer strikket stof og plast-komprimeret collagen 11,14. Kollagenet tilvejebringer en gunstig overflade til cellebinding og vækst og tillader direkte og hurtig integration af det hakkede væv ind i stilladset. Da de mekaniske egenskaber af kollagen, selv efter plast kompression, er stadig svage og ikke vil kunne opretholde sammentrækninger og udvidelser af de naturlige blære bevægelser blev en understøttende kerne stillads for collagen tilsat. For mere komplekse strukturer, kunne transplanteret væv udvides omkring en præfabrikeret støbeform for at frembringe et tredimensionalt epithelialized struktur med en central lumen.
I disse undersøgelser anvendte vi PCL som en stabiliserende polymer og kernen i biograft. PCL er meget udbredt i en række forskellige biomedicinsk udstyr såsom tandfyldninger, absorberbare syntetiske kirurgiske masker og suturmaterialer 14. For at skaffe modning af det regenererede væv, dvs. innervation, glat muskelvæv og ekstracellulær matrix, valgte vi en PCL polymer med en langsom nedbrydningshastighed over flere måneder. Imidlertid kan nedbrydningshastigheden reguleres ved valg af polymer, tykkelse og densitet 11,16.
Collagen blev valgt som en komponent i den sammensatte konstruktion på grund af velkendte biokompatibilitet, sikkerhed og gode helbredende egenskaber. Den kollagen fremmer indvækst af granulationsvæv, re-modellering og modning af ekstra-cellulær matrix 15. Kollagen nedbrydes, neovaskularisering og granulationsvæv støtter transplantationed hakket partikler, reorganisere, migrerer og udvide 5-7,11,16. Desuden, collagen er en vigtig naturlig bestanddel af den ekstracellulære matrix, både i huden og i blæren og er blevet anvendt til oprettelse af stilladser både in vitro og in vivo, herunder sårheling undersøgelser og rekonstruktioner i urogenitale system 17,18.
De kritiske skridt i protokollen er let håndterbar. Først skal holdes under fugtige og gunstige betingelser forud for indsættelse i transplantationen ellers cellevækst vil blive forsinket eller fraværende de biopsi prøver. En anden faldgrube kan indebære at få den rigtige soliditeten af kollagen. Man skal sørge for, at collagen bliver stiv under forberedelsen af autograft ved at undgå bobler inde i kollagen gel. Bubbles undgås ved omhyggelig pipettering og kan brydes små bobler med en nål. Collagen med bobler skal kasseres.
Det er enLSO vigtigt at få den rigtige størrelse af hakket væv; inden det hakkes vævet, sørge for, at kun den tynde blære slimhinde bruges i tilfælde af blære udvidelse eller kun epidermis i tilfælde af hudens ekspansion. Den sidste faldgrube er, når suturering: sørg for at bevæge sig vinkelret på transplantation med nålen for at undgå at adskille de forskellige lag. Kanter af autograft skal også håndteres forsigtigt for ikke at adskille kollagen fra polymeren. Efter suturering arkene vil blive sværere at adskille. Disse er fælles problemer, der kan opstå, når lære teknikken.
En begrænsning ved denne teknik er, at cellerne i hakket partikler afhængige diffusion af næringsstoffer og ilt. Derfor er tykkelsen af autograft skal være mindre end 1 mm, og skal placeres i et godt vaskulariseret site. Dette kan være en ulempe på grund af risikoen for lækage af urin gennem den transplanterede del af blæren. Afhængig af plastic kompression, kan forskellige permeabilitet konstanter opnås. I vores tilfælde den hydrauliske permeabilitet (k) værdien var 0,034 ifølge tidligere undersøgelser 19. I en klinisk indstilling forventer vi, at vi skulle til at holde blæren tom med katetre i ca. 1-2 uger for at give tid til de urothelial celler til at opbygge en flerstrenget kontinuerlig urothelium der gør plasteret un-gennemtrængelig før aktiv brug.
En anden begrænsning er antagelsen om en sund organ for væv høst og ekspansion. I de mere alvorlige tilfælde, når blæren savnes eller er uegnet til ekspansion, for eksempel når ramt af cancer, teknikken muligvis ikke er egnet.
Som for andre manipuleret væv cellekonstruktioner, kan endelige konklusioner om funktionelle og morfologiske resultater kun besvares på lang sigt in vivo studier. Vores næste skridt bliver at analysere vores resultater i de lange dyreforsøg i forhold til viaBility og fysiologiske karakteristika efter transplantationen.
Betydningen af den præsenterede teknik er muligheden for at udvide væv in vivo efter kun en enkelt kirurgisk procedure. Andre teknikker øjeblikket evalueres er alle afhængige af udvidelse af celler in vitro inden transplantation. In vitro procedurer har ulempen af at blive forbundet med høje omkostninger, der kræver avancerede laboratoriepersonale, og være tidskrævende. Det kan tage op til 2 måneder mellem høst af væv eller celler, og et væv-manipuleret autograft; i modsætning til mindre end 1 time, ifølge teknikken beskrevet i denne undersøgelse.
I fremtiden kan hakket væv i komprimerede kollagen teknikker udvides og bruges i andre organer, såsom abdominal væg defekter, diafragma brok, og andre forhold, hvor en defekt ikke let rekonstrueret med eksisterende væv.
in vivo. Fremgangsmåden til fremstilling af en autograft er let at gøre, og kan bruges under sterile betingelser i en almindelig kirurgisk indstilling. Den autograft modstår kirurgisk håndtering og er biologisk nedbrydeligt. Kernen i autograft kan være sammensat af forskellige bionedbrydelige polymerer, afhængigt af præferencer med hensyn nedbrydningshastigheden og andre egenskaber, såsom elasticitet, tykkelse og porøsitet, og i henhold til patientens specifikke behov. I et klinisk miljø, ville patienten undergår væv høst, fremstilling af det sammensatte autograft og autotransplantation som en enkelt-trins procedure. Desuden er alle dele af celleholdige bioconstructs øjeblikket FDA godkendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
