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Bioengineering

संकुचित कोलेजन में कीमा बनाया हुआ ऊतक: एकल मंचन पुनर्निर्माण मरम्मत के लिए एक सेल युक्त Biotransplant

Published: February 24, 2016 doi: 10.3791/53061
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Women's and Children's Health, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Pediatric Surgery, Urology Section, Astrid Lindgren Children's Hospital, Karolinska University Hospital

Summary

ऊतक इंजीनियरिंग अक्सर आदेश ऊतक उत्थान के लिए autografts बनाने के लिए इन विट्रो विस्तार में भी शामिल है। इस अध्ययन में ऊतक विस्तार, उत्थान, और इन विवो में पुनर्निर्माण के लिए एक विधि के लिए शरीर के बाहर की कोशिकाओं और जैविक सामग्री के प्रसंस्करण कम करने के लिए विकसित किया गया था।

Introduction

त्वचा और मूत्रजननांगी पथ को प्रत्यारोपण पर अधिकांश ऊतक इंजीनियरिंग की पढ़ाई स्वस्थ ऊतकों और विशेष रूप से सुसज्जित सेल संवर्धन सुविधाएं 1,2 में सेल विस्तार से ऑटोलॉगस सेल फसल शामिल हैं।

सेल विस्तार के बाद, कोशिकाओं को आमतौर पर बाद में उपयोग के लिए जमा हो जाती है जब रोगी ऑटोग्राफ़्ट प्राप्त करने के लिए तैयार किया जाता है। नाइट्रोजन फ्रीजर -150 डिग्री सेल्सियस या कम से कम तापमान पर लंबी अवधि के भंडारण की अनुमति है। ठंड की प्रक्रिया सावधान और व्यवस्था की कोशिकाओं नहीं खोने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। कोशिका मृत्यु से एक जोखिम विगलन प्रक्रिया है, जो कोशिका झिल्ली का टूटना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं दौरान intracellular पानी के क्रिस्टलीकरण है। सेल ठंड आमतौर पर कोशिकाओं, भ्रूण गोजातीय सीरम, और डाइमिथाइल sulfoxide के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग कर, धीमी और नियंत्रित ठंडा (-1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट) द्वारा किया जाता है। विगलन के बाद, कोशिकाओं ठंड माध्यम हटाने और सेल संस्कृति प्लास्टिक या एक पर संवर्धन द्वारा फिर से संसाधित करने की आवश्यकताप्रत्यारोपण से पहले मरीज को वापस biomaterial।

उपरोक्त सभी चरणों के समय लेने वाली है, श्रमसाध्य हैं, और महंगा 3। इसके अलावा, रोगी प्रत्यारोपण के लिए इरादा कोशिकाओं के सभी इन विट्रो प्रसंस्करण उच्च विनियमित कर रहे हैं और अच्छी तरह से प्रशिक्षित और मान्यता प्राप्त प्रयोगशालाओं कर्मियों और 4 की आवश्यकता है। सब सब में, एक सुरक्षित और विश्वसनीय निर्माण की प्रक्रिया की खरीद करने के लिए, केवल तकनीकी रूप से उन्नत तकनीक केन्द्रों में से एक बहुत छोटी संख्या में स्थापित किया जा सकता है और सामान्य शल्य चिकित्सा विकारों में एक व्यापक उपयोग की संदिग्ध है।

आदेश प्रयोगशाला वातावरण में कोशिका संवर्धन की सीमाओं को पार करने के लिए, विवो में सेल के विस्तार के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक रोपाई की अवधारणा एक बायोरिएक्टर के रूप में शरीर में ही उपयोग करके शुरू की है। इन प्रयोजनों के लिए, autografts रियायत के आकार है कि मैं के अंग के अंतिम पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक है के अनुसार एक 3 डी मोल्ड पर प्रत्यारोपित किया जाएगा5-7 nterest।

मूल रूप से, कीमा बनाया हुआ उपकला रोपाई का विचार 1958 में नम्र द्वारा प्रस्तुत किया गया था, जब वह बताया कि कैसे उपकला एक घाव के किनारों से बढ़ता है। उन्होंने दिखा दिया है कि त्वचा का एक छोटा सा टुकड़ा (चित्रा 1) 8 सीधा दिशाओं में दो बार टुकड़ा काटने से 100% से सेल के विस्तार के लिए अपनी क्षमता को अपना मार्जिन बढ़ाने के लिए और इस तरह होगा। सिद्धांत त्वचा प्रत्यारोपण के लिए 9 meshed आंशिक मोटाई त्वचा grafts के उपयोग के द्वारा समर्थित किया गया है और त्वचा में उपचार मॉडल 10 घाव।

आकृति 1
चित्रा 1:। नम्र सिद्धांत नम्र के सिद्धांत के अनुसार, उपकला एक घाव के किनारों से बढ़ता है। क्षेत्र नख़रेबाज़ प्रौद्योगिकी द्वारा उजागर वृद्धि करके, कीमा बनाया हुआ ऊतक कई स्थानों से घाव epithelializes।

वर्तमान अध्ययन hypo पर आधारित हैथीसिस है कि एक ही सिद्धांत एक फफूंदी के आसपास कीमा बनाया हुआ उपकला रखकर चमड़े के नीचे ऊतक को लागू किया जा सकता है। उपकला कोशिकाओं के क्रम में एक निरंतर neoepithelium कि आंतरिक शरीर से घाव क्षेत्र विदेशी शरीर (मोल्ड) शामिल हैं और अलग करती है के लिए फार्म में कीमा बनाया हुआ प्रत्यारोपण (पुनर्निर्माण) से लामबंद होता है, घाव को कवर क्षेत्रों (विस्थापित) और विभाजन (विस्तार) ( चित्रा 2)।

चित्र 2
चित्रा 2:। नम्र के सिद्धांत के अनुसार इन विवो intracorporal ऊतक के विस्तार के लिए कीमा बनाया हुआ उपकला के साथ एक 3 डी मोल्ड के कार्टून चमड़े के नीचे ऊतक को एक सांचे पर रखा और फिर प्रतिरोपित कीमा बनाया हुआ ऊतक का उपयोग करके, परिकल्पना है कि उपकला कोशिकाओं से विस्थापित है कीमा बनाया हुआ ऊतक के किनारों, पुनर्निर्माण, और इतने विस्तार के रूप में एक सतत neoepithelium कि घाव क्षेत्र शामिल हैं और भीतर के शरीर से विदेशी शरीर (मोल्ड) को अलग रूप में।

हालांकि पिछले vivo अध्ययन में आशाजनक परिणाम दिखाने के लिए, और अधिक सुधार autografts मजबूत करके प्राप्त किया जा सकता है, ताकि पुनर्जीवित उपकला यांत्रिक आघात बेहतर 7 सामना कर सकता है। एक 3 डी ढंग से मोल्ड करने के लिए पोषक तत्वों और अपशिष्ट उत्पादों के आसान प्रसार, संभावना और शल्य चिकित्सा से निपटने की सुगमता: इन उद्देश्यों के लिए है, एक सफल biomaterial के लिए महत्वपूर्ण और चीज की तरह के रूप में पहचान की गई। निष्कर्ष बनाया गया था कि इन जरूरतों कीमा बनाया हुआ ऊतक के लिए एक समग्र biomaterial जोड़कर मुलाकात हो सकती है।

वर्तमान में कीमा बनाया हुआ ऊतक से बना एक पाड़ विकसित करने के उद्देश्य अध्ययन प्लास्टिक संकुचित कोलेजन एक biodegradable कपड़े की एक मजबूत कोर युक्त। इन तरीकों से, व्यवहार्य कोशिकाओं कीमा बनाया हुआ ऊतक कणों से विस्थापित और मूल उपकला (त्वचा या urothelium) की रूपात्मक सुविधाओं विशेषता के साथ पैदा कर सकता है। प्लास्टिक संपीड़न का उपयोग, पाड़ को कम थाके बारे में 420 माइक्रोन कीमा कणों के रूप में करने के लिए 1 सेमी से आकार में डी ऊपरी परत कोलेजन में रखा गया था। कोर कपड़े किसी भी बहुलक हो लेकिन कोलेजन को कवर परतों 11 के साथ लगाना करने के क्रम में एक हाइड्रोफिलिक सतह के साथ संशोधित किए जाने की जरूरत सकता है।

विधि पाली (ε-caprolactone) मिलकर (पीसीएल) दो प्लास्टिक संकुचित कोलेजन जैल के भीतर एक बुना हुआ जाल को शामिल कीमा बनाया हुआ मूत्राशय म्यूकोसा या सूअरों से कीमा बनाया हुआ त्वचा संवर्धन के लिए एक पाड़ के रूप में प्रयोग द्वारा एक बढ़ाया पाड़ अखंडता प्रदान की है। निर्माण के लिए इन विट्रो में 6 सप्ताह के लिए सेल संस्कृति की स्थिति में बनाए रखा गया था, एक स्तरीकृत, बहुपरती urothelium या एक अच्छी तरह से समेकित संकर निर्माण के शीर्ष पर स्क्वैमस त्वचा उपकला के सफल गठन का प्रदर्शन है। निर्माण को संभालने के लिए आसान था और मूत्राशय वृद्धि उद्देश्यों या त्वचा के दोषों के कवर के लिए जगह में sutured किया जा सकता है। ऊतक पाड़ के सभी भागों एफडीए को मंजूरी दे दी है और तकनीकऊतक कटाई, नख़रेबाज़, प्लास्टिक संपीड़न, और एक एकल मंचन हस्तक्षेप के रूप में रोगी को वापस रोपाई द्वारा एकल चरण प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रक्रिया किसी भी सामान्य शल्य चिकित्सा इकाई में ऊतक के विस्तार और बाँझ शर्तों के तहत पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल पर पशु स्टॉकहोम काउंटी समिति द्वारा पूर्व-अनुमोदित किया गया और सभी प्रक्रियाओं पशु का उपयोग, साथ ही प्रासंगिक संघीय विधियों के लिए नियमों को पुष्टि।

1. पशु प्रक्रियाओं

  1. सर्जरी के लिए पशु की तैयारी
    1. सभी सामग्री और उपकरणों बाँझ शर्तों के तहत संचालन के लिए आवश्यक के साथ शल्य तालिका तैयार करें। संक्रमण का खतरा कम करने और अस्तित्व सर्जरी में शर्तों का अनुकूलन करने के लिए बाँझ शर्तों के तहत विशेष रूप से सर्जरी प्रदर्शन।
    2. सर्जरी से पहले 12 घंटे के लिए पशुओं के लिए तेजी से और अपने वजन को मापने। एक इंट्रामस्क्युलर premedication के लिए azaperone के इंजेक्शन (2 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन। tiletamine hypochloride (2.5 मिलीग्राम / किग्रा), zolazepam hypochloride (2.5 मिलीग्राम / किग्रा), medetomidine (25 माइक्रोग्राम / किग्रा) और atropine (25 माइक्रोग्राम / किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize।
    3. phenobarbiturate इंजेक्ट (15 मिलीग्राम / किग्रा) endotrache करने से पहलेअल इंटुबैषेण और 0.8% -2% isoflurane के साथ सामान्य संज्ञाहरण जारी है। एक कान में एक परिधीय नस कैथेटर डालने और ग्लूकोज (25 मिलीग्राम / एमएल) दिखे नसों प्रक्रिया के दौरान बनाए रखने के लिए जानवर की अच्छी तरह से किया जा रहा।
    4. तापमान, रक्तचाप, संतृप्ति, और परिधीय नाड़ी की जाँच करने के कान या पूंछ पर उपकरणों की निगरानी रखें। कान या खुरों के दर्द उत्तेजना से नियंत्रण संज्ञाहरण। आंखों को मरहम लागू जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए।
  2. मूत्राशय बायोप्सी नमूने के छांटना
    1. मूत्रमार्ग को देखने और मूत्रमार्ग के माध्यम से कैथेटर डालने के लिए एक वीक्षक को शुरू करने से और मूत्राशय में एक 10-फ्रेंच सिलिकॉन कैथेटर का उपयोग कर अर्द्ध बाँझ शर्तों के तहत मूत्र मूत्राशय खाली करने के लिए कैथीटेराइज़। 20-25 सेमी एच 2 ओ, 100-300 के बारे में मिलीलीटर की एक दबाव के बाँझ खारा समाधान के साथ मूत्राशय भरें, और उसके बाद खाली करने के लिए 20 सेमी एच 2 ओ (लगभग। 8 मिलीग्राम / शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम)।
    2. वें के साथई सुअर ध्यान से एक पक्ष की स्थिति में बदल गया, chlorhexidine gluconate के आवेदन के साथ त्वचा की एक बुनियादी preoperative नसबंदी प्रदर्शन करते हैं। हजामत बनाने का काम कैंची के साथ ऊन को हटाने के बाद कंधे के लिए एक Diathermy प्लेट लागू करें।
    3. ध्यान से एक लापरवाह स्थिति में सुअर की बारी है और पेट की ऊन शेविंग कैंची का उपयोग कर हटाने और chlorhexidine gluconate के आवेदन के साथ पेट की त्वचा की एक बुनियादी preoperative नसबंदी करना।
      1. मुलायम कपड़ों के साथ पांव एम्बेड पांव में जोड़ों के लिए hyperextension नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए। chlorhexidine gluconate के लगातार अनुप्रयोगों के साथ पशु के पेट की त्वचा जीवाणुरहित और शल्य चिकित्सा क्षेत्र के आसपास बाँझ draping जगह है।
    4. त्वचा चीरा करने से पहले, एक अंतःशिरा नाभि के नीचे midline में buprenorphine (45 माइक्रोग्राम / किग्रा), Carprofen (3 मिलीग्राम / किग्रा) और lidocaine के स्थानीय इंजेक्शन से मिलकर एनाल्जेसिक लागू होते हैं। एस के लोभी द्वारा दर्द प्रतिक्रिया के लिए जाँच करेंसंदंश के साथ में। प्रावरणी के माध्यम से एक कम midline चीरा और खून बह रहा है के नियंत्रण के लिए Diathermy का उपयोग कर पेरिटोनियम। मूत्राशय सुअर में एक पूरी तरह से intraperitoneal स्थिति है और स्वतंत्र रूप से शल्य घाव के माध्यम से यह जुटाकर अवगत कराया जा सकता है कि स्थानीय बनाना।
    5. संदंश के साथ मूत्राशय की पकड़ ले लो और एक निष्फल टेप को मापने के साथ इसे मापने के लिए और मार्क एक अण्डाकार आकार बायोप्सी नमूना longitudinally लगभग 2 सेमी और 1 सेमी transversally, या छोटे, एक निष्फल पेन का उपयोग (सुअर मूत्राशय के आकार के एक चौथाई कमी बर्दाश्त बहुत अच्छा)। , चिह्नित क्षेत्र आबकारी एक छुरी का उपयोग कर, और बाँझ शर्तों के तहत DMEM में मूत्राशय बायोप्सी नमूना जगह है।
    6. biotransplant साथ स्वप्रतिरोपण प्रदर्शन या दो परतों में 5-0 Vicryl के साथ यह suturing से मूत्राशय को बंद करें। 2-0 या 3-0 से चल Vicryl के साथ सावधानी से पेट प्रावरणी बंद करें। 3-0 Vicryl साथ subcutis और 3-0 Ethilon के साथ त्वचा को बंद करें। घाव पर और ध्यान पर एक ड्रेसिंग रखेंपशु के लिए करते हैं, जब तक यह संज्ञाहरण से पर्याप्त रूप से ठीक हो गया है और दर्द को व्यक्त नहीं करता।
    7. पश्चात की देखभाल के लिए शर्तों को सुरक्षित करने के लिए जानवरों की देखभाल की सुविधा के लिए पशु ले जाएँ। संज्ञाहरण से पूरी वसूली तक एक हीटिंग दीपक के साथ एक ही पिंजरे में पशु रखो और जानवर के लिए भाग लेने के लिए और फिर जानवरों के जोड़े में ठप हो जाने दो।
    8. दर्द और भलाई के संबंध में एक ऊंचा नीचा वसूली प्रदान करें और पांच दिनों के लिए तीन दिनों के लिए दैनिक buprenorphine (45 माइक्रोग्राम / किग्रा) प्रशासन पेशी पश्चात analgesia और trimetoprim (4 मिलीग्राम / किग्रा) और सल्फोनामाइड (20 मिलीग्राम / किग्रा) के लिए दो बार और एक बार दैनिक पश्चात संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए।
  3. त्वचा बायोप्सी नमूने के छांटना
    1. सभी आवश्यक सामग्री के साथ शल्य तालिका तैयार करें। पशु पहले से 1.1 में वर्णित के रूप में anesthetize। मोम का उपयोग ऊन निकालें, धोने और betadine और 70% शराब के साथ चीरा क्षेत्र बाँझ और फिर बाँझ draping aroun जगहचीरा डी एरिया।
    2. एक 0.3 मिमी मोटाई आंशिक त्वचा बायोप्सी नमूना फसल के लिए एक dermatome का प्रयोग करें। , नख़रेबाज़ पहले DMEM में त्वचा नमूना की जगह 2.2 में वर्णित है। फैटी मरहम और एक ड्रेसिंग के साथ घाव क्षेत्र को कवर किया।

2. कीमा बनाया हुआ ऊतक तैयारी

  1. मूत्राशय म्यूकोसा
    1. मूत्राशय बायोप्सी DMEM में दो बार धोएं। मूत्राशय बायोप्सी नमूना म्यूकोसा ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ एक निष्फल विदारक प्लेट पर रखें और विच्छेदन पिन का उपयोग करने के लिए प्लेट पक्षों में से एक तय कर लो।
    2. अलग ठीक कैंची और संदंश (चित्रा 3) का उपयोग निस्सारिका पेशी से श्लैष्मिक ऊतक और म्यूकोसा इस पर खारा या DMEM टपकता द्वारा नम रखें।
    3. म्यूकोसा पर रखकर नख़रेबाज़ डिवाइस का उपयोग करें और फिर अन्य को एक छोर से डिवाइस पारित खड़ी है और क्षैतिज, 0.8 मिमी x 0.8 मिमी कीमा बनाया हुआ ऊतक के टुकड़े को प्राप्त करने के लिए मैनुअल लागू करने का दबाव (0.8 मिमी rotatin बीच की दूरी हैजी काटने ब्लेड)।
  2. त्वचा
    1. त्वचा biopsis अगर मोटी हैं: एक बाँझ विदारक थाली पर डाल दिया है और त्वचा शल्य कैंची का उपयोग वसा और डर्मिस से एपिडर्मिस अलग करने के लिए। एपिडर्मिस पतली और पारदर्शी है (लगभग। 0.3 मिमी) जब यह नख़रेबाज़ के लिए तैयार है।
    2. एपिडर्मिस पर रखकर नख़रेबाज़ डिवाइस का उपयोग करें। दबाव के साथ, 0.8 मिमी x 0.8 मिमी कीमा बनाया हुआ ऊतक के टुकड़े को प्राप्त करने के लिए खड़ी अन्य को एक छोर से डिवाइस के पास है और क्षैतिज।

3. प्लास्टिक संकुचित PCL / कोलेजन autografts की तैयारी

  1. बर्फ पर सभी सामग्री रखें ठंडा रखने के लिए। बर्तन की जरूरत: फाल्कन ट्यूब, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 एन NaOH और चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार 1।
    1. कोलेजन प्रकार के 12 मिलीलीटर के साथ 10x DMEM (ध्यान से बुलबुले से बचने के लिए) के 2 मिलीलीटर मिक्स 1., 1 एन NaOH, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ें 7.4-8 (मध्यम रंग में पीएच को ऊपर लाने के लिए तीव्र से बदलकर पीएच संकेत चाहिए पिन करने के लिए पीलेकश्मीर)। इसके अलावा, एक पीएच पट्टी का उपयोग करें।
    2. ध्यान से 1x DMEM के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और समाधान का मिश्रण। प्लेट इस्पात आयताकार मोल्ड (20x30x10 मिमी) के प्रत्येक कुएं में कोलेजन की लगभग 2 मिलीग्राम और 37 पर सेते 10 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में सी °।
      नोट: कोलेजन की एकाग्रता 2.06 मिलीग्राम / 0.6% एसिटिक एसिड में मिलीग्राम और कोलेजन 1 मिलीग्राम / 2 सेमी की राशि होना चाहिए।
    3. एक बार जब कोलेजन मोल्ड में सेट, कोलेजन जेल (20 मिमी x 30 मिमी) के शीर्ष पर biomaterial (पीसीएल) जगह है और यह की चोटी पर शेष कोलेजन (लगभग 6 एमएल) डालना। 20 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. कोलेजन जेल के शीर्ष पर: कीमा बनाया हुआ ऊतक (6 विस्तार के लिए 1) रखें। प्लास्टिक संपीड़न का उपयोग इस प्रकार के रूप में यांत्रिक बल द्वारा निर्माण के बाहर पानी प्रेस (आंकड़े 3 और 4)।
    5. धुंध पैड की एक मोटी परत एक बाँझ सतह पर रखें। एक स्टेनलेस स्टील के जाल (400 माइक्रोन मोटी) gauz के शीर्ष पर रखेंई पैड और फिर नायलॉन जाल (110 माइक्रोन मोटी) के एक पत्रक। ध्यान से नायलॉन जाल पर कोलेजन जेल / कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण और ध्यान से आयताकार स्टील मोल्ड को हटा दें।
    6. नायलॉन जाल की एक नई परत कोलेजन जेल / कीमा बनाया हुआ ऊतक के शीर्ष पर रखें। नायलॉन जाल के शीर्ष पर एक दूसरे स्टील जाल रखें। स्थिति में दबाव या लोडिंग प्लेट 5 मिनट के लिए 120 ग्राम (यानी, एक गिलास प्लेट) की एक न्यूनतम वजन रखें।
    7. वजन, नायलॉन, और इस्पात meshes निकालें। Autografts अब पूर्ण मोटाई त्वचा के घावों में सुअर मूत्राशय के लिए sutured या इन विट्रो में संवर्धित किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।
    8. इन विट्रो संवर्धन के लिए, फिटिंग 12 अच्छी तरह प्लेटें छोटे टुकड़ों में पतली निर्माण काटा। keratinocyte माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 6 सप्ताह तक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस और प्रति सप्ताह मध्यम बदल 3 बार।

4. autografts के सिवनी

  1. साथ ऑटोग्राफ़्ट के सिवनीसुअर मूत्राशय के लिए कीमा बनाया हुआ मूत्राशय म्यूकोसा
    1. समय के इंतजार के दौरान ऑटोग्राफ़्ट DMEM में नम रखें। ठीक चल रहा monofilament टांके के साथ ऑटोग्राफ़्ट सिवनी। अनुसंधान प्रयोजनों के लिए गैर absorbable 5-0 Ethilon का प्रयोग करें।
    2. यदि निबाह मूत्र कैथेटर के माध्यम से नमक के साथ मूत्राशय भरने से निर्विवाद जाँच करें। यदि संभव हो तो, अधिक से अधिक omentum की एक परत के साथ कवर ऑटोग्राफ़्ट। 1.2.6 में वर्णित के रूप में पेट की दीवार, चमड़े के नीचे ऊतक, त्वचा और बंद करें। एक घाव ड्रेसिंग लागू करें।
  2. एक पूर्ण मोटाई घाव को कीमा बनाया हुआ त्वचा एपिडर्मिस साथ ऑटोग्राफ़्ट के सिवनी
    1. समय के इंतजार के दौरान ऑटोग्राफ़्ट DMEM में नम रखें।
    2. त्वचा पूर्ण मोटाई कोनों में बाधित टांके से और ऑटोग्राफ़्ट के बीच में घाव ऑटोग्राफ़्ट बारीकी से अंतर्निहित सतह से जुड़ी रखने के लिए की तह तक ऑटोग्राफ़्ट सिवनी।
    3. एक प्लास्टिक ड्रेसिंग कि घाव नम रहती है साथ घाव को कवर किया।

  1. शांत इंट्रामस्क्युलर zolazepam hypochloride के इंजेक्शन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) और medetomidine (25 माइक्रोग्राम / किग्रा) समाप्ति से पहले और कान या पूंछ के लिए निगरानी उपकरणों के साथ पशु लागू नाड़ी और रक्तचाप के लिए जाँच करें।
  2. pentobarbital सोडियम (60-140 मिलीग्राम / किग्रा) नसों की एक घातक खुराक प्रशासन द्वारा पशु euthanize। नाड़ी और ब्लड प्रेशर की जांच जब तक मौत हो गई है।

6. इन विट्रो संस्कृति


नोट: histologically इन विट्रो में पीसीएल / कोलेजन निर्माणों में कीमा बनाया हुआ ऊतक की प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए, कोलेजन / PCL / कीमा बनाया हुआ पैच 12 अच्छी तरह प्लेटें keratinocyte माध्यम का उपयोग कर में सुसंस्कृत हैं।

  1. keratinocyte माध्यम की तैयारी:
    1. एक 500 मिलीलीटर कांच की बोतल जीवाणुरहित।
    2. (: 1 मिश्रण 4) हाम F12 के 100 मिलीलीटर के साथ DMEM के 400 मिलीलीटर मिक्स। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन,0.4 माइक्रोग्राम / एमएल hydrocortisone, 21 माइक्रोग्राम / एमएल adenine, 10 -10 मोल / एल हैजा विष, 2 एक्स 10 -9 मोल / एल ट्राईआयोडोथायरोनिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल transferrin, 10 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और 50 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
    3. 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से filtrating द्वारा जीवाणुरहित और बाँझ 500 मिलीलीटर की बोतल में छानना इकट्ठा।

7. Immunohistochemistry

नोट: immunohistochemistry प्रोटोकॉल आम तौर पर निम्नलिखित चरणों में बांटा गया है: (1) निर्धारण और आयल एम्बेड, (2) माइक्रो सेक्शनिंग 5 माइक्रोन स्लाइस, स्लाइड, deparaffination, और पुनर्जलीकरण पर नियुक्ति के लिए, (3) प्रतिजन अनमास्किंग, धुंधला हो जाना और बढ़ते । immunohistochemistry प्रक्रिया में अंतिम कदम शुरू करने से पहले, वाशिंग buffers और प्रतिजन अनमास्किंग समाधान (अलग सामग्री विवरण देखें) तैयार करते हैं। उपयोग करने से पहले एबीसी जटिल समाधान कम से कम 30 मिनट तैयार करें।

  1. फिक्सेशन
    नहींते: इन विट्रो संस्कृति के अंत में, पैच के रूप में निम्नानुसार को ठीक:
    1. 4% formaldehyde बफर (पीएफए) के 1 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के साथ तैयार (सावधानी:। Formaldehyde विषैला होता है कृपया इस रसायन के साथ काम करने से पहले सामग्री सुरक्षा डाटा शीट पढ़ा दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं और एक धूआं हुड के अंदर समाधान तैयार है।)।
    2. 4% पीएफए ​​युक्त एक Eppendorf ट्यूब के लिए कोलेजन पैच में से प्रत्येक के स्थानांतरण। कमरे के तापमान पर रात भर में ठीक करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए 70% इथेनॉल में जगह नमूने हैं। नमूने अब सेक्शनिंग पहले पैराफिन ब्लॉकों में embedding निर्जलीकरण के लिए तैयार है और कर रहे हैं।
  2. पुनर्जलीकरण
    1. 15 मिनट के लिए एक्स-टीआरए Solv के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड रखें। एक्स टीआरए Solv के साथ एक नया धुंधला जार का उपयोग करके दोहराएँ। 10 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड रखें। पूर्ण इथेनॉल के साथ एक नया धुंधला जार का उपयोग करके दोहराएँ। जगह 10 मिनट के लिए और उसके बाद 95% इथेनॉल के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड्स10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ एक धुंधला जार में। अंत में आसुत जल के साथ 5 मिनट के लिए दो बार स्लाइड्स धो लें।
  3. एंटीजन अनमास्किंग
    1. ते-समाधान के साथ एक Coplin जार में स्लाइड्स रखो और 20 मिनट के लिए फोड़ा करने के लिए एक पानी के स्नान में जार में डाल दिया। पानी से स्नान ध्यान से बाहर जार ले लो। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को स्लाइड कूल और Tris बफर में 5 मिनट के लिए दो बार धोने। 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड रखें। स्लाइड Tris बफर में 5 मिनट के लिए दो बार धोएं। एक पानी से बचाने वाली क्रीम कलम अंकन का उपयोग कर नमूने के चारों ओर एक चक्र ड्रा।
    2. एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान के 100-300 μl का उपयोग करने का अविशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक। अवरुद्ध समाधान निकालें और Tris बफर में सिफारिश की एकाग्रता में भंग प्राथमिक एंटीबॉडी के 100-300 μl जोड़ें। रातोंरात सेते हैं। एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए दो बार Tris बफर में वर्गों धो लें।
    3. कमरे temperat पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेतेUre। Tris बफर में 5 मिनट के लिए दो बार धोएं। एबीसी संभ्रांत किट (निर्माता के निर्देशों का पालन करें) का उपयोग करते हुए 30 मिनट सेते हैं। Tris बफर में दो बार धोएं।
    4. , वेक्टर वीआईपी किट का उपयोग निर्माता के निर्देशों (1-7 मिनट ऊष्मायन आम तौर पर एक स्पष्ट बैंगनी तीव्रता का उत्पादन) का पालन करके एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का विकास करना। आसुत जल में स्लाइड्स रखो। 30 सेकंड के लिए मेयर के साथ hematoxylin Counterstain।
    5. 5 मिनट के लिए पानी चलाने में धो लें। 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड रखें। 70% इथेनॉल के साथ एक नया धुंधला जार का उपयोग करके दोहराएँ। 1 मिनट के लिए 95% इथेनॉल के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड रखें। 95% इथेनॉल के साथ एक नया धुंधला जार का उपयोग करके दोहराएँ।
    6. एक्स टीआरए Solv के साथ एक धुंधला जार में स्लाइड 5 मिनट के लिए रखें। एक समय में निकालें, एक नम रखने के लिए। प्रत्येक स्लाइड के शीर्ष पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद प्लेस और शीर्ष पर एक कवर ग्लास (हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधानी से करना) डाल दिया। स्लाइड रात भर सूखी और एक माइक्रो तहत स्लाइड देखनेगुंजाइश।

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Representative Results

इस अध्ययन से पता चलता है कि कैसे एक विधि कोलेजन और कीमा बनाया हुआ ऊतक की प्लास्टिक संपीड़न का उपयोग प्रत्यारोपण के लिए एक biomaterial उत्पादन करने के लिए प्रस्तुत करता है।

मूत्राशय म्यूकोसा और त्वचा काटा जा सकता है और फिर यंत्रवत् छोटे कणों (चित्रा 3) में कीमा बनाया हुआ। प्लास्टिक संपीड़न द्वारा, कीमा बनाया हुआ कणों समग्र एक केन्द्र रखा biodegradable बहुलक है कि एक कोलेजन जेल (चित्रा 4) की बाहरी परत के भीतर यंत्रवत् मजबूत है से बना पाड़ के भीतर शामिल कर रहे हैं। 6 विस्तार की दर: कीमा बनाया हुआ ऊतक कणों एक 1 अनुमति देने के लिए अलग किया जा सकता है। कोलेजन के पानी की सामग्री बाहर दबाकर, ऑटोलॉगस पुनर्निर्माण सर्जरी के लिए एक biotransplant पूरा हो गया है।

Biotransplants आगे इन विट्रो अध्ययन के लिए एक साधारण सेल संस्कृति के माहौल में इन विवो अनुसंधान अध्ययन या सुसंस्कृत के लिए जानवर को स्वप्रतिरोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

टी वह समग्र ऑटोग्राफ़्ट लोभी और suturing की अनुमति देता है और शल्य चिकित्सा से निपटने (चित्रा 5) बनाए। ऊतक फसल और पुनर्निर्माण सर्जरी के लिए सेल युक्त ऑटोग्राफ़्ट की तैयारी से प्रक्रिया में लगभग 20 मिनट लगते हैं और एक एकल मंचन प्रक्रिया के रूप में प्रदर्शन किया जा करने के उद्देश्य से किया जाता है।

इन विट्रो अध्ययन कोशिकाओं की ओर पलायन में, विस्तार करने और दो ​​सप्ताह में एक एकल कोशिका सतत परत में ऑटोग्राफ़्ट की सतह के पुनर्निर्माण। चार सप्ताह के बाद, निरंतर उपकला लगभग 4 सेल परतों मोटी है (चित्रा 6)। समय में विभिन्न बिंदुओं पर Immunohistochemistry पता चलता है कि कोशिकाओं, विस्थापित पैदा करना, और एक माइक्रोआर्किटेक्चर सेल phenotype के लिए ठेठ के साथ एक सतत उपकला में पुनर्निर्माण। उसी का परिणाम है कीमा बनाया हुआ मूत्राशय म्यूकोसा के लिए के रूप में कीमा बनाया हुआ त्वचा उपकला साथ autografts के लिए लागू होते हैं।

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चित्रा 3:। कीमा बनाया हुआ ऊतक तैयारी और प्लास्टिक संपीड़न नख़रेबाज़ (सी) और प्लास्टिक संपीड़न के लिए मूत्राशय म्यूकोसा (ए) की तैयारी (डी - एफ), (बी) में नख़रेबाज़ डिवाइस का उपयोग और (घ) मोल्ड एक निर्माण करने के लिए 420 माइक्रोन मोटी प्रत्यारोपण (एच)। ध्यान दें कि कोलेजन अपने आप में एक अच्छा बाह्य मैट्रिक्स है, लेकिन यंत्रवत् संभालना बहुत मुश्किल है (G); एक मजबूत कोर के रूप में एक biodegradable कपड़े रखकर, प्रत्यारोपण काबू करने के लिए (एच) के लिए आसान हो जाता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: प्लास्टिक संपीड़न कीमा कणों के साथ प्लास्टिक संपीड़न की प्रक्रिया दिखा एक एनिमेटेड कार्टून।।

चित्रा 5
चित्रा 5:। सर्जिकल हैंडलिंग पूर्ण मोटाई त्वचा स्वप्रतिरोपण टी (प्रत्यारोपित ऑटोग्राफ़्ट) एस (दिखावा) के रूप में चिह्नित कीमा बनाया हुआ त्वचा के बिना sutured biomaterial के रूप में चिह्नित के लिए कीमा बनाया हुआ त्वचा के साथ एक चूहे प्रदर्शन sutured प्लास्टिक संकुचित biomaterial में घाव मॉडल। 3 विस्तार की दर: इस मामले में, कीमा बनाया हुआ त्वचा उपकला एक 1 के लिए प्रत्यारोपित किया गया था।

चित्रा 6
चित्रा 6: Immunohistochemical धुंधला कोलेजन biomaterial कीमा त्वचा और मूत्राशय म्यूकोसा में 3 डी संस्कृति की प्रगति कल्पना करने के लिए (एक - डी) (ए) के मूल निवासी त्वचा की Hematoxylin / eosin धुंधला हो जाना, (बी) के मूल निवासी मूत्राशय, (सी) कीमा बनाया हुआ। संस्कृति में 6 सप्ताह के बाद संस्कृति और (डी) कीमा बनाया हुआ मूत्राशय में 5 हफ्तों के बाद त्वचा। MNF116 (ई) और की 67 एंटीबॉडी के साथ उपकला और प्रसार मार्कर की अभिव्यक्ति (

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Discussion

इस अध्ययन के लिए एक आसान करने के लिए उपयोग दृष्टिकोण शल्य चिकित्सा की मेज पर ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए ऊतक के साथ मूत्राशय दीवार पैच उत्पादन करने के लिए प्रस्तुत करता है। पैच मध्य और के साथ और प्लास्टिक संपीड़न के साथ संयोजन में बाहरी सतहों में कीमा बनाया हुआ ऊतक के बिना कोलेजन में एक biodegradable बहुलक बुनाई के संयोजन से बनते हैं। प्लास्टिक संपीड़न एक विधि पहले से अन्य लेखकों द्वारा वर्णित है और कोलेजन जैल 12,13 से तरल पदार्थ की एक तेजी से निष्कासन के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। मूत्राशय म्यूकोसा या त्वचा का कीमा बनाया हुआ ऊतक इस पाड़ में वरीयता दी गई है और एक मूत्राशय या त्वचा उपकला के गठन के 6 सप्ताह के दौरान पालन किया जा सकता है। Immunohistochemical विश्लेषण सामान्य ऊतकों की विशेषता समकक्ष के गठन दिखाया। इन परिणामों से न केवल फिर से epithelialization और घाव भरने के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल की अनुमति है, लेकिन यह भी ऑटोलॉगस ऊतक प्रत्यारोपण के लिए एक biomaterial रूपों। मूत्रविज्ञान उद्देश्यों के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात, autografts प्रत्यारोपण के 11 से पहले इन विट्रो संस्कृति के लिए आवश्यकता के बिना इंजीनियर ऑटोलॉगस ऊतक पैच के रूप में पुनर्निर्माण मूत्रविज्ञान में ऊतक इंजीनियरिंग के vivo अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इन विट्रो संवर्धन तकनीक, त्वचा उपकला और uroepithelium शेयर आम लक्षण सेल विस्तार करने के लिए और में संबंध में। मकसद प्लास्टिक संपीड़न के लिए तकनीक पेश करने के लिए और इस अध्ययन में दोनों उपकला ऊतकों के लिए क़ीमा कि फसल कटाई और vivo अध्ययन में त्वचा उपकला के लिए मूत्राशय uroepithelium के लिए की तुलना में आसान हो गया है। इन तरीकों से, biomaterials और त्वचा उपकला मूत्रजननांगी अंगों में अधिक आक्रामक पढ़ाई के प्रदर्शन से पहले biocompatibility और भौतिक गुणों की पुष्टि के लिए पहले कदम के रूप में अध्ययन किया जा सकता है।

Vivo अध्ययन में पिछले है, नाली के ऊतक के उत्थान के लिए मूत्राशय म्यूकोसा के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक की अवधारणा का उपयोग, निष्कर्ष थे कि वेंई छोटे कणों प्रत्यारोपित आदेश यांत्रिक आघात झेलने के लिए और प्रतिरोपित कीमा कणों की प्रारंभिक ले के दौरान और उपचार प्रक्रिया और ऊतक उत्थान 6.7 के दौरान जगह में रहने के लिए कुछ यांत्रिक समर्थन की आवश्यकता है।

आदेश में इन कमजोरियों को दूर करने के लिए, अध्ययन एक संकर एक बहुलक बुना हुआ कपड़ा और प्लास्टिक संकुचित कोलेजन 11,14 के एक biodegradable कोर के साथ निर्माण को विकसित करने के उद्देश्य से। कोलेजन सेल लगाव और विकास के लिए एक अनुकूल सतह प्रदान करता है और पाड़ में कीमा बनाया हुआ ऊतक के प्रत्यक्ष और तेजी से एकीकरण की अनुमति देता है। हालांकि, कोलेजन के यांत्रिक गुणों के बाद से, प्लास्टिक संपीड़न के बाद भी, अभी भी कमजोर हैं और संकुचन और प्राकृतिक मूत्राशय आंदोलनों के एक्सटेंशन को बनाए रखने नहीं होगा, कोलेजन के लिए एक सहायक की कोर पाड़ जोड़ा गया है। और अधिक जटिल संरचनाओं के लिए, प्रत्यारोपित ऊतक एक तीन आयामी ईपी निर्माण करने के लिए एक पूर्वनिर्मित मोल्ड के आसपास का विस्तार किया जा सकता हैएक केंद्रीय लुमेन के साथ ithelialized संरचना।

इन अध्ययनों में हम एक स्थिर बहुलक और biograft के प्रमुख के रूप पीसीएल इस्तेमाल किया। पीसीएल व्यापक रूप से दंत fillings, absorbable सिंथेटिक शल्य meshes और सिवनी सामग्री के रूप में 14 जैव चिकित्सा उपकरणों की एक किस्म में प्रयोग किया जाता है। आदेश पुनर्जीवित ऊतक की परिपक्वता, यानी तंत्रिका वितरण, चिकनी मांसपेशियों के ऊतकों और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स की खरीद करने के लिए हम कई महीनों में एक धीमी गति से गिरावट की दर के साथ एक पीसीएल बहुलक चुना है। हालांकि, गिरावट की दर बहुलक, मोटाई और घनत्व 11,16 के चुनाव के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।

कोलेजन समग्र निर्माण प्रसिद्ध biocompatibility, सुरक्षा और अच्छी चिकित्सा विशेषताओं के कारण का एक घटक के रूप में चुना गया था। कोलेजन दानेदार ऊतक, फिर मॉडलिंग और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स 15 की परिपक्वता की अंतर्वृद्धि बढ़ावा देता है। कोलेजन अपमानित है, neovascularization और दानेदार ऊतक प्रत्यारोपण का समर्थन करता हैएड कीमा कणों कि पुनर्निर्माण, विस्थापित और 5-7,11,16 का विस्तार। इसके अलावा, दोनों कोलेजन त्वचा में और मूत्राशय में और दोनों मूत्रजननांगी प्रणाली 17,18 में घाव भरने के अध्ययन और पुनर्निर्माण सहित इन विट्रो और इन विवो में scaffolds के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है बाह्य मैट्रिक्स का एक प्रमुख प्राकृतिक घटक है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम आसानी से प्रबंध कर रहे हैं। सबसे पहले, बायोप्सी नमूनों प्रत्यारोपण या किसी और सेल के विकास में सम्मिलन से पहले नम और अनुकूल परिस्थितियों में रखा जाना करने में देरी या अनुपस्थित हो जाएगा। एक दूसरा ख़तरा कोलेजन की सही दृढ़ता हो रही शामिल हो सकता है। एक यकीन है कि कोलेजन कोलेजन जेल के अंदर बुलबुले से बचने के द्वारा ऑटोग्राफ़्ट की तैयारी के दौरान कड़ा हो जाता है सुनिश्चित करना चाहिए। बुलबुले सावधान pipetting द्वारा परहेज कर रहे हैं और छोटे बुलबुले एक सुई के साथ उठी जा सकता है। बुलबुले के साथ कोलेजन खारिज किया जाना चाहिए।

यह है एकLSO कीमा बनाया हुआ ऊतक के सही आकार पाने के लिए महत्वपूर्ण; ऊतक क़ीमा से पहले, सुनिश्चित करें कि केवल पतली मूत्राशय म्यूकोसा मूत्राशय विस्तार या त्वचा के विस्तार के मामलों में केवल एपिडर्मिस के मामलों में प्रयोग किया जाता है। आदेश में सुई के साथ प्रत्यारोपण के लंबवत स्थानांतरित करने के लिए विभिन्न परतों को अलग करने से बचने के लिए सुनिश्चित करें: पिछले ख़तरा जब suturing है। ऑटोग्राफ़्ट के किनारों को भी आदेश बहुलक से कोलेजन को अलग करने में ध्यान से संभाला नहीं किए जाने की जरूरत है। चादरों suturing के बाद अलग करने के लिए कठिन हो जाएगा। ये आम समस्या है कि जब तकनीक सीखने उत्पन्न हो सकती हैं।

इस तकनीक की एक सीमा है कि कीमा कणों में कोशिकाओं को पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के प्रसार पर भरोसा है। इसलिए, ऑटोग्राफ़्ट की मोटाई कम से कम 1 मिमी हो गया है और एक अच्छी तरह से vascularized साइट में रखा जाना है। यह मूत्राशय की प्रत्यारोपित भाग के माध्यम से मूत्र के रिसाव के खतरे की वजह से नुकसान हो सकता है। प्लास्ट पर निर्भर करता हैआईसी संपीड़न, अलग पारगम्यता स्थिरांक प्राप्त किया जा सकता है। हमारे मामले में हाइड्रोलिक पारगम्यता (कश्मीर) मूल्य पिछले अध्ययनों 19 के अनुसार 0.034 था। एक नैदानिक ​​सेटिंग में हम आशा करते हैं कि हम क्रम में लगभग 1-2 सप्ताह के लिए मूत्राशय कैथेटर के साथ खाली रखने के लिए एक बहुस्तरीय निरंतर urothelium कि सक्रिय होने से पहले पैच संयुक्त राष्ट्र के प्रवेश के योग्य बनाने का निर्माण करने के urothelial कोशिकाओं के लिए समय देने के लिए की आवश्यकता होगी उपयोग।

एक और सीमा ऊतक फसल और विस्तार के लिए एक स्वस्थ अंग की धारणा है। और अधिक गंभीर मामलों में जब मूत्राशय लापता या विस्तार के लिए अयोग्य है, उदाहरण के लिए, जब कैंसर से प्रभावित, तकनीक उपयुक्त नहीं हो सकता है।

अन्य ऊतक इंजीनियर सेल निर्माणों के लिए के रूप में, कार्यात्मक और रूपात्मक परिणामों पर अंतिम निष्कर्ष केवल vivo अध्ययन में लंबी अवधि में उत्तर दिया जा सकता है। हमारा अगला कदम viab के संबंध में लंबी अवधि के जानवरों के अध्ययन में हमारे परिणामों का विश्लेषण करने के लिए किया जाएगाबड़प्पन और शारीरिक विशेषताओं के बाद प्रत्यारोपण।

प्रस्तुत तकनीक के महत्व संभावना केवल एक ही शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के बाद इन विवो में ऊतक का विस्तार है। अन्य तकनीकों वर्तमान में मूल्यांकन किया जा रहा सब प्रत्यारोपण से पहले इन विट्रो में कोशिकाओं के विस्तार पर निर्भर हैं। इन विट्रो प्रक्रियाओं, उच्च लागत के साथ संबद्ध किया जा रहा उन्नत प्रयोगशाला कर्मियों की आवश्यकता होती है, और समय लेने वाली होने का नकारात्मक पहलू है। यह ऊतक या कोशिकाओं और एक ऊतक इंजीनियर ऑटोग्राफ़्ट की कटाई के बीच 2 महीने तक का समय लग सकता है; के रूप में तकनीक इस अध्ययन में वर्णित के अनुसार, कम से कम 1 घंटा करने का विरोध किया।

भविष्य में, संकुचित कोलेजन तकनीक में कीमा बनाया हुआ ऊतक विस्तार किया है और इस तरह के पेट की दीवार दोष, diaphragmatic हर्निया, और अन्य शर्तों जहां एक दोष आसानी से मौजूदा ऊतक के साथ खंगाला नहीं है के रूप में अन्य अंगों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

विवो में विस्तार कर सकते हैं के प्रत्यारोपण के लिए वर्णित है। एक ऑटोग्राफ़्ट तैयार करने की प्रक्रिया करने के लिए आसान है और एक साधारण शल्य चिकित्सा की स्थापना में बाँझ शर्तों के तहत इस्तेमाल किया जा सकता है। ऑटोग्राफ़्ट शल्य चिकित्सा से निपटने को तैयार नहीं और biodegradable है। ऑटोग्राफ़्ट की कोर मरीज की विशिष्ट जरूरतों के हिसाब से अलग-अलग biodegradable गिरावट और ऐसे लोच, मोटाई, और porosity के रूप में अन्य विशेषताओं, की दर के बारे में वरीयताओं के आधार पर पॉलिमर की रचना की जा सकती है, और। एक नैदानिक ​​सेटिंग में, रोगी ऊतक फसल, समग्र ऑटोग्राफ़्ट और एक एकल चरण प्रक्रिया के रूप में स्वप्रतिरोपण की तैयारी गुजरना होगा। इसके अलावा, सेल युक्त bioconstructs के सभी भागों वर्तमान में एफडीए को मंजूरी दी जाती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone catheter 10-French Preparing the animal for surgery, Section 1
DMEM 10x Gibco 31885-023 Plastic compression section 4
24 well plates Falcon 08-772-1 Plastic compression section 4
3',3',5-Triiodothyronine Sigma-Aldrich IRMM469 In vitro culture; Section 5
4% PFA Labmed Solutions 200-001-8 Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol Histolab Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit Vector PK6102 Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol Histolab 1399.01 Immunocytochemistry; Section 6
Adenine Sigma-Aldrich A8626 In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain Preparing the animal for surgery, Section 1
Azaperone 2 mg/kg  Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria Preparing the animal for surgery, Section 1
Biosafety Level 2 hood  Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. Vector The blocking solution depends of the  origin of  first antibody Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA Preparing the animal for surgery, Section 1
Carprofen 3 mg/kg    Rimadyl, Orion Pharma, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
Chlorhexidine gluconate  Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England Preparing the animal for surgery, Section 1
Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling Histolab 6150 Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made Plastic compression; Section 4
DMEM Gibco 3188-5023 Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor Sigma-Aldrich E9644 In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) Ethicon Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10437-036 Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth) Preparing the animal for surgery, Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)  Preparing the animal for surgery, Section 1
Ham's F12 Gibco 31765-027 Plastic compression section 4
Hematoxylin Histolab 1820 Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber DALAB Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888 In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30% Sigma-Aldrich H1009 Immunocytochemistry; Section 6
Insulin Sigma-Aldrich I3536 In vitro culture; Section 5
Isoflurane Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL Preparing the animal for surgery, Section 1
Lidocaine 5 mg/ml Xylocaine, AstraZeneca, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
Lucose 25 mg/ml Baxter, Deerfield, IL Preparing the animal for surgery, Section 1
Marker pen pap pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg  Domitor, Orion Pharma, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
Mincing device Applied Tissue Technologies LLC Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament) Ethicon Surgery, Section 1
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1 N Merck Millipore 106462 Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection APL Vnr 336164 Surgery, Section 1
PBS Gibco 14190-094 Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg Pentobarbital, APL, Sweden Preparing the animal for surgery, Section 1
PCL Knitted fabric Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen First LINK, Ltd, UK 60-30-810 Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade - 15 Preparing the animal for surgery, Section 1
Shaving shears Preparing the animal for surgery, Section 1
Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size Plastic compression; Section 4
Steril gloves Preparing the animal for surgery, Section 1
Sterile gowns Preparing the animal for surgery, Section 1
Sterile drapes
Sterilium Bode Chemie HAMBURG Preparing the animal for surgery, Section 1
Suture Thread Ethilon Preparing the animal for surgery, Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg Preparing the animal for surgery, Section 1
Transferrin Sigma-Aldrich T8158 In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC  Sigma-Aldrich T6066 Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate kit Vector SK4600 Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded) Ethicon Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water.
X-tra solv (solvent) DALAB 41-5213-810 Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride Zoletil, Virbac, France Preparing the animal for surgery, Section 1
Depilatory wax strips Veet Preparing the animal for surgery, Section 1
Pentobarbital sodium Lundbeck Termination, Section 3

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 108 ऊतक इंजीनियरिंग biomaterial ऊतक पाड़ सेल विस्तार मूत्राशय प्लास्टिक संपीड़न मज्जा कीमा बनाया हुआ ऊतक पॉलिमर ऑटोग्राफ़्ट
संकुचित कोलेजन में कीमा बनाया हुआ ऊतक: एकल मंचन पुनर्निर्माण मरम्मत के लिए एक सेल युक्त Biotransplant
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Chamorro, C. I., Zeiai, S.,… More

Chamorro, C. I., Zeiai, S., Reinfeldt Engberg, G., Fossum, M. Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair. J. Vis. Exp. (108), e53061, doi:10.3791/53061 (2016).

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