Summary
Doku mühendisliği genellikle doku rejenerasyonu için Otogreft yaratmak için in vitro genişlemesinde içerir. Bu çalışmada, genişleme, doku, yenilenme ve in vivo olarak yeniden yapılanma için bir yöntem olup vücut dışında hücreleri ve biyolojik malzemelerin işlenmesi en aza indirmek için geliştirilmiştir.
Introduction
Deri ve ürogenital sistem için transplantasyon en doku mühendisliği çalışmaları özel donanımlı hücre kültürleme tesislerde 1,2 sağlıklı doku ve hücre genişlemesi otolog hücre hasat içerir.
Hasta otogreft almaya hazır olduğunda hücre genişlemesi sonra hücreler, genellikle daha sonra kullanılmak üzere saklanır. Azot dondurucular -150 ° C veya daha düşük düşük sıcaklıklarda uzun süreli depolama izin. donma süreci dikkatli ve hücreleri kaybetmemek için kontrol olmalıdır. hücre ölümü biri risk hücre zarlarının yırtılmasına yol açabilir çözdürme işlemi sırasında hücre içi su kristalleşme olduğunu. Hücre dondurma, genellikle hücre, fetal sığır serumu ve dimetil sülfoksit yüksek konsantrasyonu kullanılarak, yavaş ve kontrollü bir soğutma (-1 ° C başına dakika) ile gerçekleştirilir. Çözündükten sonra, hücreler dondurma orta çıkarılması ve hücre kültürü plastik ya da ilgili kültürlenmesiyle yeniden işlenmesi gerekenhastaya geri transplantasyon öncesi biyomalzeme.
Yukarıda belirtilen adımları zaman alıcı ve zahmetli olan, 3 masraflı. Buna ek olarak, hasta transplantasyon için öngörülen hücrelerin in vitro işleme son derece düzenlenir ve iyi eğitimli ve akredite personel ve laboratuarlar 4 gerektirir. Sonuçta, teknik sadece teknik olarak gelişmiş merkezlerin çok az sayıda kurulabilir ve sık cerrahi hastalıklarda daha geniş bir kullanım şüpheli, güvenli ve güvenilir bir üretim süreci temin etmek.
Laboratuar ortamında hücre kültürü içinde sınırlamalarını aşmak için, in vivo olarak, hücre genişlemesi için kıyılmış doku nakli kavramı biyoreaktör olarak vücut kendisini kullanarak sokulur. Bu amaçlar için, otogreft tercihen i organı nihai yeniden düzenleme için gerekli olan şekle göre olan bir 3 boyutlu kalıp üzerinde nakledilen olacaktır5-7 nterest.
Başlangıçta, kıyılmış epitel nakli fikri o epiteli bir yara kenarlarından nasıl büyür açıklanan 1958 yılında Meek tarafından sunuldu. O cildin küçük bir parça (Şekil 1) 8 dik yönde iki parça kesilerek 100% oranında ve böylece hücre genişlemesi için potansiyel marjlarını artırmak ve olduğunu göstermektedir. Teori cilt transplantasyon 9 fileli kısmi kalınlıkta deri grefti kullanımı ile desteklenen ve deride modelleri 10 yara iyileşmesi olmuştur.
Şekil 1:. Meek teori Meek teorisine göre, epitel bir yara kenarlarından büyür. kıyma teknolojisi ile maruz alanını arttırarak, kıyılmış doku birçok noktalardan yaralar epithelializes.
Bu çalışma hipo dayanmaktadırAynı ilke, bir kalıp etrafında kıyılmış epitel yerleştirerek deri altı dokuya uygulanabilir tezi. (Iç vücuttan yabancı cisim (kalıp) yara alanı kaplar ve ayıran sürekli neoepithelium oluşturmak için epitel hücreleri yara alanları (göç) kapak, kıyılmış nakli (yeniden) den seferber olur ve bölme (genişletmek) Şekil 2).
Şekil 2:. Meek teorisine göre, in vivo vücut içi doku genişlemesi için kıyılmış epiteli ile 3D kalıp Karikatür deri altı dokuya bir kalıp üzerine yerleştirilir ve daha sonra nakledilen kıyılmış doku kullanarak, hipotez epitel hücreleri göç olduğunu kıyılmış doku kenarları, yeniden, ve yara alanı kaplar ve iç gövde arasında yabancı cisim (kalıp) ayıran bir kesintisiz neoepithelium oluşturacak şekilde genişler.
Önceki in vivo çalışmalar umut verici sonuçlar gösterse de rejenere epitel iyi 7 mekanik travma dayanacak, böylece daha fazla iyileştirmeler otogrefti takviye ile elde edilebilir. kolay besin ve atık ürünlerin yayılması, olasılık kalıbına 3D bir şekilde ve cerrahi işleme kolaylığı: Bu amaçla, başarılı bir biyomalzeme önemli bir önkoşul gibi, tespit edilmiştir. Sonuçlar bu ihtiyaçların kıyılmış dokuya kompozit biyo materyal ekleyerek karşılanabileceğini yapılmıştır.
kıyılmış dokudan oluşan bir iskele geliştirmeyi amaçlayan mevcut çalışma biyolojik olarak parçalanabilir bir kumaş takviye çekirdek içeren kollajen plastik sıkıştırılmış. Bu sayede, canlı hücreler kıyılmış doku parçacıklarının göç olabilir ve orijinal epiteli (deri veya ürotelyum) morfolojik özellikleri karakteristiği ile çoğalırlar. Plastik sıkıştırma kullanarak, iskele azaltmak olduyaklaşık 420 um kıyılmış parçacıkları olarak 1 cm arasında D üst katman kolajen kaplı edildi. Çekirdek kumaşın herhangi bir polimer olabilir, ancak kapsayan kollajen tabakaların 11, birbirleriyle amacıyla hidrofilik yüzey ile değiştirilmesi gereken olabilir.
yöntem kıyılmış mesane mukozasını veya domuz kıyılmış cilt kültürü için bir iskele olarak kullanarak iki plastik sıkıştırılmış kollajen jel içinde poli (ε-kaprolakton) oluşan bir örgü örgü (PCL) dahil ederek gelişmiş bir iskele bütünlüğü sağlanmış. Yapı, iyi konsolide hibrid yapısı üstünde tabakalı, çok katmanlı ürotelyum ve skuamöz deri epitelyumunun başarılı oluşumu gösteren in vitro en fazla 6 hafta içinde, hücre kültür koşullarında muhafaza edilmiştir. yapı işlemek için kolay oldu ve mesane büyütme amaçlı veya cilt kusurlarının örtülmesini yerine dikilir olabilir. Doku iskele tüm parçaları FDA onaylı ve teknik vardırDoku kıyma hasat, plastik sıkıştırma ve tek aşamalı müdahale olarak hastaya geri nakli tek aşamalı işlemleri için kullanılabilir. Prosedür herhangi bir genel cerrahi ünitesinde steril koşullar altında doku genişletme ve yeniden inşası için yapılabildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Hayvanlar Stockholm İl Komitesi tarafından önceden onaylanmış ve tüm işlemler hayvan kullanımı yanı sıra, ilgili federal yasalar için düzenlemeler uymuştur.
1. Hayvan Prosedürleri
- Cerrahi Hayvan Hazırlama
- steril koşullar altında çalışması için gerekli tüm malzeme ve enstrümanlar ile cerrahi tablo hazırlayın. enfeksiyon riskini azaltmak ve hayatta kalma cerrahi koşulları optimize etmek için steril koşullar altında sadece ameliyat.
- ameliyat öncesi 12 saat boyunca hayvan oruç ve ağırlığını ölçün. premedikasyonu azaperone bir kas içine enjeksiyon (2 mg / kg) uygulayınız. tiletamine hipoklorit (2.5 mg / kg), zolazepam hipoklorit (2.5 mg / kg), medetomidin (25 ug / kg) ve atropin (/ kg 25 ug) kas içine enjeksiyon ile hayvan anestezisi.
- phenobarbiturate enjekte (15 mg / kg) endotrache önceal entübasyon ve% 0.8 -2% izofluran ile genel anestezi devam eder. tek kulakta bir periferik ven kateteri yerleştirin ve hayvan refahını korumak için intravenöz işlem sırasında glikoz (25 mg / ml) demlenmeye.
- ısısını, kan basıncını, doygunluk ve periferik nabız kontrol etmek için kulak veya kuyruk izleme cihazları yerleştirin. kulakları veya toynakları ağrı stimülasyonu ile kontrol anestezi. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere merhem sürün.
- Mesane Biyopsi Numune eksizyonu
- Yarı steril koşullarda idrar boşaltmak için üretra görüntüleyebilir ve üretra yoluyla katater takmak bir spekulum tanıtarak ve mesane içine 10 Fransız silikon kateter kullanılarak mesaneye kateter. 20-25 cm H2O, yaklaşık 100-300 ml bir basınca, steril tuzlu su çözeltisi ile mesane doldurmak ve daha sonra, boş O 2 cm, H 20 (yakl. 8 ml / kg vücut ağırlığı).
- the domuz dikkatli bir yan konumuna döndürülmüş klorheksidin glukonat uygulama ile deri temel bir ameliyat öncesi sterilizasyon gerçekleştirin. Tıraş makası ile pelage kaldırdıktan sonra omuz bir diatermi plaka uygulayın.
- sırtüstü pozisyonda dikkatlice domuz çevirin ve tıraş makas kullanılarak karın pelage kaldırmak ve klorheksidin glukonat uygulaması ile karın derisinin temel preoperatif sterilizasyon yapmak.
- Yumuşak giysilerle ekstremite embed ekstremitelerde eklemlere hiperekstansiyon zarar görme riskini en aza indirmek için. klorheksidin glukonat ardışık uygulamaları ile hayvanın karın cildi sterilize ve cerrahi alan etrafında steril dökümlü yerleştirin.
- cilt insizyonu önce, göbek altındaki orta hat buprenorfin (45 ug / kg), karprofen (3 mg / kg) ve lidokain lokal enjeksiyonu içeren bir damar içi analjezik uygulanır. sk tutarak ağrı reaksiyonu kontrol edinforseps ile. fasya yoluyla daha düşük bir orta hat kesi yapmak ve kanama kontrolü için diatermi kullanarak periton. domuz tamamen intraperitoneal bir konuma sahiptir ve serbestçe cerrahi yara aracılığıyla seferber ederek maruz kalabilirler mesane yerelleştirilmesine.
- forseps ile mesanenin tutun ve steril bir ölçüm bandı ile ölçmek ve bir steril kalem kullanarak, uzunlamasına yaklaşık 2 cm ve enine 1 cm veya daha küçük bir eliptik şekilli biyopsi örneği işaretlemek (domuz mesane boyutu çeyrek azalma tahammül çok iyi). , Işaretli alana tüketim bir neşter kullanılarak, ve steril şartlar altında DMEM mesane biyopsi örneği yerleştirin.
- biotransplant ile ototransplantasyon gerçekleştirin veya iki kat 5-0 vicryl ile dikilmesi yoluyla mesane kapatın. 2-0 ya da 3-0 Vikril çalışan özenle karın fasya kapatın. 3-0 vicryl ile subkutiste ve 3-0 etilon ile cilt kapatın. Yaranın üzerine dikkatle bir pansuman yerleştirinanestezi yeterince kurtarıldı ve ağrıyı ifade etmez kadar hayvana eğilimindedir.
- postoperatif bakım koşullarını sağlamak için hayvan bakım tesisi için hayvan taşımak. bir ısıtma lambası ile tek bir kafeste hayvan koyun ve katılmak hayvana anestezi tam iyileşme kadar ve daha sonra hayvanlar çiftler halinde durmuş olsun.
- ağrı ve refahı ile ilgili olaysız bir kurtarma sağlamak ve beş gün boyunca günde bir kez üç gün boyunca günde iki kez intramüsküler postoperatif analjezi ve trimetoprim (4 mg / kg) ve sülfonamid (20 mg / kg) için buprenorfin (45 ug / kg) yönetmek ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltır.
- Cilt Biyopsi Numune eksizyonu
- gerekli tüm malzemeler ile cerrahi tablo hazırlayın. Daha önce 1.1 de tarif edildiği gibi hayvan anestezisi. , Balmumu kullanarak pelage çıkarın yıkayın ve betadin ve% 70 alkol ile kesi alan sterilize ve daha sonra steril dökümlü aroun koyunkesi alanı d.
- 0.3 mm parsiyel kalınlıkta deri biyopsi örneği hasat bir dermatom kullanın. 2.2 de tarif edildiği gibi, kıyma önce DMEM deri örneği yerleştirin. yağlı merhem ve bir pansuman ile yara alanı kapsayacak.
2. Kıyma Doku Hazırlanması
- mesane Mukoza
- DMEM içinde iki kez mesane biyopsisi yıkayın. yukarı bakacak şekilde mukoza ile steril diseksiyon tabağa mesane biyopsi örneği yerleştirin ve diseksiyon pimleri kullanarak plaka taraflardan biri düzeltmek.
- Ince makas ve forseps (Şekil 3) kullanılarak detrusor kas mukozal doku ayırın ve bunun üzerine tuz veya DMEM damlayan nemli mukoza tutun.
- mukoza üzerinde yerleştirerek kıyma cihazı kullanın ve daha sonra 0.8 mm x 0.8 mm kıyılmış doku parçalarını elde etmek için manuel basınç uygulayarak, dikey ve yatay bir uçtan diğer uca cihazı pass (0.8 mm rotatin arasındaki mesafeg) kesme bıçakları.
- cilt
- cilt biyopsisi ile eğer kalın: steril diseksiyon plaka üzerine cildi yerleştirin ve deri altı yağ ve dermis epidermis ayırmak için cerrahi makas kullanın. epidermis ince ve saydam (yakl. 0,3 mm) o kıyma için hazır olduğunda.
- epidermis üzerine yerleştirerek kıyma aygıtı kullanın. baskı ile, 0.8 mm X 0.8 mm kıyılmış doku parçalarını elde etmek için yatay olarak dikey olarak bir uçtan diğer uca cihazı geçerek.
Plastik Sıkıştırılmış PCL / Kollajen Otogreftlerin 3. hazırlanması
- soğuk tutmak için buz üzerinde tüm malzemeyi yerleştirin. gerekli Kaplar: Falcon tüp, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu kollajen tip 1.
- 1. 1 N NaOH, damla damla ekleme yoğun arasında değişen pH göstermelidir ortam içinde 7,4-8 (renk pH değerine getirmek için kollajen tip 12 ml 10x DMEM (dikkatli bir şekilde kabarcıklarını önlemek için) 2 ml karıştırın pin sarık). Buna ek olarak, bir pH kağıdının kullanımı.
- Dikkatle 1x DMEM 2 ml ekleyin ve çözüm karıştırın. Çelik levha dikdörtgen kalıp (20x30x10 mm) her kollajen, yaklaşık 2 ml, 37 ° C'de inkübe 10 dakika boyunca% 5 CO2 içinde ° C.
Not: kolajen konsantrasyonu 2.06 mg /% 0.6 asetik asit ilave edin ve bir kolajen 1 mi / cm2 kadar olmalıdır. - kollajen kalıba ayarladığında, kolajen jeli (20 mm x 30 mm) üzerine biyo materyal (PCL) yerleştirin ve üstünde kalan kollajen (yaklaşık 6 mi) dökün. 20 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- kollajen jel üstünde: kıyılmış doku (6 genişleme 1) yerleştirin. Aşağıdaki gibi plastik sıkıştırma kullanarak mekanik kuvvet tarafından yapının suyu dışarı basın (Şekil 3 ve 4).
- steril bir yüzey üzerinde gazlı bez kalın bir tabaka yerleştirin. Gauz üstünde bir paslanmaz çelik hasır (kalın 400 mikron) yerleştirine yastıkları ve naylon örgü (kalın 110 mikron) ve daha sonra bir levha. Dikkatle naylon örgü üzerine kollajen jel / kıyılmış doku transferi ve dikkatli bir şekilde dikdörtgen çelik kalıp çıkarmak.
- kollajen jel / kıyılmış doku üstünde naylon örgü yeni bir katman yerleştirin. Naylon filtre üzerine kurulu bir ikinci çelik örgü yerleştirin. Pozisyonda, 5 dakika boyunca 120 g (yani, cam plaka) en az ağırlık basıncı veya yükleme plaka koyun.
- ağırlık, naylon ve çelik kafes çıkarın. Otogreftleri şimdi tam kalınlıkta deri yaraları domuz mesane dikilir ya da in vitro kültür için hazırız.
- In vitro kültür için, 12 gözlü levhalar monte küçük parçalar halinde ince bir yapı kesti. keratinosit ortamın 1 ml ilave edilir. 37 ° C, 6 haftaya kadar% 5 CO 2 ve kültür kuvöz tabak yerleştirin ve haftada orta 3 kez değiştirin.
Otogreftlerin 4. Dikiş
- otogreftin sütür ileDomuz mesaneye kıyılmış mesane mukozası
- bekleme süresi boyunca DMEM nemli otogreft tutun. İnce çalışan monofilament sütür ile otogreft dikin. araştırma amaçlı emilmeyen 5-0 etilon kullanın.
- üriner kateter aracılığıyla serum fizyolojik ile mesane doldurularak su geçirmez olmadığını kontrol edin. Mümkünse, büyük omentum bir tabaka ile otogreft kapsamaktadır. 1.2.6 açıklandığı gibi karın duvarı, deri altı dokusu ve cilt kapatın. bir yara pansuman uygulayın.
- Tam kat Yara için Kıyma Cilt Epidermis ile otogreftin sütür
- bekleme süresi boyunca DMEM nemli otogreft tutun.
- yakından alttaki yüzeye bağlı otogreft tutmak için köşelerde suturlarla ve otogreftin ortasında yara cilt tam kalınlıkta altına otogreft dikin.
- yara nemli tutan plastik bir örtü ile yarayı örtün.
- kas içi zolazepam hipoklorit enjeksiyonu (2.5 mg / kg) ve medetomidin'den (25 ug / kg) önce fesih ve kulak veya kuyruk izleme cihazları uygulamak ile oturaklı hayvan nabız ve kan basıncı kontrol etmek için.
- intravenöz pentobarbital sodyum (60-140 mg / kg) öldürücü bir miktarının uygulanması ile hayvan öldürülür. ölüm meydana gelmiştir kadar nabız ve kan basıncını kontrol edin.
6. İn Vitro Kültür
Not: histolojik, in vitro olarak PCL / kollajen yapılarında kıyılmış doku ilerlemesini değerlendirmek için, kollajen / PCL / kıyılmış yamalar keratinosit ortamı kullanılarak 12 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi.
- keratinosit ortamının hazırlanması:
- 500 ml'lik bir cam şişe sterilize edin.
- (1: Karışım 4) Ham F12, 100 ml DMEM 400 ml karıştırın. % 10 fetal bovin serumu ile takviyesi, 5 ug / ml insülin,0.4 ug / ml hidrokortizon, 21 ug / ml adenin, 10 -10 mol / L kolera toksin, 2 x 10 -9 mol / L triiyodotironin / ml transferin, 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü, 50 U / ml penisilin 5 ug ve / ml streptomisin 50 ng.
- 0.2 um'lik bir filtre içinden filtre etme ile sterilize ve steril 500ml şişe içinde süzüntü toplanır.
7. İmmünhistokimya
NOT: immünhistokimya protokolü genellikle aşağıdaki adımları ayrılır: (1) tespit ve parafin gömme, (2) mikro-kesit 5 mikron dilimleri, slaytlar, deparaffination ve rehidrasyon yerleştirme için, (3) antijen maskesinin düşürülmesi, boyama ve montaj . immünhistokimya prosedüründe son adımları başlamadan önce, yıkama tamponlar ve antijen maskesinin düşürülmesi solüsyonu (ayrı malzeme detaylarını görmek) hazırlar. Kullanmadan önce, ABC kompleksi çözeltisi, en azından 30 dakika hazırlayın.
- tespit
HAYIRT: aşağıdaki gibi in vitro kültürü sonunda, yamalar gidermek:- % 4 tamponlu formaldehit (PFA) 1 ml Eppendorf tüpleri hazırlayın (Dikkat:.. Formaldehit zehirli olan bu kimyasal ile çalışmaya başlamadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını okuyun eldiven ve koruyucu gözlük takın ve bir davlumbaz içine solüsyon hazırlanır Lütfen).
- % 4 PFA içeren bir Eppendorf tüpüne, kolajen yamalar her transfer. Oda sıcaklığında gece boyunca sabitleyin.
- 4 ° C'de uzun süreli depolama için% 70 etanol içinde Örnekleri. Numuneler artık dehidratasyon hazır ve kesit önce parafin bloklarda gömme vardır.
- rehidrasyon
- 15 dakika boyunca X-tra Solv bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. X-tra Solv ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. 10 dakika boyunca mutlak etanol ile bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. mutlak etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. % 95 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar, 10 dakika boyunca ve daha sonra, koyun10 dakika süre ile,% 70 etanol olan bir boyama kavanoza. Son olarak damıtılmış su ile 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın.
- antijeninin ortaya çıkartılması
- TE çözeltisi ile Coplin kavanoza slaytlar koyun ve 20 dakika için kaynamaya bir su banyosu içinde kavanoza koyun. dikkatle su banyosu dışında kavanoz alın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar slaytlar soğutun ve Tris tamponu içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkanır. 10 dakika süre ile% 3 hidrojen peroksit ile boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tris tampon maddesi içinde 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın. kalem işaretleme bir su itici kullanarak numunelerin etrafında bir daire çizin.
- bloklama çözeltisi 100-300 ul kullanılarak antikorun spesifik olmayan bağlanmayı bloke eder. Engelleme çözeltisini çıkarın ve Tris tamponu içinde önerilen yoğunlukta çözüldü birincil antikor 100-300 ul ekle. gece inkübe edin. Antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca iki kez Tris tamponu bölümleri yıkayın.
- oda sıcaklığında bir 1 saat için ikincil antikor ile inkübeure. Tris tampon maddesi içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkanır. ABC Elite Kiti (üreticinin talimatlarına uyun) kullanılarak 30 dakika inkübe edin. Tris tampon maddesi içinde iki kez yıkayın.
- üreticinin talimatlarına (1-7 dk inkübasyon genellikle açık mor yoğunluğu üretir), Vektör VIP Kit kullanarak takip ederek antikor reaksiyonu geliştirin. distile su slaytlar koyun. 30 sn Mayer'in hematoksilen ile counterstain.
- 5 dakika boyunca akan su içinde yıkayın. 1 dakika boyunca% 70 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. % 70 etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. 1 dakika boyunca% 95 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. % 95 etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca X-tra Solv bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. nemli tutmak için bir seferde, tek çıkarın. Her bir slayt üstüne montaj orta bir damla koyun ve üstüne bir cam kapak (hava kabarcıklarını önlemek için çok dikkatle yapmak) koyun. slaytlar gecede kurumasını bekleyin ve bir mikro altında slaytları görüntülemekkapsamı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, kollajen ve kıyılmış doku plastik sıkıştırma kullanarak nakli için bir biyo materyal üretmek için nasıl gösteren bir yöntem sunar.
Mesane mukozasının ve cilt hasat edilmiş ve daha sonra mekanik olarak küçük parçacıklar (Şekil 3) içine kıyılmış edilebilir. Plastik sıkıştırma ile, kıyılmış partiküller bir kollajen jel (Şekil 4) dış tabakaları içinde mekanik olarak güçlü olan bir merkezi olarak yerleştirilmiş biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerin oluşan kompozit iskele içinde bu buluşa katılmıştır. 6 genişletme oranı: kıyılmış doku parçacıkları 1 izin ayrılabilir. kollajen su içeriği basarak, otolog rekonstrüktif cerrahi için bir biotransplant tamamlandı.
Biotransplants fazla in vitro çalışmalar için sıradan bir hücre kültürü ortamında in vivo araştırmalar veya kültür için hayvana ototransplantasyon için kullanılabilir.
T O açgözlü ve dikiş izin verir ve cerrahi işleme (Şekil 5) sürdürmektedir kompozit otogreft. Doku hasat ve rekonstrüktif cerrahi için hücre içeren otogreftin hazırlanmasından işlemi yaklaşık 20 dakika sürer ve tek aşamalı prosedür olarak yapılması amaçlanmaktadır.
Hücreler göç, in vitro çalışmalarda, genişletme ve iki hafta içinde bir tek hücre sürekli tabaka içine otogreft yüzeyine yeniden. Dört hafta sonra, sürekli bir epitel (Şekil 6), yaklaşık 4 hücre tabakası kalınlığındadır. zaman içinde farklı noktalarda İmmünohistokimya hücreler çoğalmaya göç ve hücre fenotipi için tipik olan bir mikro mimarisi ile sürekli bir epitel içine yeniden ortaya koymaktadır. Aynı sonuçlar kıyılmış mesane mukozasına gibi kıyılmış cilt epiteli ile otogreftlerde için geçerlidir.
1 / 53061fig3.jpg "/>
Şekil 3:. Doku hazırlanması ve plastik sıkıştırma Kıyılmış (C) kıyma ve plastik sıkıştırma mesane mukozasının (A) 'nın hazırlanması (D - F), (B)' de kıyma cihazı kullanılarak ve (D) 'de kalıp üretmek için 420 mikron kalınlığında nakli (H). Kolajen kendisi iyi hücre dışı matris Not mekanik olarak ele almak zordur (G); Bir takviye edici çekirdek olarak biyolojik olarak parçalanabilir bir kumaş koyarak, transplantasyonu (H) kavramak kolay hale gelir.
Şekil 4: Plastik sıkıştırma kıyılmış parçacıkları ile plastik sıkıştırma işlemini gösteren bir çizgi film..
Şekil 5:. T (nakledilen otogreft) S (sahte) olarak işaretlenmiş kıyılmış deri olmadan Sütürlü biyomalzeme olarak işaretlenmiş Ototransplantasyon için kıyılmış cilt ile bir sıçan tasviridir dikildi plastik sıkıştırılmış biyomateryal Cerrahi işleme Tam kalınlıkta deri yara modeli. 3 büyüme oranı: Bu durumda, kıyılmış cilt epiteli 1 için nakledilen edildi.
Şekil 6: immünohistokimyasal boyama kolajen-biyomateryal kıyılmış deri ve mesane mukoza 3D kültür ilerlemesini görselleştirmek için (A - D), (A) ana cilt Hematoksilen / eozin boyama, (B), ana mesane, (C), kıyılmış. kültürde 6 hafta sonra kültür ve (D) kıyılmış mesane 5 hafta sonra cilt. MNF116 (E) ve Ki-67 antikorları ile epitelyal ve proliferasyon işaretlerinin ifadesi (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, cerrahi masada transplantasyon için otolog doku ile mesane duvar yamaları üretmek için kolay kullanımlı bir yaklaşım sunuyor. Yamalar ve plastik sıkıştırma ile kombinasyon halinde, dış yüzeylerde kıyılmış doku olmayan orta ve kollajen biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer örgü kombinasyonu ile oluşturulur. Plastik sıkıştırma yöntemi daha önce başka yazarlar tarafından tanımlanan ve kolajen jellerin 12,13 sıvının hızla dışarı itilmesini olarak tanımlanabilir olduğu. mesane mukozasının veya deri kıyılmış doku bu iskele içine numaralı seribaşı ve mesane ya da deri epitel oluşumu 6 hafta boyunca takip edilebilir. Immünohistokimyasal analizler normal doku karakteristik eşdeğer oluşumunu gösterdi. Bu sonuçlar, sadece yeniden epitelizasyon ve yara iyileşmesi çalışmak için in vitro bir model sağlar, aynı zamanda otolog doku nakli için biyo materyal oluşturur. En önemlisi üroloji amaçlı, autografts nakli 11 daha önce in vitro kültürü için gerek kalmadan tasarlanmış otolog doku yamaları da rekonstrüktif ürolojide doku mühendisliği in vivo uygulamalar için kullanılabilir.
In vitro kültür teknikleri, cilt epiteli ve üroepitelyum payı ortak özellikleri, hücre genişleme ve saygı içinde. Güdü plastik sıkıştırma tekniğini sunmak ve bu çalışmada hem epitel dokular için kıyma cilt epiteli için hasat ve in vivo çalışmalar mesane üroepitelyum için daha kolay oldu. Bu sayede, biyomalzeme ve cilt epiteli ürogenital organlarda daha invaziv çalışmalar gerçekleştirmeden önce biyouyumluluk ve fiziksel özelliklerini onaylamak için bir ilk adım olarak ele alınabilir.
In vivo çalışmalar önceki olarak, kanalların doku rejenerasyonu için mesane mukozasının ile kıyılmış doku kavramı kullanılarak, elde edilen bulgular olduğunu the küçük nakledilen parçacıklar mekanik travma dayanacak ve nakledilen kıyılmış parçacıkların ilk take sırasında ve iyileşme süreci ve doku rejenerasyonu 6,7 sırasında yerde kalmak için bazı mekanik destek gerekli.
Bu zayıflıkların üstesinden gelmek için, çalışma melez bir polimer örme kumaş ve plastik sıkıştırılmış kollajen 11,14 bir biyolojik olarak parçalanabilir çekirdek ile inşa geliştirmeyi amaçladık. kollajen hücre eki ve büyüme için elverişli bir yüzey sağlar ve iskele içine kıyılmış doku doğrudan ve hızlı entegrasyon sağlar. Ancak, kollajen mekanik özellikleri beri, hatta plastik sıkıştırma sonra, hala zayıf ve kasılmaları ve doğal mesane hareketlerinin uzantıları sürdürmek olmaz, kollajen için destekleyici bir çekirdek iskele eklendi. Daha karmaşık yapılar için, nakledilen doku üç boyutlu EP üretilmesi için hazır bir kalıp etrafında genişletilebilirmerkezi bir tüp ithelialized yapısı.
Bu çalışmalarda bir dengeleyici polimer ve biograft temel olarak PCL kullanılır. PCL yaygın olarak diş dolguları, emilebilir sentetik cerrahi kafesleri ve dikiş malzemeleri 14 olarak biyomedikal cihazların çeşitli kullanılır. Rejenere doku olgunlaşmasını, yani innervasyon, düz kas dokusu ve hücre dışı matris temin etmek amacıyla, birkaç ay içinde yavaş bozulma oranı ile bir PCL polimer seçti. Bununla birlikte, bozunma hızı, polimer, kalınlığına ve yoğunluğuna 11,16 seçimi ile kontrol edilebilir.
Kollajen bağlı iyi bilinen biyolojik uyumluluk, güvenlik ve iyi bir iyileşme özelliklerine kompozit yapının bir bileşeni olarak seçilmiştir. Kollajen, granülasyon dokusu, yeniden modelleme ve hücre dışı matris 15 olgunlaşma büyümesini teşvik etmektedir. Kolajen bozulmuş olduğundan, neovaskülarizasyon ve granülasyon dokusu nakli desteklered, göç ve 5-7,11,16 genişletmek yeniden organize parçacıklar kıyılmış. Bunun yanı sıra, kolajen deride ve mesane ve ürogenital sistem 17,18 yara iyileşmesi çalışmaları ve rekonstrüksiyon içeren in vitro ve in vivo olarak iskeleler oluşturulması için kullanılmaktadır, her iki hücre dışı matrisin önemli doğal bir bileşenidir.
protokolü içinde kritik adımlar kolayca yönetilebilir. İlk olarak, biyopsi örnekleri gecikmeli veya mevcut olacak nakli ya da başka bir hücre büyüme içine yerleştirilmesinden önce, nemli ve uygun koşullar altında tutulması gerekir. İkinci çukur kollajen sağ sağlamlığı elde içerebilir. Bir kolajen kollajen jel içindeki baloncukları kaçınarak otogreftin hazırlanması sırasında sertleşir emin olmalısınız. Kabarcıklar dikkatli pipetle önlenir ve küçük kabarcıklar bir iğne ile delinmiş olabilir. kabarcıkları ile Kollajen atılmalıdır.
O birkıyılmış doku sağ boyutunu almak için LSO önemli; doku kıyma önce, yalnızca ince mesane mukozasının mesane genişlemesi veya cilt genişleme durumda sadece epidermis durumlarında kullanılır emin olun. Farklı tabakaların ayrılması önlemek için iğne ile nakli dik taşımak için emin olun: Geçen hatadır dikiş zaman olduğunu. otogreftin kenarları da polimerden kollajen ayırmak görmemesi için dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir. sayfaları dikilmesi sonra ayırmak için zor olacaktır. Bu tekniği öğrenmek ortaya çıkabilecek yaygın sorunlardır.
Bu tekniğin bir sınırlama kıyılmış parçacıklar hücreleri besin ve oksijen difüzyon güveniyor olmasıdır. Bu nedenle, otogreft kalınlığı en az 1 mm olması ve iyi vaskülarize siteye yerleştirilmesini sahiptir. Bu, mesane nakledilen kısmı içinden idrarın sızıntı riski için bir dezavantaj olabilir. plast bağlıIC sıkıştırma farklı geçirgenlik sabitleri elde edilebilir. Bizim durumumuzda hidrolik geçirgenlik (k) değeri önceki çalışmalarda 19 uyarınca 0.034 idi. bir klinik ortamda biz aktif önce yama un geçirgen hale çok katmanlı sürekli ürotelyumundan kurmak için ürotelyal hücreler için zaman vermek amacıyla yaklaşık 1-2 hafta süreyle kateterler ile boş mesane tutmak gerekir ki tahmin kullanın.
Başka bir sınırlama doku hasat ve genişleme için sağlıklı bir organın varsayımdır. kanserden etkilenen mesane eksik veya genişleme için elverişsiz olduğunuz Daha ağır vakalarda, örneğin, teknik uygun olmayabilir.
Diğer doku mühendisliği hücre yapıları için olduğu gibi, fonksiyonel ve morfolojik sonuçları nihai sonuçlar sadece in vivo çalışmalar uzun vadede cevap olabilir. Bir sonraki adımımız viab açısından uzun vadeli hayvan çalışmalarında bizim sonuçlarını analiz etmek olacaktırility ve fizyolojik özellikleri transplantasyon sonrası.
Sunulan teknik anlamı, yalnızca tek bir cerrahi prosedür sonrası in vivo doku genişletme imkanı vardır. Şu anda değerlendirilmekte olan diğer teknikler transplantasyon öncesi in vitro hücrelerin genişleterek tüm bağlıdır. In vitro prosedürler, yüksek maliyetler ile ilişkili gelişmiş laboratuvar personel gerektiren ve zaman alıcı olma olma dezavantajı var. Bu doku veya hücreler ve doku mühendisliği otogreftin hasat arasındaki 2 ay kadar sürebilir; Bu çalışmada tarif edilen tekniğe göre, en az 1 saat karşı.
Gelecekte, sıkıştırılmış kollajen teknikleri kıyılmış doku genişletilebilir ve bu karın duvarı defektleri, diyafragma fıtığı ve kusur kolayca mevcut doku ile yeniden değildir diğer koşulları gibi diğer organlarda kullandı.
yöntem, in vivo olarak genişletmek deri ve mesane mukozasının nakli için tarif edilmektedir. otogreft hazırlama prosedürünün yapılması kolaydır ve sıradan bir cerrahi bir ortamda steril koşullar altında kullanılabilir. otogreft cerrahi işleme direnir ve biyolojik olarak parçalanabilir. otogreftin çekirdek bozulması ve elastikiyet, kalınlık ve porozite gibi diğer özellikleri, hızı ilişkin tercihlerine bağlı olarak farklı biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin oluşan ve hastanın özel ihtiyaçlarına göre yapılabilir. bir klinik ortamda, hasta doku hasat, bir tek kademeli prosedür olarak kompozit otogreftin ve Ototransplantasyon hazırlanmasını uğrayacaktı. Buna ek olarak, hücre içeren bioconstructs tüm parçaları anda FDA onaylıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
