Summary
Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.
Introduction
Levensduur heeft een intieme relatie met stressbestendigheid. In het algemeen, langlevende soorten vaak aantonen verhoogde weerstand tegen meerdere stressoren, zoals waterstofperoxide, paraquat (PQ), UV, hitte en zware metalen 1,2. Daarentegen verhoogde stressgevoeligheid neigt kortere levensduur en / of een ziekte-gevoelig fenotype voorspellen. De anti-oxidant scavenging route is lang gespeculeerd een belangrijke rol spelen bij het verlenen van stressresistentie aan het dier. Echter, met weinig uitzonderingen, studies van verschillende transgene dieren manipulaties in diverse anti-oxidant enzymen (bijvoorbeeld SOD) geven aan dat het verhogen van het oxidatiemiddel scavenging enzymen niet verhoogt levensduur of de gezondheid overspanning 3. Deze gegevens suggereren dat de stressresistentie eigenschap consistent waargenomen in langlevende dieren wordt gemedieerd door andere cellulaire routes nog worden blootgesteld aan.
We namen een onbevooroordeelde vooruitgenetische benadering genen die bij gemuteerd, kan een stress-resistentie fenotype in gekweekte embryonale stamcellen (ES) cellen verlenen identificeren. ES-cellen bieden twee belangrijke voordelen in deze studie: (1) verfijnde genetische manipulaties zijn voor het genoom van de ES-cellen te wijzigen; en (2) stress resistente ES-cellen gewonnen uit het scherm kan direct worden gebruikt voor muizen produktie, waardoor een snelle vertaling in geheel dierproeven levensduur en gezondheid overspanning meten.
In dit rapport beschrijven we het gebruik van C9 ES cellijn, waarbij de Blm allelen werden onder controle van een tetracycline responsieve element. Behandeling van doxycycline (DOX) kortstondig uitgeschakeld de uitdrukking van Blm leidt tot verhoogde incident van zusterchromatide uitwisseling. Deze korte-termijn Blm knock-out termijn voor het genereren van homozygote mutaties in de populatie heterozygote zodat recessieve mutaties voor stressbestendigheid kan worden meegenomen in de screening. Weook beschreven het gebruik van piggyBac (PB) transposon als mutageen willekeurig invoegen poly-A trap cassette (PB-UPA) te muteren genen in het genoom. Cellen met verstoring van een gen door de poly-A val werd G418 resistente en kon worden hersteld, zodat een verzameling van gen-trap mutanten (gen-trap bibliotheek) zou kunnen worden gemaakt, en vervolgens gescreend op mutante klonen die stressbestendig zijn.
Stress resistente klonen gewonnen uit de selectie kan vrij snel worden gekarakteriseerd door moleculaire technieken ten aanzien van het aantal inserties (qPCR), de plaats van invoeging (splinkerette PCR), de identiteit van het verstoorde gen (BLAST) en het expressieniveau ( RT-qPCR). De PB insertie kan remobilized door transiënte expressie van MPB transposase in de kloon met het wild-type DNA-sequentie te herstellen en aldus testen voor het verlies van stressresistentie. Dit zijn krachtige manieren om causaliteit van de mutatie te bevestigen dat vooraf moet worden gedaandure muis productie. Eerdere studies toonden aan dat cellen blootgesteld aan stressoren verloren hun pluripotentie 4,5. Dus, in dit protocol, het behoud van een replica set van gemuteerde cellen, die niet zou worden behandeld met stressoren is van cruciaal belang voor een succesvolle muis productie.
Ons laboratorium heeft de C9 ES-cellijn en de PB-UPA vector ontworpen, beide zijn beschikbaar voor andere onderzoekers op verzoek. Het protocol hier gerapporteerde start door het genereren van de novo bibliotheek van gen-gevangen ES-cellen met PB-UPA (figuur 1A), gevolgd door replica plating en stress selectie stress resistente klonen (figuur 1B) te isoleren. We toonden de selectie met paraquat, een krachtige vrije radicalen generator in de cellen. Vrijwel elke cytotoxische verbinding of toxine, bijvoorbeeld ER stressoren (bijvoorbeeld thapsigargin en tunicamycine), neuronale oxidant (bijv MPP +, 6-hydroxy dopamine en rotenon), hitte en zwaremetalen (bijvoorbeeld Cd, Se), kunnen worden aangepast om de werkwijze te selecteren voor respectieve resistente mutanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.-Gene gevangen ES Cell Bibliotheek constructie met piggyBac Transposon
- Bereid primaire muis embryonale fibroblasten (PMEF) als voeders voor ES celcultuur
- Dooi een flacon van mitomycine-C geïnactiveerd PMEF (5,0 x 10 6) in een 37 ° C waterbad. Breng de cellen in 5 ml ES-cel medium (DMEM met 15% FBS, 1000 eenheden / ml van leukemie remmende factoren, 100 uM niet-essentiële aminozuren, 2 mM glutamine, 55 pM 2-mercaptoethanol en 25 eenheden / ml penicilline / streptomycine ) en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 30 ml ES-celmedium gevolgd door verdelen in twee T25 kolven (elk 5 ml) en twee 100-mm platen (elk 10 ml). Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Cultuur en uitbreiden C9 ES-cellen
- Ontdooien één flacon C9 ES-cellen (2,5 x 10 6 cellen in 0,5 ml) in een 37 ° C waterbad decellen in 5 ml ES-celmedium. Centrifugeren bij 100 g gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant en resuspendeer ES-cellen in 5 ml ES-celmedium gevolgd door uitplaten in de feeder T25 kolf. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Vervang de ES-cel medium dagelijks.
- Na 2 dagen van cultuur, zou de ES-cellen ~ 80% confluent worden, en zijn klaar om te worden gepasseerd. Was de cellen met 5 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en voeg 2,5 ml voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. Voeg 2,5 ml ES-cel medium tot trypsine te stoppen; pipet op en neer 15 keer te breken cel klonten. Centrifugeren bij 100 g gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in 4 ml ES-celmedium. Breng 1 ml cellen per 100 mm plaat met 9 ml ES-cel medium; bereiden twee 100-mm platen. Dit is een 1: 8 passage. Voeden de cellen dagelijks met 10 ml ES-cel medium.
- Maak 96-well platen feeder voor bibliotheek
- Zoals beschreven in 1.1.1, ontdooien drie flesjes van mitomycine-C geïnactiveerd PMEF (elk 5 x 10 6 cellen) en resuspendeer cellen van iedere flacon met 33,3 ml ES-cel medium. Combineer cellen om een 100-ml celsuspensie verkregen.
- Plaat 100 gl cellen per putje op tien 96-well platen. Deze 96-well platen feeder ten minste één dag toegericht transfecteren C9 ES-cellen met PB transposon.
- Elektroporatie van C9 ES cellen met het PB-UPA vector
- Trypsinize en tel de uitgebreide C9 ES-cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller. Was iedere 100-mm plaat van C9 ES-cellen met 10 ml PBS. Voeg 8 ml voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min.
- Stoppen met trypsine door toevoeging van 2 ml ES-cel medium. Breng de celsuspensie om een 15 ml buis en pipet op en neer 15 keer uit elkaar te breken cel klonten. Onmiddellijk centrifugeren bij 100 xg gedurende 5 minuten, gevolgd door afzuigen van de supernatant.
- Resuspendeer cels in 10 ml ES-celmedium en tel de ES-cellen met een hemocytometer. Neem zes 15-ml buisjes celsuspensie elk 5 x 10 6 ES-cellen. Centrifugeren bij 100 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer elke cel pellet in 0,8 ml PBS.
- Neem zes elektroporatie cuvetten (4 mm tussenruimte) waaraan 0,8 ml van de cellen worden overgebracht. Aan elke cuvet, voeg 1 ug PB-UPA en 20 ug MPB transposase (mPBase); meng voorzichtig door en neer te pipetteren. Zet de cuvetten op ijs. Het uitvoeren van elektroporatie met een electroporator met de exponentiële instelling bij 250 V, 500 uF, en oneindigheid ohm.
OPMERKING: Gewoonlijk is de tijdconstante is ongeveer 10 tot 12 msec voor een succesvolle elektroporatie, waarbij ongeveer 1500 tot 2000 G418 resistente transformanten per 5 x 10 6 cellen opleveren. - Ophalen en bundelen de getransfecteerde cellen om een T75 kolf met 98 ml ES-cel medium. Meng de cellen door voorzichtig pipetteren en breng cellen aan een reservoir (50 ml). Onsing een 12-kanaals pipet 100 pi cellen per putje aan de eerder bereide 96-well platen feeder (10 in totaal). Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2.
- Na 24 uur, voeden de cellen dagelijks vers ES-celmedium bevattende G418 (150 ug / ml) om te selecteren op klonen gen gevangen.
OPMERKING: Typisch elk goed zal ongeveer tien G418 resistente kolonies bevatten. Wanneer deze kolonies groeien tot voldoende grootte (gewoonlijk 5-7 dagen), zullen de 96-well platen (bibliotheek) worden gerepliceerd in 2 sets respectievelijk opslag en selectie. Elke plaat in de bibliotheek wordt aangeduid als "sub-bibliotheek, dus in dit geval zijn er 10 sub-libraries.
2. Bibliotheek Replication
- Repliceren de Meester platen
- 24-48 uur voorafgaand aan het G418 resistente kolonies bereiken 50-60% confluentie ontdooien nog drie flesjes mitomycine-C geïnactiveerd PMEF op tien 96-well platen en feeders (zie paragraaf 1.3). Gelatineize tien 96-well platen incuberen met 0,1% gelatine (100 pl / putje) bij 37 ° C gedurende ten minste 15 - 30 min; O / N incubatie acceptabel.
- Bereid enkelvoudige celsuspensies in 96-wells platen met trypsine. Zuig medium van 96-well platen en was eenmaal met een gelijk volume PBS (zonder Ca2 +, Mg2 +). Voeg 50 ul van voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA, incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 10 min. Stop trypsine met 50 pi ES-celmedium. Opsplitsen van de cel klonten door en neer te pipetteren 15 keer met de meerkanaalspipet.
- Overdracht 50 ul trypsine behandeld celsuspensie om de bijbehorende rij van de feeder plaat (Master) reeds met 150 ul ES-celmedium en de resterende 50 pl aan de bijbehorende rij van de gegeleerde plaat (replica) reeds met 150 ul ES-celmedium. Verwerk elke rij van cellen aan een master en replica plaat. Incubeer de platen (nu met een 200 gl cULTUUR volume) bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
LET OP: Er zijn nu twintig 96-well platen. - De volgende dag voeden de cellen met 100 ul vers ES-celmedium bevattende 150 ug / ml G418. Vervang het medium dagelijks tot de putten 80-90% confluent.
- Bevriezen van de Master platen
- Wanneer de meester platen zijn ongeveer 80% confluent, trypsinize de cellen zoals beschreven (zie paragraaf 2.1.2).
- Verwijder de platen trypsine en stop de reactie met 50 ul 2x invriesmedium (60% ES-celmedium, 20% FBS, 20% DMSO). Pipet op en neer 10 keer met een multichannel pipet om goede menging van het vriesmedium te waarborgen.
- Zet de 96-well platen in een dicht afgesloten storaxschuimdoos en plaats deze in -80 ° C vriezer gedurende vier maanden opslag. Vier maanden zal genoeg tijd om de stress selectie te voltooien en om te bepalen welke putten uit de Master plaat bevat de klonen van belang mogelijk te maken.
OPMERKING: Opslag bij -80 & #176; C langer dan 4 maanden resulteert in achteruitgang van cellevensvatbaarheid. Men kan cryo-buizen in 96-well formaat dat kan worden opgeslagen in de dampfase van vloeibare stikstof gedurende langere opslag gebruiken.
- Bereid DNA borden en sub-bibliotheek zwembaden uit kopie platen
- 24-48 uur voorafgaand aan verdere replicerend DNA borden en sub-bibliotheekverzamelingen bereiden tien 100 mm platen met mitomycine-C geïnactiveerd PMEF de subbibliotheek pool, en tien verstijfseld 96-well platen voor DNA plate repliceert. Zie paragraaf 1.3 voor de algemene procedure.
- Trypsinize de cellen in de 96-well replica platen (zie paragraaf 2.1.2). Tijdens de 10 minuten behandeling met trypsine stap aspireren gelatine van DNA platen en vervangen door 150 ul ES-cel medium dat G418 (150 ug / ml). Ook Bereid een reservoir met 5 ml van ES-celmedium voor pooling van de 'sub-bibliotheken in de 100-mm plaat feeder.
- Volgende trypsinisatie, stopt proberenpsin met 50 pi ES-celmedium één rij tegelijk met behulp van een 12-kanaals pipet. Pipet op en neer 10 keer uit elkaar te breken cel klonten.
- Breng 50 pl van de celsuspensie met de corresponderende rij van het DNA bord en draagt de resterende 50 pl het reservoir met 5 ml ES-celmedium. Na het voltooien van een volle 96-well plaat, Zuig het medium van een 100-mm feeder plaat waarop de samengevoegde cellen worden overgebracht. Deze samengevoegde gemutageniseerde cellen worden aangeduid als "sub-library.
- Herhaal dit voor de overige negen 96-wells platen. Voer de 96-well platen en DNA 100-mm gepoolde "sub-library 'platen per dag bij ES-cel medium dat G418 (150 ug / ml).
LET OP: Er zijn nu tien 96-well 'DNA' platen, en tien 100-mm 'sub-bibliotheek' platen.
- Bevriezen van de DNA-platen. Wanneer de cellen in het DNA plaat zijn 80-90% confluent, zuig het medium, was de cellen tweemaal met 100gl PBS en bewaar bij -20 ° C voor latere genomisch DNA isolatie 6. Deze DNA-platen zullen worden gescreend door PCR te identificeren die goed overeenkomstige in de 'Master' plaat bevat de kloon van belang.
3.-doxycycline geïnduceerde Homozygoot Mutants
- Freeze de sub-bibliotheek zwembaden en passage cellen voor doxycycline behandeling
- 24 uur voorafgaand aan de 100-mm 'sub-bibliotheek' platen met kolonies groot genoeg om 70-80% confluentie opleveren, voor te bereiden een reeks van tien ontsloten 100-mm platen voor doxycycline behandeling.
- Bereid enkele cel suspensies van elke sub-library (zie paragrafen 1.4.1 en 1.4.2 voor details). Transfer 5 x 10 6 cellen aan de gegelatiniseerde 100-mm plaat met doxycycline (1 ug / ml); incuberen bij 37 ° C, 5% CO2. Bevries de resterende niet-doxycycline behandelde sub-bibliotheek zwembaden op 5 x 10 6 cellen per flesje.
- Passage cellen in aanwezigheidvan doxycycline om knock-out Blm
- Passage de sub-libraries op 1: 8 elke 2-3 dagen in aanwezigheid van doxycycline (1 ug / ml) gedurende twee weken, gedurende welke tijd DOX-geïnduceerde knock-out van Blm zal verlies van heterozygositeit bevorderen in de cel bevolking, de verzameling van homozygote mutanten.
4. Stress Selectie en isolatie van resistente klonen
- Subject-doxycycline behandelde cellen voor spanning selectie
- 24 uur voorafgaand aan passage doxycycline behandelde cellen bij stress selectie, bereiden ten verstijfseld 150-mm platen af in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Bereid een enkele cel suspensie van elke sub-library door trypsinisatie (zie paragraaf 1.4.1 en 1.4.2 voor details). Seed 6,6 x 10 6 cellen op elke 150 mm plaat in 30 ml totaal volume van cultuur, verdelen de cellen gelijkmatig. Incubeer cellen met stressor (10 uM paraquat of nalaten van β-mercaptoethanol,ES celmedium bevattende 7,5% door warmte geïnactiveerd FBS) gedurende 7 dagen, waarna vervangen normale ES-celmedium om overlevende cellen groeien tot kolonies voor het plukken.
- Optioneel: Freeze links over-doxycycline behandelde cellen bij 5,0 x 10 6 cellen per flesje.
- Pick stressbestendig kolonies
- Na het herstel van de normale media voor een week, observeren hoeveel stressbestendig kolonies aanwezig zijn. Afhankelijk van het aantal kolonies worden opgepikt, bereiden genoeg putjes met mitomycine-C geïnactiveerd PMEF on 96 putjes de dag ervoor dienovereenkomstig (zie sectie 1.1 voor details).
- Op de dag van plukken, aspireren en vervang medium in 96-well feeder plaat met 100 ul vers ES-celmedium, weer plaatsen 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. Op dit moment stelt een U-bodem 96-wells plaat met 50 ul 0,25% trypsine-EDTA per putje. Zuig medium uit de 150-mm spanning selectie plaat en voeg equal volume van PBS.
- Zet de micropipet om 2 pl en 'pick' overleven kolonies in de U-bodem trypsine bevattende putten, plukken één kolonie per putje. Het is acceptabel om de plaat te laten zitten bij RT totdat het gewenste aantal kolonies is geplukt. Vervolgens incubeer de U bodemplaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 10 min.
OPMERKING: Typisch, nemen we 1 uur tot 96 kolonies te halen. - Stop trypsine reactie één rij in een tijd met 50 ul ES-cel medium met behulp van een multichannel pipet. Pipet op en neer 15 keer om een enkele celsuspensie te verkrijgen en overdracht 100 ul van cellen aan de bijbehorende rij van de feeder plaat reeds met 100 pl ES-celmedium. Voltooien van de transfer voor de hele plaat. Kweekcellen O / N in 200 pl. De volgende ochtend, aspireren medium en te vervangen door 100 ul ES-cel medium.
- Kopie van de 96 putjes
- Wanneer de putjes van de geplukte kolonies 80-90% confluent, repliceren in twee bijbehorende platen, een voor DNA isolatie en een voor cellen back-up. Deze platen zijn gegelatineerd en hebben mitomycine-C geïnactiveerd PMEF bevatten.
- Zuig medium en wassen met 100 pi PBS. Voeg 50 ul 0,25% trypsine-EDTA aan elk putje, incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. Stop de trypsine met 150 ul ES-celmedium, meng door pipetteren en breng 100 ui celsuspensie aan de bijbehorende rij van twee 96-wells platen. Veranderen medium elke dag.
- Wanneer de platen 80-90% confluent, bevriezen één set platen als 'back-up' (zie paragraaf 2.2 voor details). De andere set van platen worden verder uitgebreid zoals hieronder beschreven.
- Uitbreiding cellen voor genomisch DNA isolatie
- Bereid een enkele celsuspensie in de 96-well plaat DNA (zie 2.1.2 voor details).
- Overdracht celsuspensie uit elk afzonderlijk putje van de 96-putjesplaat het putje van een 24-well plaat (4 totaal) met een micropipette. Zorg dat er geen kruisbesmetting van alle cellen, als de 'geplukt' kolonies 'klonen' in oorsprong. Cultuur cellen in 0,5 ml ES-cel medium, het veranderen medium dagelijks tot putten zijn 80-90% confluent.
OPMERKING: De 24-well plaat voldoende opbrengst van genomisch DNA voor PCR analyse mogelijk.
5. Identificatie van de PB Insertion Sites en Trapped Genes
- Genomisch DNA isolatie uit 24-well plate: Lyse cellen in 24-wells plaat en isoleren van RNA vrij genomisch DNA.
- Voeren Splinkerette PCR (SpPCR) naar sequentiefragmenten aan weerszijden van de PB transposon integratie plaats zoals beschreven 7,8 genereren.
OPMERKING: SpPCR is een vijfdaagse proces, maar hands-on tijd elke dag is minimaal.
6. Genetische analyse van de Mutant Clones
- Lokaliseren meester goed en te zuiveren kloon van belang.
- Wanneer de PB integratieplaats istoegewezen, ontwerp een voorwaartse primer stroomopwaarts van de integratieplaats te gebruiken met een PB reverse primer (bijv PB3'-1) 8 en screenen het DNA plaat corresponderen met dezelfde "sub-bibliotheek waarvan de stressbestendige kloon opgepikt. Verwachten dat slechts één positieve goed vinden in de gehele 96-well DNA plaat. Ontdooien precies goed uit de 'Master' plaat tot een 24-wells plaat op feeders en groei van cellen tot 80-90% confluentie.
Opmerking: Op dit punt, dit goed bevat een mengsel van gen-gevangen klonen. - Wanneer de 24-well plaat 80-90% confluent, trypsinize cellen en plaat 1000 ES-cellen in een 100-mm plaat feeder (zorgen enkele celsuspensie). Passage de overige cellen van een T25 fles op feeders voor uitbreiding. Bevries de cellen van de T25 kolf als kolonies 80-90% confluent. Freeze 4 flesjes per T25 fles als back-ups.
- Laat de kolonies te kweken gedurende 7 dagen en pak 96 kolonies tot een 96-well feeder plaat. Zie paragraaf 4.2 voor het plukken procedure. Repliceren de plaat als u klaar in een 'DNA' plaat en vries de andere als '2e -Master' plaat (zie paragraaf 2.2 voor bevriezing).
- Sta kolonies tot 80-90% confluentie bereiken. Het scherm van de DNA-plaat putjes die het gezuiverde kloon van belang te vinden. Breid cellen van de 96-well 2e -Master plaat met 24 putjes en vervolgens naar een T25 fles (allemaal op feeders). Freeze 4 flesjes per T25 fles.
Opmerking: Op dit punt, het gen gevangen cellijn klonaal is niet blootgesteld aan de stressor en is geschikt voor muizen productie.
- Wanneer de PB integratieplaats istoegewezen, ontwerp een voorwaartse primer stroomopwaarts van de integratieplaats te gebruiken met een PB reverse primer (bijv PB3'-1) 8 en screenen het DNA plaat corresponderen met dezelfde "sub-bibliotheek waarvan de stressbestendige kloon opgepikt. Verwachten dat slechts één positieve goed vinden in de gehele 96-well DNA plaat. Ontdooien precies goed uit de 'Master' plaat tot een 24-wells plaat op feeders en groei van cellen tot 80-90% confluentie.
- Bepaal het aantal PB inbrengen: Dooi een flacon van de stressbestendig cellijn en uitbreiding van de cellen in een ontsloten T25 fles. Isoleer genoom DNA en controleer aantal kopieën van de PB transposon. Dit kan worden bereikt door qPCR richten op het neomycine gen.
- Meet genexpressie niveau: Na confirming er één PB integratiegebeurtenis in de cellijn van interesse, meet het niveau van expressie van het gen gevangen door RT-qPCR met specifieke Taqman probes voor ieder gen.
- Sequence het mutant mRNA: Genereer een cDNA amplicon met PCR met gebruik van een stroomopwaartse primer annealing een exon en een stroomafwaartse primer annealing aan de splice acceptor sequentie van het geninsluitingscassette. Sequentie het cDNA-fragment te bevestigen dat de verwachte splitsing optreedt in het ingesloten gen.
- Remobilize de piggyBac transposon om te testen voor oorzakelijk verband tussen de gevangen-gen en stressbestendigheid.
- 24-48 uur voorafgaand aan het ontdooien cellen voor PB mobilisatie, dooi en plaat DR4 feeders op een T25 fles en twee 100-mm platen. Ten minste een dag na de DR4 feeders worden uitgeplaat op de T25 kolf ontdooien een flacon van de cellijn die het inbrengen PB en de plaat de cellen in de T25 kolf die DR4 feeders. Kweken van de cellen in de ES-cel medium48 uur, het veranderen medium elke dag.
- Bereid een enkele celsuspensie van de ES-cellen. Tellen cellen met een geautomatiseerde cel tegen te gaan, en de overdracht van 5,0 x 10 6 ES-cellen om een 15 ml buis. Centrifugeer bij 100 xg en resuspendeer de cellen in 800 pi PBS. Breng de suspensie om een 4 mm cuvet.
- Voeg 20 ug mPBase Puro aan de cuvette, meng door pipetteren en electroporate cellen (zie paragraaf 1.4 voor details). Verdeel de getransfecteerde cellen op twee 100-mm DR4 feeder platen. Kweekcellen O / N in ES-celmedium.
- De volgende ochtend, voeden de cellen met ES medium met 1 ug / ml puromycine en cultuur cellen voor 48 uur. Trek puromycineselectie en verder kweken van de cellen gedurende 5 dagen. Wanneer de kolonies zijn groot genoeg voor plukken, plukken in een 96-well plaat feeder (zie paragraaf 4.2).
- Wanneer de geplukt cellen 80-90% confluentie hebben bereikt, gesplitst 1/6 e van de plaat in een DNA-plaat en 1/6 e van de platen in een G418 plaat, waardoor 2/3 rds van de cellen in de oorspronkelijke plaat te worden bevroren (zie paragraaf 2.2 voor bevriezing).
- Culture DNA plaat ES-celmedium voor latere DNA-isolatie, en het G418 plaat 150 ug / ml G418 om te testen voor het verlies van neomycine resistentie. Wells geen levensvatbare cellen na 72-96 uur in de cultuur waarin G418 geven succesvolle mobilisatie van de gen-trapping PB transposon.
- De overeenkomstige putten in het 'DNA' plaat zal worden gescreend door PCR om de PB transposon is verwijderd bevestigen. Wanneer het DNA plaat 90% confluent, isoleer het genomische DNA in 96-well plaat formaat 4 voor PCR screening voor het herstel van de wild-type sequentie en de afwezigheid van neo-IRES als middel om terugval te bevestigen.
- Ontdooi de bijpassende putten van de Meester plaat 24-well plaat en uit te breiden naar een T25 kolf (allemaal met feeders). Bevriezen vier flesjes per T25 fles als back-up.
7. Generatie van muismutanten - Herstel resistente ES-cellen van de meesterplaten en hen gebruiken voor injectie chimeer embryo genereren. Ongeveer 15-20 ES-cellen worden geïnjecteerd in een individuele C57BL / 6 blastocysten. Transfer 15 blastocysten per muis naar de baarmoeder van een pseudo vrouwelijke (stam ICR). Mate de mannelijke chimeer (aangegeven door de ES-cellen specifieke agouti vachtkleur) gewonnen uit het nest aantal jonge maagdelijke C57BL / 6J vrouwtjes testen op kiemlijn transmissie, en het opbouwen van een kolonie van mutante muizen.
- Isoleer en test de staart huid fibroblasten van de F1 mutante muizen en wild-type nestgenoot voor reactive oxygen species (ROS) niveau en de weerstand tegen paraquat 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een typisch mutagenese-experiment, transfectie uit een totaal van 3 x 10 7 ES-cellen met PB-UPA en MPB transposase. Het aantal-gen ingesloten ES-cellen gegenereerd in twee onafhankelijke experimenten worden samengevat in tabel 1. De efficiëntie van gen-entrapment ongeveer 0,04%. De gecombineerde gen-trap bibliotheken bevatten 22.400 onafhankelijke mutanten, over een volledige dekking van de muis genoom (23.000 coderende genen). Overmatige dekking kan worden bereikt door meer mutanten door herhaalde mutagenese en / of schalen van het proces.
Omdat de gen-libraries trap willekeurige mutaties bevatten, is het niet mogelijk het aantal mutanten bezit van een stressbestendigheid fenotype voorspellen. Twee onafhankelijke selecties voor PQ weerstand werden uitgevoerd; het gecombineerde screenen van 22.440 onafhankelijke gen-trap mutaties ontdekt 17 mutaties die cellulaire resistentie tegen PQ (0,08%) (Tabel 1) verlenen.
<p class = "jove_content"> We hebben gezuiverd 3 mutante klonen, de Pigl, Tiam1 en Rffl, van de master platen voor verdere analyse en muis productie. Cellen met heterozygote Rffl mutatie werden met succes aangezet tot homozygote nakomelingen produceren door het uitspelen van Blm. Maar we geen enkele homozygote mutanten van Pigl en Tiam1 mutanten, waarschijnlijk door een homozygositeit gekoppelde cel letaliteit. De stressbestendigheid van deze gezuiverde klonen werd bevestigd door 2 verschillende stressoren: weglaten van 2-mercaptoethanol (2-ME) en PQ (figuur 2). Na verwijderen van het PB van deze klonen werd de bijbehorende stressresistentie fenotype ook verloren (Figuur 2), bevestigd dat het gen-trap mutaties de oorzakelijke factor. Karakterisatie van klonen gewonnen uit de moederplaten cruciaal omdat uitsluit stochastische laesie tijdens stress selectie als oorzaak van de waargenomen fenotype.Van 3mutante ES-cellen worden ingebracht in blastocysten van de muis productie (tabel 2), 2 lijnen (Pigl en Tiam1) tonen kiemlijntransmissie. De Rffl injectie produceerde slechts één vrouwelijk chimera die geen optimale aantal chimera te beginnen was. Aldus, het falen van kiembaantransmissie van Rffl waarschijnlijk te wijten aan een incompetente chimera. We testten de cellulaire fenotype van huidfibroblasten geïsoleerd van de Pigl mutante muizen en toonden ze het verlaagde endogene reactieve zuurstof species (ROS) en stress resistentie tegen PQ (figuur 3) gehandhaafd.
Figuur 1. ES-cel mutagenese en stress selectie. (A) PB-UPA vector. Een onpartijdige polyA (UPA) val vector bestaande uit een splice acceptor (SA), runder groeihormoon poly-adenylaat signaal (pA), phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, neomycine fosfotransferase (neo), interne ribosomale toegangsplaats (IRES), en een splice donor (SD) met kunstmatige ATG (in 3 verschillende leesramen) werd gekloneerd in de piggyBac transposon, geflankeerd door de 3 ' en 5 'lange terminale herhaling (LTR). (B) Random mutagenese van ES-cellen en selectie voor stressbestendig klonen. ES-cellen werden gecotransfecteerd door elektroporatie met PB-UPA en mPBase gevolgd door uitplaten op 96-putjesplaten. Gene gevangen klonen werden geselecteerd op G418 resistentie; eenmaal confluent werden ze verdeeld in 2 replica sets. Een replica set werd verder onderverdeeld in twee helft voor DNA-isolatie en stress selectie van paraquat (PQ); de andere replica set (master) was bevroren beneden. De overlevende ES-cel kolonies hersteld van de stress behandeling werden geanalyseerd moleculair voor de PB inbrengen van Sp-PCR. Primers werden vervolgens ontworpen om het scherm van de replica DNA plaat waaruit het putje met de sibling PQ R kloon kunnen worden gevestigd op de master plaat. Deze cellen zijn voor de weerstand tegen stress test op verschillende stressoren en muis productie. Gewijzigd van Chick et al. 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Stress weerstand in mutante ES-cellen. (A) Weerstand tegen 2-mercaptoethanol (2-ME) terugtrekking. (B) Weerstand tegen paraquat (PQ). Worden de ouderlijke wildtype ES-cellen (C9: geel), een stressbestendige control ES-celkloon, (4C11: rood), teruggewonnen uit een eerdere studie 5, en drie klonen gen-trap (grijs). De cellen werden onderworpen aan een spanning gedurende twee dagen, waarna het aantal levensvatbare cellen werd geteld. < em> Pigl, Tiam1 en Rffl heterozygoten. (PB / +: donkergrijs) vertonen weerstand tegen beide stressoren Rffl homozygoten (PB / PB: zwart) vertonen een sterkere stressbestendigheid in vergelijking met de heterozygoten. Weerstand tegen beide stressoren was verloren toen de PB toevoegingen werden verwijderd (+ / +: lichtgrijs). Foutbalken vertegenwoordigen SD van de gemiddelde (n = 4). * P <0,001, P # = 0,01 tussen de gen-trap klonen en het wildtype ouderlijke C9, geëvalueerd door Student's t-test. (C) ES-cel kolonie formatie onder PQ (10 M) behandeling. Stress-resistente ES-klonen konden kolonies in kweek te vormen onder PQ behandeling, terwijl het aantal en de grootte van de kolonies van de wild-type kloon aanzienlijk verlaagd. Gewijzigd van Chick et al. 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Karakterisering van Pigl PB / + fibroblasten. (A) reactive oxygen species (ROS) niveau. Staart huidfibroblasten geïsoleerd van wild-type (WT) en Pigl PB / + muizen werden gekleurd met CM-DCFCA en de fluorescentie werd genormaliseerd tegen Hoechst. De ROS gehalte werd uitgedrukt als relatieve fluorescentie-eenheid (RFU). De p-waarde werd geëvalueerd door twee eenzijdige Student's t-test (n = 8). (B) PQ weerstand. Tail huidfibroblasten van wild-type (WT) en Pigl PB / + muizen werden blootgesteld aan 4 mM PQ voor 6 uur, waarna de levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten door MTT assays. Het percentage levende cellen na behandeling PQ werd berekend door de verhouding van de absorptie verkregen van de PQ behandelde ceLLS en dat van de niet-behandelde cellen. De p-waarde werd geëvalueerd met een eenzijdige Student's t-test (n = 8). Gewijzigd van Chick et al. 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Bibliotheek | Sub-bibliotheken | ES celstam | Aantal gen gevangen kloon | Aantal PQ R klonen |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (Blm tet / tet) | 9000 | 7 |
| 2 | C9PA11 - C9PA20 | C9 (Blm tet / tet) | 13440 10 | |
| Totaal | 22440 | 17 |
Tabel 1. piggyBac gen-trap bibliotheek bouw en het herstel van de PQ resistente klonen. Modified van Chick et al. 7.
| ES-cel kloon geïnjecteerd | Aantal hersenschim hersteld | Kiemlijnoverdracht * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | Ja |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | 2 | Ja | </ tr>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | Nee |
Tabel 2. Genereren van muizen. Modified van Chick et al. 7.
* Kiemlijnoverdracht werd bevestigd door overerving van het gen-trap allel gedetecteerd door PCR genotypering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
