Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES

Published: November 11, 2015 doi: 10.3791/53062
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

Summary

مقاومة الإجهاد هي واحدة من السمات المميزة لطول العمر وكما هو معروف أن تحكم وراثيا. هنا، قمنا بتطوير أسلوب الإنتاجية العالية متحيز للكشف عن الطفرات التي تمنح مقاومة الإجهاد في خلايا ES التي لتطوير نماذج الماوس للدراسات طول العمر.

Introduction

طول العمر له علاقة حميمة مع مقاومة الإجهاد. بشكل عام، والأنواع المعمرة في كثير من الأحيان تبرهن زيادة مقاومة تجاه الضغوطات متعددة، مثل بيروكسيد الهيدروجين، الباراكوات (PQ) والأشعة فوق البنفسجية والحرارة والمعادن الثقيلة 1،2. في المقابل، زيادة الحساسية للإجهاد تميل إلى التنبؤ تقصير العمر الافتراضي و / أو عرضة للأمراض النمط الظاهري أكثر من ذلك. منذ فترة طويلة وتكهن مسح مسار مضادة للأكسدة للعب دورا رئيسيا في منح مقاومة الإجهاد للحيوان. ومع ذلك، مع استثناءات قليلة، دراسات من مجموعة متنوعة من الحيوانات المعدلة وراثيا مع التلاعب في مختلف الانزيمات المضادة للأكسدة (على سبيل المثال، SOD) تشير إلى أن زيادة مستوى أكسدة الانزيمات الكسح لا يزيد عمر أو فترة الصحية 3. وتشير هذه البيانات إلى أن مقاومة الإجهاد سمة احظ باستمرار في الحيوانات طويلة العمر بوساطة مسارات الخلوية الأخرى لم يتم الكشف عنها.

وقد اتخذنا الأمام متحيزنهج الجيني لتحديد الجينات التي عليها تحور، يمكن أن يضفي على النمط الظاهري المقاومة التوتر في الجذعية الجنينية مثقف (ES) الخلايا. خلايا ES تقدم اثنين من المزايا الرئيسية في هذه الدراسة: (1) هي التلاعب الجيني متطورة المتاحة لتعديل جينوم خلايا ES. و (2) أي خلايا ES مقاومة الإجهاد تعافى من الشاشة يمكن استخدامها مباشرة لإنتاج الماوس، مما يسمح للترجمة السريعة في الدراسات الحيوانية كلها لقياس مدى الحياة، ومدى صحة.

في هذا التقرير، وصفنا استخدام خط الخلية C9 ES، التي كانت الأليلات بلم تحت سيطرة عنصر استجابة التتراسيكلين. علاج الدوكسيسيكلين (دوكس) تحول عابر من التعبير عن بلم مما يؤدي إلى زيادة حادث تبادل chromatid الشقيقة. هذا على المدى القصير بلم خروج المغلوب يسمح لتوليد طفرات متماثل بين السكان متغايرة بحيث يمكن أن يتم القبض الطفرات المتنحية لمقاومة الإجهاد في عملية الفرز. نحنكما وصفت استخدام piggyBac (PB) ينقول كما المغير لادخال عشوائيا بولي-A فخ كاسيت (PB-UPA) على التحور الجينات في الجينوم. أصبحت الخلايا مع اختلال الجينات التي بولي-A فخ G418 مقاومة ويمكن استردادها بحيث يمكن تقديم مجموعة من الجينات فخ المسوخ (مكتبة الجينات شرك)، وفحص في وقت لاحق لاستنساخ متحولة التي كانت مقاومة الإجهاد.

يمكن وصف استنساخ مقاومة الإجهاد تعافى من الاختيار بدلا بسرعة عن طريق التقنيات الجزيئية في الشأن عدد من الملاحق (QPCR)، موقع الإدراج (splinkerette PCR)، وهوية الجينات تعطلت (انفجار)، ومستوى التعبير ( RT-QPCR). يمكن remobilized الإدراج PB التي كتبها التعبير عابر MPB transposase في استنساخ لاستعادة تسلسل الحمض النووي من النوع البري، وبالتالي اختبار لفقدان مقاومة الإجهاد. هذه هي وسائل قوية لتأكيد العلاقة السببية من الطفرة التي ينبغي القيام به قبلإلى إنتاج الماوس مكلفة. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا تتعرض لضغوطات فقدت 4،5 تعدد القدرات الخاصة بهم. وهكذا، في هذا البروتوكول، والحفاظ على نسخة طبق الأصل مجموعة من خلايا متحولة، والتي لن يتم التعامل مع الضغوطات أمر بالغ الأهمية لإنتاج الماوس ناجحة.

لدينا مختبر تمت هندستها خط الخلية C9 ES وناقلات PB-UPA، وكلاهما متاح للمحققين آخرين بناء على طلبها. سوف بروتوكول ذكرت هنا يبدأ من جيل دي نوفو مكتبة خلايا المحاصرين الجينات ES مع PB-UPA (الشكل 1A)، تليها الطلاء الاصل واختيار الضغط لعزل الحيوانات المستنسخة مقاومة الإجهاد (الشكل 1B). أثبتنا التحديد مع الباراكوات، مولد الجذور الحرة قوية داخل الخلايا. عمليا، أي مجمع السامة للخلايا أو السم، على سبيل المثال، الضغوطات ER (على سبيل المثال، thapsigargin وtunicamycin)، أكسدة الخلايا العصبية (على سبيل المثال، MPP +، الدوبامين 6-هيدروكسي، وروتينون)، والحرارة، والثقيلةالمعادن (مثل الكادميوم، جنوب شرق)، ويمكن أن تتكيف مع أسلوب لتحديد لطفرات مقاومة منها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المحاصرين جين ES خلية البناء المكتبة عن طريق piggyBac ينقول

  1. إعداد الماوس الأساسي الليفية الجنينية (PMEF) كما مغذيات لزراعة الخلايا ES
    1. ذوبان الجليد قارورة واحدة من ميتوميسين المعطل C PMEF (5.0 × 10 6) في حمام مائي 37 ° C. نقل الخلايا إلى 5 مل من المتوسط ​​الخلايا ES (DMEM تحتوي على 15٪ FBS، 1000 وحدة / مل من العوامل المثبطة اللوكيميا، و 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 ملي الجلوتامين، 55 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، و 25 وحدة / البنسلين مل / الستربتومايسين )، وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 30 مل من المتوسط ​​الخلايا ES تليها توزيع إلى قسمين قوارير T25 (5 مل لكل منهما) واثنين من لوحات 100 ملم (10 مل لكل منهما). احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  2. الثقافة وتوسيع الخلايا C9 ES
    1. ذوبان الجليد قارورة واحدة من الخلايا C9 ES (2.5 × 10 6 الخلايا في 0.5 مل) في 37 ° C حمام الماء ونقلالخلايا في 5 مل من ES المتوسطة الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. نضح طاف و resuspend الخلايا ES في 5 مل من ES المتوسطة الخلية يليه الطلاء في قارورة T25 المغذية. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. استبدال ES المتوسطة الخلية يوميا.
    3. 2 بعد أيام من الثقافة، وينبغي أن تصبح خلايا ES ~ 80٪ متموجة، وعلى استعداد تام للpassaged. غسل الخلايا مع 5 مل من PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) ثم قم بإضافة 2.5 مل قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 2.5 مل المتوسطة الخلايا ES لوقف التربسين. ماصة صعودا وهبوطا 15 مرات لتفتيت كتل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. نضح خلايا وطاف resuspend في 4 مل من ES المتوسطة الخلية. نقل 1 مل من الخلايا لكل 100 ملم لوحة تحتوي على 9 مل ES المتوسطة الخلية؛ إعداد اثنين من 100 ملم لوحات. هذا هو 1: 8 المرور. تغذية الخلايا يوميا مع 10 مل ES المتوسطة الخلية.
  3. إعداد 96-جيدا لوحات المغذية للمكتبة
    1. كما هو موضح في 1.1.1، ذوبان الجليد ثلاث قوارير من ميتوميسين-C المعطل PMEF (تحتوي كل منها على 5 × 10 6 خلايا) وResuspend الخلايا من كل قارورة مع 33.3 مل ES المتوسطة الخلية. الجمع بين الخلايا لانتاج خلايا تعليق 100 مل.
    2. لوحة 100 خلية ميكرولتر لكل بئر على عشر لوحات 96-جيدا. وينبغي إعداد هذه اللوحات المغذية 96-جيدا يوم واحد على الأقل قبل بنقل العدوى إلى خلايا ES C9 ​​مع PB ينقول.
  4. Electroporation للخلايا ES C9 مع ناقلات PB-UPA
    1. يعرض للتريبسين وعدد الخلايا C9 ES موسعة باستخدام عداد الخلية الآلي. يغسل كل 100 ملم لوحة من الخلايا C9 ES مع 10 مل PBS. إضافة 8 مل قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. وقف التربسين بإضافة 2 مل ES المتوسطة الخلية. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وماصة صعودا وهبوطا 15 مرات لتحطيم كتل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي على الفور في 100 x ج لمدة 5 دقائق تليها الشفط طاف.
    3. الخلايا و resuspendالصورة في 10 المتوسطة خلية مل ES وعد خلايا ES باستخدام عدادة الكريات. إعداد ستة أنابيب 15 مل من تعليق خلية تحتوي كل منها على 5 × 10 6 خلايا ES. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend كل بيليه خلية في 0.8 مل PBS.
    4. إعداد ستة cuvettes Electroporation لل(4 ملم الفجوة) التي يتم نقلها من 0.8 مل الخلايا. إلى كل كفيت، إضافة 1 ميكروغرام PB-UPA و 20 ميكروغرام MPB transposase (mPBase)؛ المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. وضع cuvettes على الجليد. أداء Electroporation للمع electroporator باستخدام الإعداد المتسارع في 250 V، 500 μF، واللانهاية أوم.
      ملاحظة: عادة، ثابت الساعة حوالي 10 إلى 12 ميللي ثانية لElectroporation للنجاح، والتي تسفر عن 1500 إلى 2000 G418 transformants مقاومة في 5 × 10 6 خلايا.
    5. استرجاع وتجميع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى قارورة تحتوي على 98 مل T75 ES المتوسطة الخلية. مزج خلايا طيف من قبل pipetting ثم نقل الخلايا إلى خزان (50 مل). لناجي ماصة 12 قناة، ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر إلى 96 جيدا قبل إعداد لوحات التغذية (10 في المجموع). احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    6. بعد 24 ساعة، تغذية الخلايا يوميا مع الطازجة ES المتوسطة الخلية التي تحتوي G418 (150 ميكروغرام / مل) لتحديد لاستنساخ الجينات المحاصرين.
      ملاحظة: عادة كل بئر وتحتوي على حوالي عشرة G418 المستعمرات مقاومة. عندما تنمو هذه المستعمرات إلى حجم كاف (عادة 5-7 أيام)، وسوف يتم نسخ لوحات 96-جيدا (المكتبة) إلى 2 مجموعات لتخزين والاختيار، على التوالي. يتم تعيين كل لوحة في المكتبة باسم 'شبه مكتبة، حتى في هذه الحالة، هناك 10 المكتبات الفرعية.

2. مكتبة النسخ المتماثل

  1. تكرار لوحات ماستر
    1. 24-48 ساعة قبل المستعمرات مقاومة G418 الوصول إلى 50-60٪ confluency، ذوبان الجليد ثلاث قوارير آخر من ميتوميسين المعطل C PMEF على عشر لوحات 96-كذلك مغذيات (راجع القسم 1.3). الجيلاتينإيزي عشر لوحات 96-جيدا التي يحتضنها 0.1٪ الجيلاتين (100 ميكرولتر / جيد) عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 - 30 دقيقة. O / N الحضانة مقبولة.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة في لوحات 96-جيدا من قبل trypsinization. نضح المتوسطة من لوحات 96-جيدا ويغسل مرة واحدة مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم 2+، والمغنيسيوم 2+). إضافة 50 ميكرولتر من قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA، في احتضان 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ لمدة 10 دقيقة. وقف التربسين مع 50 ميكرولتر من ES المتوسطة الخلية. تحطيم كتل الخلايا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 15 مرات مع ماصة الأقنية.
    3. نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية trypsinized إلى الصف المقابل للوحة التغذية (ماجستير) تحتوي بالفعل 150 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية و50 ميكرولتر المتبقية إلى الصف المقابل للوحة مهيلم (طبق الأصل) التي تحتوي بالفعل 150 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية. معالجة كل صف من الخلايا إلى لوحة الماجستير ومتماثلة. احتضان لوحات (التي تحتوي الآن على 200 ميكرولتر جحجم ulture) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 O / N.
      ملاحظة: هناك الآن عشرين لوحات 96-جيدا.
    4. في اليوم التالي تغذية الخلايا مع 100 ميكرولتر الطازجة المتوسطة الخلايا ES تحتوي على 150 ميكروغرام / مل G418. استبدال المتوسطة يوميا حتى الآبار هي 80-90٪ متموجة.
  2. تجميد لوحات ماستر
    1. عندما لوحات رئيسية هي حوالي 80٪ متموجة، يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح (يرجى الرجوع إلى القسم 2.1.2).
    2. إزالة لوحات ووقف رد الفعل التربسين مع 50 ميكرولتر من 2X تجميد المتوسطة (60٪ المتوسطة الخلايا ES، 20٪ FBS، 20٪ DMSO). ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة الأقنية لضمان خلط الصحيح للتجميد المتوسطة.
    3. وضع لوحات 96-جيدا في مربع الستايروفوم مغلقة بإحكام ووضعه في الفريزر -80 درجة مئوية لتخزين ما يصل إلى أربعة أشهر. سوف أربعة أشهر إتاحة الوقت الكافي لإتمام اختيار الإجهاد وتحديد أي الآبار من لوحة ماستر تحتوي على الحيوانات المستنسخة من الفائدة.
      ملاحظة: التخزين في -80 & #176؛ وC أطول من 4 أشهر يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية. يمكن للمرء أن استخدام أنابيب البرد في شكل 96-جيدا التي يمكن تخزينها في مرحلة البخار من النيتروجين السائل لفترة طويلة من التخزين.
  3. إعداد لوحات DNA وأحواض فرعية المكتبة من لوحات طبق الأصل
    1. 24-48 ساعة قبل تكرار كذلك على لوحات DNA وأحواض فرعية المكتبة، وإعداد عشرة 100 ملم لوحات مع ميتوميسين المعطل C PMEF لتجمع شبه مكتبة، وعشرة مهيلم لوحات 96-جيدا لوحة DNA متماثلة. الرجوع إلى القسم 1.3 لإجراء عام.
    2. يعرض للتريبسين الخلايا في لوحات 96-جيدا الاصل (راجع القسم 2.1.2). خلال الخطوة trypsinization 10 دقيقة، نضح الجيلاتين من لوحات DNA واستبدالها مع 150 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية التي تحتوي G418 (150 ميكروغرام / مل). أيضا، إعداد خزان يحتوي على 5 مل من ES المتوسطة الخلية لتجميع و"مكتبات فرعية 'إلى 100 ملم لوحة المغذية.
    3. وبعد trypsinization، والتوقف عن محاولةpsin مع 50 ميكرولتر من الخلايا ES المتوسط ​​صف واحد في وقت واحد باستخدام ماصة 12 قناة. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لتحطيم كتل الخلايا.
    4. نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى الصف المقابل للوحة DNA ونقل 50 ميكرولتر المتبقية إلى الخزان تحتوي على 5 مل ES المتوسطة الخلية. بعد الانتهاء من واحد كامل لوحة 96-جيدا، ونضح وسيلة لوحة المغذية 100 ملم التي يتم نقل الخلايا المجمعة. تصنف هذه الخلايا mutagenized المجمعة ك "مكتبة فرعية.
    5. كرر لتسع لوحات 96-جيدا المتبقية. تغذية لوحات DNA 96-جيدا ولوحات 100 ملم المجمعة الفرعي للمكتبة "يوميا مع ES المتوسطة الخلية التي تحتوي G418 (150 ميكروغرام / مل).
      ملاحظة: هناك الآن عشر لوحات 96-جيدا "DNA"، وعشرة 100 ملم لوحات 'شبه المكتبة.
  4. تجميد لوحات DNA. عندما الخلايا في لوحة DNA هي 80-90٪ متموجة، نضح المتوسطة، وغسل الخلايا مرتين مع 100ميكرولتر PBS وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الحمض النووي الجيني لاحق العزلة 6. وسيتم عرض هذه اللوحات DNA بواسطة PCR لتحديد أي المقابلة بشكل جيد في لوحة 'ماستر' يحتوي على نسخة من الفائدة.

3. الناجم عن دوكسي المسوخ متماثل

  1. تجميد حمامات شبه مكتبة والخلايا مرور لتلقي العلاج الدوكسيسيكلين
    1. 24 ساعة قبل 100 ملم لوحات 'شبه مكتبة "وجود مستعمرات كبيرة بما فيه الكفاية لتحقق 70-80٪ confluency، وإعداد مجموعة من عشرة مهيلم لوحات 100 ملم لتلقي العلاج الدوكسيسيكلين.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة من كل مكتبة فرعية (يرجى الرجوع إلى أقسام 1.4.1 و1.4.2 للحصول على التفاصيل). نقل 5 × 10 6 الخلايا إلى مهيلم 100 ملم لوحة مع الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل)؛ احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. تجميد غير الدوكسيسيكلين المعالجة حمامات الفرعية المكتبة المتبقية في 5 × 10 6 خلايا في قارورة.
  2. خلايا مرور في وجودمن الدوكسيسيكلين لضرب بلم
    1. مرور المكتبات الفرعية في 1: 8 كل 2-3 أيام بحضور الدوكسيسيكلين (1 ميكروغرام / مل) لمدة تصل إلى أسبوعين، وهي الفترة التي دوكس التي يسببها خروج المغلوب من بلم شأنها أن تعزز فقدان تغاير في الخلية السكان، مما يسمح لجيل من المسوخ متماثل.

4. التأكيد على اختيار وعزل النسخ مقاومة

  1. الخلايا المعالجة الدوكسيسيكلين تخضع لاختيار الإجهاد
    1. 24 ساعة قبل الركض الدوكسيسيكلين الخلايا المعالجة لاختيار الإجهاد، وإعداد عشرة مهيلم لوحات 150 ملم، مكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة من كل مكتبة الفرعية التي trypsinization (راجع القسم 1.4.1 و 1.4.2 للحصول على التفاصيل). البذور 6.6 × 10 6 الخلايا على كل لوحة 150 ملم في 30 مل الحجم الكلي الثقافة وتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان الخلايا مع الضغوطات (10 ميكرومتر الباراكوات أو إغفال β المركابتويثانول،في ES المتوسطة الخلية التي تحتوي 7.5٪ الحرارة المعطل FBS) لمدة 7 أيام، وبعد ذلك استبدال العادي المتوسطة الخلايا ES السماح الخلايا على قيد الحياة لتنمو لتصبح مستعمرات للقطف.
    3. اختياري: تجميد اليسار على الخلايا المعالجة الدوكسيسيكلين عند 5.0 × 10 6 خلايا في قارورة.
  2. اختيار المستعمرات مقاومة الإجهاد
    1. بعد إعادة سائل الإعلام العادية لمدة أسبوع، نلاحظ كيف العديد الإجهاد موجودة المستعمرات مقاومة. اعتمادا على عدد من المستعمرات ويمكن الحصول عليها، وإعداد ما يكفي من الآبار مع ميتوميسين المعطل C PMEF على لوحات 96-جيدا يوم واحد مسبقا وفقا لذلك (راجع القسم 1.1 للحصول على التفاصيل).
    2. في يوم قطف، نضح واستبدال المتوسطة في لوحة التغذية 96-جيدا مع 100 ميكرولتر الطازجة المتوسطة الخلايا ES، المكان مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. في هذا الوقت، وإعداد U-أسفل لوحة 96-جيدا مع 50 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA لكل بئر. نضح المتوسطة من 150 ملم لوحة مختارة من التوتر وإضافة البريدحجم التأهيلية من برنامج تلفزيوني.
    3. تعيين micropipette إلى 2 ميكرولتر، و "اختيار" على قيد الحياة المستعمرات في التربسين U-السفلي يحتوي على الآبار، واختيار مستعمرة واحدة لكل بئر. من المقبول السماح لوحة الجلوس في RT حتى تم انتقاؤها العدد المطلوب من المستعمرات. ثم، واحتضان لوحة أسفل U في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: عادة، ونحن نأخذ 1 ساعة لاختيار 96 المستعمرات.
    4. وقف رد الفعل التربسين صف واحد في وقت واحد مع 50 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية باستخدام ماصة الأقنية. ماصة صعودا وهبوطا 15 مرات للحصول على تعليق خلية واحدة ونقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى الصف المقابل للوحة المغذية التي تحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من ES المتوسطة الخلية. استكمال نقل لوحة كاملة. خلايا الثقافة O / N في 200 ميكرولتر. في صباح اليوم التالي، نضح المتوسطة واستبدالها مع 100 ميكرولتر ES المتوسطة الخلية.
  3. تكرار لوحات 96-جيدا
    1. عندما الآبار في المستعمرات التقطت هي 80-90٪ conflueالإقليم الشمالي، وتكرار إلى صفيحتين مطابقة، واحدة للعزل الحمض النووي والآخر للخلايا احتياطية. هذه اللوحات هي مهيلم ولا تحتوي على ميتوميسين المعطل C PMEF.
    2. نضح المتوسطة، ويغسل مع 100 ميكرولتر PBS. إضافة 50 ميكرولتر 0.25٪ التربسين-EDTA إلى كل بئر، في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وقف التربسين مع 150 ميكرولتر المتوسطة الخلايا ES، مزيج من قبل pipetting، ونقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى الصف المقابل لاثنين من لوحات 96-جيدا. تغيير المتوسطة يوميا.
    3. عندما لوحات هي 80-90٪ متموجة، وتجميد مجموعة واحدة من لوحات ك "احتياطية" (راجع القسم 2.2 للحصول على التفاصيل). مجموعة أخرى من لوحات يتم توسيع، كما هو مبين أدناه.
  4. توسيع خلايا لعزل الحمض النووي الجيني
    1. إعداد تعليق خلية واحدة في لوحة DNA 96-جيدا (يرجى الرجوع إلى 2.1.2 للحصول على التفاصيل).
    2. نقل تعليق خلية من كل بئر على حدة من لوحة 96-جيدا إلى بئر من 24-جيدا لوحة (4 الكل) باستخدام ميكرopipette. ضمان عدم وجود التلوث عبر أي الخلايا، كما المستعمرات اختار 'هي' نسيلي "في الأصل. خلايا الثقافة في 0.5 مل ES المتوسطة الخلية، وتغيير المتوسطة يوميا حتى الآبار هي 80-90٪ متموجة.
      ملاحظة: لوحة 24-جيدا تسمح العائد كافية من الحمض النووي الجيني لتحليل PCR.

5. التعرف على PB مواقع الإدراج والجينات المحاصرين

  1. عزل الحمض النووي الجيني من 24 لوحة جيدا: الخلايا ليز في 24 لوحة جيدا وعزل الحمض النووي الجيني خالية من الحمض النووي الريبي.
  2. أداء Splinkerette PCR (SpPCR) لتوليد شظايا تسلسل المرافقة الموقع التكامل ينقول PB كما هو موضح 7،8.
    ملاحظة: SpPCR هو عملية لمدة خمسة أيام، على الرغم من التدريب العملي على الوقت كل يوم هو الحد الأدنى.

6. تحليل الوراثية من النسخ المسخ

  1. تحديد الماجستير جيدا وتنقية نسخة من الفائدة.
    1. عندما كان موقع التكامل PBمعين، تصميم التمهيدي إلى الأمام المنبع من موقع التكامل للاستخدام مع التمهيدي العكسي PB (على سبيل المثال، PB3'-1) 8 وشاشة لوحة DNA المقابلة لنفس الفرعي للمكتبة "من الذي اختار استنساخ مقاومة الإجهاد. نتوقع أن نجد جيدا إيجابي واحدة فقط عبر كامل لوحة DNA 96-جيدا. ذوبان الجليد هذه البئر على وجه الدقة من لوحة "ماستر" لوحة 24-جيدا على مغذيات وتنمو الخلايا حتى 80-90٪ confluency.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، وهذا جيد يحتوي على خليط من الحيوانات المستنسخة المحاصرين الجينات.
    2. عندما لوحة 24-جيدا هي 80-90٪ متموجة، يعرض للتريبسين الخلايا وخلايا ES 1000 لوحة في لوحة التغذية 100 ملم (ضمان تعليق خلية واحدة). مرور الخلايا المتبقية في قارورة T25 على مغذيات للتوسع. تجميد الخلايا من القارورة T25 عندما المستعمرات هي 80-90٪ متموجة. تجميد 4 قوارير T25 في قارورة ما يعود المنبثقة.
    3. السماح للمستعمرات أن ينمو لمدة 7 أيام، ثم اختيار 96 المستعمرات إلى 96 جيدا الحديدإيدير لوحة. الرجوع إلى القسم 4.2 لاختيار الإجراء. تكرار لوحة عندما جاهزة في لوحة "DNA" وتجميد البعض '2 الثانية -master' لوحة (راجع القسم 2.2 لتجميد).
    4. السماح المستعمرات لتصل إلى 80-90٪ confluency. شاشة لوحة DNA للعثور على الآبار التي تحتوي على استنساخ تنقيته من الفائدة. توسيع الخلايا من 96-جيدا لوحة 2 الثانية -master إلى 24 جيدا وبعد ذلك إلى قارورة T25 (كل شيء على مغذيات). تجميد 4 قوارير T25 في قارورة.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، خط خلية المحاصرين الجين هو نسيلي، ولم يتعرض إلى الإجهاد، ومناسبة لإنتاج الماوس.
  2. تحديد عدد PB الإدراج: أذاب قارورة واحدة من خط خلية مقاومة الإجهاد وتوسيع الخلايا في قارورة T25 مهيلم. عزل الحمض النووي الجيني والتحقق من وجود عدد نسخة من ينقول PB. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق QPCR استهداف الجين بالنيوميسين.
  3. قياس مستوى التعبير الجيني: بعد confirming هناك حدث واحد التكامل PB في خط خلية من الاهتمام، وقياس مستوى التعبير عن الجينات محاصرين من قبل RT-QPCR باستخدام تحقيقات TAQMAN محددة لكل الجينات.
  4. تسلسل مرنا متحولة: إنشاء amplicon كدنا] بواسطة PCR باستخدام الصلب التمهيدي المنبع إلى اكسون والصلب التمهيدي المصب لتسلسل لصق متقبل من فخ الجينات الكاسيت. تسلسل جزء كدنا] للتأكيد على أن الربط المتوقع يحدث في الجين المحاصرين.
  5. إعادة تعبئة وينقول piggyBac لاختبار العلاقة السببية بين الجينات المحاصرين ومقاومة الإجهاد.
    1. 24-48 ساعة قبل ذوبان الخلايا لإعادة تحشد PB، ذوبان الجليد وصفيحة DR4 مغذيات على T25 واحد واثنين من قارورة 100 ملم لوحات. يوم واحد على الأقل بعد ومطلي مغذيات DR4 على قارورة T25، ذوبان الجليد قارورة واحدة من خط الخلية التي تحتوي على الإدراج PB ولوحة الخلايا في قارورة T25 التي تحتوي على مغذيات DR4. تنمو الخلايا في خلية ES المتوسطةلمدة 48 ساعة، وتغيير المتوسطة يوميا.
    2. إعداد تعليق خلية واحدة من خلايا ES. عد الخلايا مع عداد خلية الآلي، ونقل 5.0 × 10 6 خلايا ES لأنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج، و resuspend الخلايا في 800 ميكرولتر PBS. نقل تعليق إلى 4 ملم كفيت.
    3. إضافة 20 ميكروغرام mPBase بورو إلى كفيت، ومزيج من قبل pipetting، والخلايا electroporate (راجع القسم 1.4 للحصول على التفاصيل). توزيع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على اثنين من 100 ملم لوحات DR4 المغذية. خلايا الثقافة O / N في ES المتوسطة الخلية.
    4. في صباح اليوم التالي، تغذية الخلايا مع ES المتوسطة مع / مل بوروميسين والثقافة الخلايا 1 ميكروغرام لمدة 48 ساعة. سحب اختيار بوروميسين والاستمرار في ثقافة الخلايا لمدة 5 أيام. عندما المستعمرات هي كبيرة بما يكفي لقطف، واختيار في لوحة التغذية 96-جيدا (راجع القسم 4.2).
    5. عندما وصلت إلى خلايا التقطت 80-90٪ confluency، وتقسيم 1/6 عشر من لوحة إلى لوحة DNA و06/01 عشر للرريأكلون في لوحة G418، وترك 2/3 طلقة من الخلايا في لوحة أصلية ليتم تجميدها (راجع القسم 2.2 لتجميد).
    6. الثقافة لوحة DNA في الخلايا ES المتوسطة لعزل الحمض النووي في وقت لاحق، وصفيحة G418 في 150 ميكروغرام / مل G418 لاختبار لفقدان المقاومة النيوميسين. الآبار مع عدم وجود خلايا قابلة للحياة بعد 72-96 ساعة في الثقافة التي تحتوي على G418 تشير إلى إعادة تحشد ناجحة للاحتباس الجينات PB ينقول.
    7. وسيتم فحص الآبار المقابلة في لوحة "DNA" من قبل PCR لتأكيد تمت إزالة ينقول PB. عندما لوحة DNA 90٪ متموجة، عزل الحمض النووي الجيني في 96-جيدا شكل لوحة (4) لفحص PCR لاستعادة تسلسل من النوع البري وغياب الجدد IRES كوسيلة لتأكيد الارتداد.
    8. ذوبان الجليد الآبار مطابقة من لوحة ماستر لوحة 24-جيدا والتوسع في قارورة T25 (مع كل مغذيات). تجميد أربع عبوات في T25 قارورة كما احتياطية.
    6. 7. الجيل ماوس المسوخ

    1. استعادة خلايا ES مقاومة من لوحات رئيسية واستخدامها لحقن الجنين لتوليد الوهم. يتم حقن حوالي 15-20 خلايا ES إلى الفردية C57BL / 6 الكيسة. نقل 15 الكيسات الأريمية في الماوس إلى رحم الأنثى pseudopregnant (سلالة ICR). تتزاوج الوهم الذكور (المشار إليها بواسطة ES خلايا محددة آغوطي لون المعطف) المستخرجة من القمامة مع العديد من الشباب عذراء C57BL / 6J الإناث لاختبار خط نقل الجرثومية، وإلى بناء مستعمرة فئرانا معدلة وراثيا.
    2. عزل والخلايا الليفية الجلد الذيل اختبار من الفئران متحولة F1 والبرية من نوع littermate عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) مستوى ومقاومة الباراكوات 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في تجربة الطفرات نموذجية، ويتكون ترنسفكأيشن ما مجموعه 3 × 10 7 خلايا ES مع PB-UPA وMPB transposase. وتتلخص أعداد خلايا ES-المحاصرين الجينات المولدة في تجربتين مستقلة في الجدول 1. وكفاءة الجينات انحباس حوالي 0.04٪. مكتبات الجينات فخ مجتمعة تحتوي على 22400 المسوخ المستقلة، حول التغطية الكاملة لجينوم الفأر (23،000 الجينات الترميز). ويمكن تحقيق التغطية المفرطة عن طريق توليد المزيد من المسوخ من خلال الطفرات المتكررة و / أو توسيع نطاق العملية.

لأن المكتبات الجينات فخ تحتوي على الطفرات العشوائية، فمن غير الممكن التنبؤ بعدد من المسوخ امتلاك النمط الظاهري المقاومة الإجهاد. تم تنفيذ اثنين من التحديدات مستقلة لمقاومة PQ؛ فحص جنبا إلى جنب من 22440 الجينات فخ الطفرات مستقلة كشف 17 الطفرات التي تمنح مقاومة الخلوية لPQ (0.08٪) (الجدول 1).

<ص الطبقة = "jove_content"> لقد تنقيته 3 استنساخ متحولة، وPigl، Tiam1، وRffl، من لوحات رئيسية لمزيد من التحليل والإنتاج الماوس. استميلت الخلايا مع طفرة Rffl متخالف بنجاح لإنتاج ذرية متماثل عن طريق ضرب بلم. ومع ذلك، فإننا فشلت في تحقيق أي طفرات متماثل من Pigl وTiam1 المسوخ، ويفترض بسبب خلية الفتك المرتبطة زيجوت متماثلة الألائل. وأكد مقاومة الإجهاد من هذه الحيوانات المستنسخة تنقيته باستخدام 2 أنواع مختلفة من الضغوطات: إغفال 2-المركابتويثانول (2-ME) وPQ (الشكل 2). على إزالة PB من هذه الحيوانات المستنسخة، قد فقدت المرتبطة مقاومة الإجهاد النمط الظاهري أيضا (الشكل 2)، مؤكدا أن هذا الجين فخ الطفرات هي العامل السببي. توصيف استنساخ تعافى من لوحات رئيسية أمر بالغ الأهمية لأنه يستبعد مؤشر ستوكاستيك الآفة خلال اختيار الإجهاد هو سبب النمط الظاهري الملحوظ.

من 3خلايا ES متحولة يجري إدخالها في الكيسات الأريمية لإنتاج الماوس (الجدول 2)، 2 خطوط (Pigl وTiam1) تظهر انتقال سلالة الجرثومية. حقن Rffl تنتج واحد فقط الوهم الإناث الذي لم يكن العدد الأمثل من الوهم لتبدأ. وهكذا، فشل انتقال سلالة الجرثومية من Rffl من المرجح الوهم غير كفء بسبب واحد. اختبرنا النمط الظاهري الخلوية من الخلايا الليفية الجلد معزولة عن فئرانا معدلة وراثيا Pigl وتبين أنها حافظت على مستوى منخفض من أنواع الاكسجين التفاعلية الذاتية (ROS)، وكذلك مقاومة الإجهاد لPQ (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. ES الطفرات الخلية واختيار الإجهاد. (A) PB-UPA النواقل. غير منحازة بوليا (UPA) فخ ناقلات تتألف من متقبل لصق (SA)، هرمون النمو البقري بولي أدينيلات إشارة (PA)، phosphogتم استنساخ lycerate كيناز (PGK) المروج، ناقلة الفسفات بالنيوميسين (المحافظين الجدد)، الداخلية دخول موقع الريباسي (IRES)، ولصق المانحة (SD) مع الاصطناعي ATG (في 3 إطارات قراءة مختلفة) في ينقول piggyBac، ويحيط بها 3 ' و 5 'تكرار محطة الطويلة (LTR). (B) الطفرات عشوائية من خلايا ES واختيار لاستنساخ مقاومة الإجهاد. خلايا ES و transfected المشترك بواسطة الصعق الكهربائي مع PB-UPA وmPBase يليه الطلاء على لوحات 96-جيدا. وقد تم اختيار الجينات المستنسخة محاصرين من قبل المقاومة G418. مرة واحدة متموجة، تم تقسيمهم إلى 2 مجموعات النسخ المتماثلة. تم تقسيم مجموعة واحدة متماثلة إلى مزيد من اثنين من نصف لعزل DNA واختيار الإجهاد عن طريق الباراكوات (PQ)؛ مجموعة النسخ المتماثلة الأخرى (الماجستير) تم تجميد أسفل. تم تحليل الباقين على قيد الحياة مستعمرات الخلايا ES تعافى من علاج التوتر جزيئيا لإدخال PB بواسطة SP-PCR. ثم تم تصميم الاشعال لفحص DNA لوحة المتماثلة من البئر التي تحتوي على sibliيمكن أن يكون موجودا نانوغرام PQ R استنساخ على لوحة رئيسية. هذه الخلايا هي لمقاومة الإجهاد فحص على الضغوطات المختلفة وللإنتاج الماوس. تعديل من الفرخ وآخرون. 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. مقاومة الإجهاد في خلايا ES متحولة. (A) المقاومة لل2-المركابتويثانول (2-ME) الانسحاب. (B) المقاومة للالباراكوات (PQ). المعروضة هي من النوع البري الخلايا الأبوية ES (C9: أصفر)، عنصر تحكم ES استنساخ خلايا مقاومة للإجهاد، (4C11: أحمر)، تعافى من الدراسة السابقة 5، وثلاثة استنساخ الجينات فخ (الرمادي). تعرض الخلايا التأكيد على العلاج لمدة يومين، وبعد ذلك تم حساب عدد خلايا قابلة للحياة. < م> الزيجوت Pigl، Tiam1، وRffl. (PB / +: رمادي غامق) المقاومة المعرض إلى كل من هذه الضغوطات أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل Rffl (PB / PB: أسود) يحمل مقاومة الإجهاد أقوى مقارنة الزيجوت. فقدت المقاومة إلى كل الضغوطات، وتم إلغاء الإدراج PB (+ / +: رمادي فاتح). أشرطة الخطأ تمثل SD من المتوسط ​​(ن = 4). * P <0.001، P = # 0.01 بين استنساخ الجينات فخ والبرية من نوع C9 الوالدين، وتقييمها من قبل الطالب ر -test. تشكيل مستعمرة (C) ES الخلية تحت PQ (10 ميكرومتر) العلاج. كانت قادرة على تشكيل مستعمرات في الثقافة تحت العلاج PQ في حين تم تخفيض عدد وحجم المستعمرات من النوع البري استنساخ بشكل ملحوظ مقاومة للإجهاد استنساخ ES. تعديل من الفرخ وآخرون. 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل (3)
الشكل 3. توصيف Pigl PB / + الخلايا الليفية. (A) أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) المستوى. كانت ملطخة الخلايا الليفية الجلد الذيل معزولة من النوع البري (WT) وPigl PB / + الفئران مع CM-DCFCA وتطبيع مضان ضد هويشت. وأعرب عن محتوى ROS كوحدة ومضان النسبي (RFU). تم تقييم قيمة P من قبل اثنين من الطلاب الذيل تي -test (ن = 8). (B) PQ المقاومة. تعرضت الخلايا الليفية الجلد ذيل من النوع البري (WT) وPigl PB / + الفئران إلى 4 ملي PQ عن 6 ساعات، وبعد ذلك تم قياس الجدوى من الخلايا عن طريق فحوصات MTT. تم حساب النسبة المئوية للخلايا الحية بعد العلاج PQ من نسبة الامتصاصية التي تم الحصول عليها من م PQ المعاملةLLS وذلك من خلايا الامم المتحدة والمعالجة. تم تقييم قيمة P التي كتبها طالب الذيل واحدة تي -test (ن = 8). تعديل من الفرخ وآخرون. 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكتبة المكتبات الفرعية سلالة خلايا ES عدد الجينات المحاصرين استنساخ عدد الحيوانات المستنسخة PQ R
1 C9PA01 - C9PA10 C9 (بلم تيت / تيت) 9000 7
2 C9PA11 - C9PA20 C9 (بلم تيت / تيت) 13440 10
الإجمالي الكلي 22440 17

الجدول 1. PiggyBac الجينات فخ بناء مكتبة واسترداد PQ استنساخ المقاومة. معدلة من الفرخ وآخرون. 7.

</ tr>
ES استنساخ الخلايا حقن عدد الوهم استردادها انتقال سلالة الجرثومية *
Pigl PB / Pigl + 4 نعم فعلا
Tiam1 PB / Tiam1 + 2 نعم فعلا
Rffl PB / Rffl + 1 لا

الجدول 2. جيل من الفئران. معدلة من الفرخ وآخرون. 7.

وأكد * انتقال سلالة الجرثومية بالوراثة من الجينات فخ أليل الكشف عنها بواسطة PCR التنميط الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture
500-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU05RE
250-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU02RE
50-ml Steriflip-GV filters EMD Millipore SE1M179M6
KO DMEM Life Technologies 10829-018
DMEM Sigma-Aldrich D6429
FBS Tissue Culture Biologicals 104
Heat Inactivated FBS Sigma-Aldrich F4135-500
LIF EMD Millipore ESG1107
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Pen/Strep Life Technologies 15140148
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) Sigma-Aldrich 856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX Sigma-Aldrich D2650
EmbryoMAX 0.1% gelatin EMD Millipore ES006B
DPBS/Modified HyClone SH30028.02
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
T25 Flask Corning 353108
T75 flask Corning 353135
100-mm  plate Corning 353003
150-mm  plate Corning 430599
96-well  plate Corning 3585
96-well U-bottom plate Corning 3799
24-well plate Corning 3526
50-ml reservoir  Corning 4870
15-ml tubes VWR International, LLC 82050-276
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts EMD Millipore PMEF-NL
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts Applied StemCell ASF-1001
Mitomycin C Fisher BioReagents  BP25312
Geneticin (G418) Life Technologies 11811-023
Doxycycline Fisher BioReagents  BP26531
Cryotubes Thermo Scientific 377267
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5702
TC10 cell counter Bio-Rad
Counting Slides (for TC10) Bio-Rad 1450011
Electroporation
Gene Pulser Xcell Bio-Rad 1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) Bio-Rad 1652088
Molecular Biology
Thermal Cycler Eppendorf Mastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit B Qiagen 158745
Topo-TA Cloning kit Life Technologies  450030
High Capacity cDNA synthesis kit Applied Biosystems 4368814
NaCl Fisher BioReagents  BP358-212
100% ethanol Decon Laboratories, Inc. 2716
Double Processed Tissue Culture Water Sigma-Aldrich W3500
Sau3A1 New England BioLabs R0169L
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202T
EcoRV New England BioLabs R3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric Acid Fisher BioReagents  A144-212
EDTA Sigma-Aldrich E5134
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L5777
Proteinase-K Fisher BioReagents  BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad 170-4469EDU
LE Agarose  GeneMate E3120500
Ethidium Bromide  Fisher BioReagents  BP1302
100 BP DNA Ladder New England BioLabs N3231S
1 Kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S
2-log DNA Ladder New England BioLabs N3200L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 105، ومقاومة الإجهاد، وطول العمر، والخلايا الجذعية الجنينية، piggyBac، وعلم الوراثة إلى الأمام، وعلم الجينوم وظيفية، الباراكوات، والماوس.
المنهج الوراثي إلى الأمام للكشف عن الإجهاد الجينات المقاومة في الفئران - شاشة عالية الإنتاجية في خلايا ES
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick,… More

Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick, W. S. Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice — A High-throughput Screen in ES Cells. J. Vis. Exp. (105), e53062, doi:10.3791/53062 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter