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Developmental Biology

आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण चूहे में तनाव प्रतिरोध जीनों उजागर करने के लिए - ES कोशिकाओं में एक उच्च throughput स्क्रीन

Published: November 11, 2015 doi: 10.3791/53062
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

Summary

तनाव प्रतिरोध दीर्घायु के लिए पहचान की है और आनुवंशिक रूप से नियंत्रित किया जाता है। यहाँ, हम दीर्घायु के अध्ययन के लिए माउस मॉडल विकसित करने के साथ जो ES कोशिकाओं में तनाव प्रतिरोध प्रदान कि म्यूटेशन के लिए स्क्रीन के लिए एक निष्पक्ष उच्च throughput विधि विकसित की है।

Introduction

दीर्घायु तनाव प्रतिरोध के साथ एक अंतरंग संबंध नहीं है। सामान्य में, लंबे समय रहते प्रजातियों अक्सर ऐसे हाइड्रोजन पेरोक्साइड, paraquat (पीक्यू), यूवी, गर्मी, और भारी धातुओं 1,2 के रूप में कई तनाव, की ओर बढ़ा प्रतिरोध प्रदर्शित करता है। इसके विपरीत, तनाव के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता छोटा जीवन काल और / या एक अधिक रोग की आशंका फेनोटाइप की भविष्यवाणी करने के लिए जाता है। एंटी ऑक्सीडेंट सफाई मार्ग लंबे समय जानवर को तनाव प्रतिरोध प्रदान करने में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए अनुमान लगाया गया है। हालांकि, कुछ अपवादों के साथ, विभिन्न एंटी ऑक्सीडेंट एंजाइमों (जैसे, वतन) में जोड़तोड़ के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों की एक किस्म से पढ़ाई ऑक्सीडेंट सफाई एंजाइमों का स्तर बढ़ाने जीवन काल या स्वास्थ्य अवधि 3 वृद्धि नहीं करता है कि संकेत मिलता है। ये आंकड़े लगातार लंबे समय रहते पशुओं में मनाया तनाव प्रतिरोध विशेषता अभी तक पर्दाफाश किया जा करने के लिए अन्य सेलुलर रास्ते द्वारा मध्यस्थता है कि सुझाव।

हम एक निष्पक्ष आगे ले लीआनुवंशिक दृष्टिकोण उत्परिवर्तित पर, सुसंस्कृत भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) में एक तनाव प्रतिरोध फेनोटाइप प्रदान कर सकता है जो जीन की पहचान करने के लिए। ES कोशिकाओं इस अध्ययन में दो प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं: (1) परिष्कृत आनुवंशिक जोड़तोड़ ES कोशिकाओं के जीनोम को संशोधित करने के लिए उपलब्ध हैं; और (2) स्क्रीन से बरामद किसी भी तनाव प्रतिरोधी ते कोशिकाओं को सीधे जीवन काल और स्वास्थ्य अवधि को मापने के लिए पूरे जानवरों के अध्ययन में तेजी से अनुवाद की इजाजत दी, माउस उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस रिपोर्ट में, हम Blm एलिलों एक टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी तत्व द्वारा नियंत्रण में थे जिसमें C9 ते सेल लाइन का उपयोग करते हैं, का वर्णन किया। डॉक्सीसाइक्लिन (dox) के उपचार क्षणिक बहन chromatid विनिमय की वृद्धि की घटना के लिए अग्रणी Blm की अभिव्यक्ति बंद कर दिया। यह अल्पकालिक Blm नाक आउट विषम आबादी के भीतर समयुग्मक म्यूटेशन की पीढ़ी के लिए अनुमति दी तनाव प्रतिरोध के लिए पीछे हटने का म्यूटेशन स्क्रीनिंग प्रक्रिया में कब्जा किया जा सकता है ताकि। हमयह भी बेतरतीब ढंग से जीनोम में जीन रूप बदलना एक पाली-एक जाल कैसेट (पीबी-संप्रग) डालने के लिए उत्परिवर्तजन के रूप में piggyBac (पंजाब) transposon के उपयोग का वर्णन किया। पाली-एक जाल द्वारा एक जीन के विघटन के साथ कोशिकाओं G418 प्रतिरोधी बन गया है और जीन-जाल म्यूटेंट (जीन-जाल पुस्तकालय) का एक संग्रह बनाया, और बाद में प्रतिरोधी तनाव थे कि उत्परिवर्ती क्लोन के लिए जांच की जा सकती है, ताकि ठीक किया जा सकता है।

चयन से बरामद तनाव प्रतिरोधी क्लोन सम्मिलन की संख्या (qPCR) के संबंध में आणविक तकनीक के द्वारा नहीं बल्कि तेजी से होती जा सकता है, सम्मिलन की साइट (splinkerette पीसीआर), बाधित जीन (ब्लास्ट) की पहचान की है, और इसकी अभिव्यक्ति के स्तर ( RT-qPCR)। पंजाब प्रविष्टि प्रकार के जंगली डीएनए अनुक्रम को बहाल करने और इस प्रकार तनाव प्रतिरोध के नुकसान के लिए परीक्षण करने के लिए क्लोन में MPB Transposase के क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा remobilized किया जा सकता है। ये पहले किया जाना चाहिए, जो उत्परिवर्तन की करणीय पुष्टि करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं,महंगा माउस उत्पादन करने के लिए। पिछले अध्ययनों से तनाव के संपर्क में कोशिकाओं को उनके pluripotency 4,5 खो दिया है कि पता चला है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, तनाव के साथ नहीं माना जाएगा जो उत्परिवर्ती कोशिकाओं का सेट एक प्रतिकृति, के संरक्षण के सफल माउस उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है।

हमारी प्रयोगशाला दोनों अनुरोध पर अन्य जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं, C9 ते सेल लाइन और पीबी संप्रग वेक्टर इंजीनियर है। यहां बताया प्रोटोकॉल तनाव प्रतिरोधी क्लोन (चित्रा 1 बी) को अलग करने की प्रतिकृति चढ़ाना और तनाव चयन के बाद पीबी संप्रग (चित्रा 1 ए) के साथ जीन-फंस ते कोशिकाओं की नए सिरे से पुस्तकालय की पीढ़ी से शुरू होगा। हम paraquat, कोशिकाओं के अंदर एक शक्तिशाली मुफ्त कट्टरपंथी जनरेटर के साथ चयन का प्रदर्शन किया। वस्तुतः, उदाहरण के लिए किसी भी साइटोटोक्सिक यौगिक या विष, ईआर तनाव (जैसे, thapsigargin और tunicamycin), न्यूरोनल ऑक्सीडेंट (जैसे, एमपीपी + 6 हाइड्रोक्सी डोपामाइन, और rotenone), गर्मी, और भारीधातुओं (जैसे, सीडी, एसई), संबंधित प्रतिरोधी म्यूटेंट के लिए चयन करने के लिए विधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

PiggyBac transposon का प्रयोग 1. जीन-फंस ते सेल पुस्तकालय निर्माण

  1. ते सेल संस्कृति के लिए फीडर के रूप में प्राथमिक माउस भ्रूणीय fibroblasts (PMEF) तैयार करें
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में mitomycin सी निष्क्रिय PMEF (5.0 x 10 6) में से एक शीशी पिघलना। DMEM 15% FBS युक्त ते सेल के माध्यम से 5 मिलीलीटर (1,000 इकाई / ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारकों में से मिलीलीटर, 100 माइक्रोन अनावश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी glutamine, 55 माइक्रोन 2-mercaptoethanol, और 25 यूनिट / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन में कोशिकाओं का स्थानांतरण ), और 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और दो T25 बोतल (5 मिलीलीटर प्रत्येक) और दो 100 मिमी प्लेट (10 मिलीलीटर प्रत्येक) में वितरण के द्वारा पीछा ते सेल के माध्यम से 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  2. संस्कृति और C9 ते कोशिकाओं का विस्तार
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में C9 ES कोशिकाओं की एक शीशी (0.5 मिलीलीटर में 2.5 x 10 6 कोशिकाओं) गला लें और हस्तांतरणते सेल के माध्यम से 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं। 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. T25 फीडर फ्लास्क में चढ़ाना द्वारा पीछा सतह पर तैरनेवाला और ते सेल के माध्यम से 5 मिलीलीटर में resuspend ES कोशिकाओं Aspirate। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं। दैनिक ते सेल के माध्यम से बदलें।
    3. संस्कृति के 2 दिन बाद, ते कोशिकाओं ~ 80% मिला हुआ हो, और passaged होने के लिए तैयार कर रहे हैं चाहिए। (2 + 2 + मिलीग्राम और सीए के बिना) पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर 2.5 मिलीलीटर जोड़ने ट्रिप्सिन- EDTA 0.25% पूर्व गर्म। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ट्रिप्सिन को रोकने के लिए 2.5 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम जोड़ें; विंदुक ऊपर और 15 बार नीचे सेल clumps को तोड़ने के लिए। 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. ते सेल के माध्यम से 4 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं Aspirate। स्थानांतरण 9 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम से युक्त 100 मिमी प्रति प्लेट कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर; दो 100 मिमी प्लेटें तैयार करते हैं। 8 मार्ग: यह एक 1 है। 10 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम से दैनिक कोशिकाओं फ़ीड।
  3. पुस्तकालय के लिए 96 अच्छी तरह से फीडर प्लेटों की तैयारी
    1. 1.1.1 में वर्णित है, 33.3 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम से प्रत्येक शीशी से तीन mitomycin-सी की शीशियों PMEF निष्क्रिय (प्रत्येक युक्त 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं) और resuspend कोशिकाओं पिघलना। एक 100 मिलीलीटर सेल निलंबन की उपज के लिए कोशिकाओं का मिश्रण।
    2. अच्छी तरह पर दस 96 अच्छी तरह प्लेटें प्रति प्लेट 100 μl कोशिकाओं। इन 96 अच्छी तरह से फीडर प्लेटों पीबी transposon साथ C9 ES कोशिकाओं transfecting से पहले कम से कम एक दिन के लिए तैयार रहना चाहिए।
  4. पीबी संप्रग वेक्टर साथ C9 ES कोशिकाओं के electroporation
    1. Trypsinize और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग का विस्तार C9 ते कोशिकाओं गिनती। 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ C9 ते कोशिकाओं में से प्रत्येक 100 मिमी प्लेट धो लें। 8 मिलीलीटर जोड़ें 0.25% trypsin EDTA के पूर्व गर्म और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 2 मिलीलीटर ते सेल मध्यम जोड़कर trypsin बंद करो। सेल clumps अलग तोड़ने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और विंदुक ऊपर और नीचे 15 बार सेल निलंबन स्थानांतरण। इसके तत्काल बाद सतह पर तैरनेवाला aspirating द्वारा पीछा किया 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. Resuspend सेल10 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम में है और एक hemocytometer का उपयोग ते कोशिकाओं गिनती। सेल निलंबन के छह से 15 मिलीलीटर ट्यूब के प्रत्येक युक्त 5 एक्स 10 6 ES कोशिकाओं से तैयार करें। 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 0.8 मिलीलीटर पीबीएस में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend।
    4. छह इलेक्ट्रोपोरेशन cuvettes (4 मिमी अंतराल) जो 0.8 मिलीलीटर कोशिकाओं स्थानांतरित कर रहे हैं करने के लिए तैयार करें। प्रत्येक क्युवेट करने के लिए, 1 ग्राम पीबी-यूपीए और 20 माइक्रोग्राम MPB Transposase (mPBase) जोड़ने; ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। बर्फ पर cuvettes रखो। एक 250 वी पर घातीय सेटिंग का उपयोग electroporator, 500 μF, और अनंत ओम के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: आमतौर पर, समय लगातार 10 के बारे में 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं के बारे में प्रति 1,500 से 2,000 G418 प्रतिरोधी transformants उपज है, जो एक सफल electroporation के लिए 12 मिसे, के लिए है।
    5. निकालते हैं और 98 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम से युक्त एक T75 फ्लास्क कोशिकाओं पूल। कोमल pipetting द्वारा कोशिकाओं मिश्रण है और फिर एक जलाशय (50 एमएल) के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण। हमेंएक 12-चैनल पिपेट हैैं, (कुल 10) पहले से तैयार 96 अच्छी तरह से फीडर प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के 100 μl हस्तांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
    6. 24 घंटे के बाद, जीन-फंस क्लोन के लिए चयन करने के लिए नए सिरे ते सेल के माध्यम से युक्त G418 (150 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ दैनिक कोशिकाओं खिलाओ।
      नोट: आमतौर पर अच्छी तरह से प्रत्येक के बारे में दस G418 प्रतिरोधी कालोनियों में शामिल होंगे। इन कालोनियों (आम तौर पर 5-7 दिन) पर्याप्त आकार के लिए बड़े होते हैं, 96 अच्छी तरह प्लेटें (पुस्तकालय) क्रमश भंडारण और चयन के लिए 2 सेट में दोहराया जाएगा। इस मामले में, 10 उप-पुस्तकालयों रहे हैं इसलिए पुस्तकालय में प्रत्येक थाली, 'उप पुस्तकालय' के रूप में नामित किया गया है।

2. लाइब्रेरी प्रतिकृति

  1. मास्टर प्लेटों को दोहराने
    1. 24-48 घंटे 50-60% confluency तक पहुँचने G418 प्रतिरोधी कालोनियों करने से पहले, भक्षण (खंड 1.3 देखें) के रूप में दस 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर mitomycin सी निष्क्रिय PMEF का एक और तीन शीशियों पिघलना। जेलाटीनकम से कम 15 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% जिलेटिन incubating द्वारा दस 96 अच्छी तरह प्लेटें ize (/ अच्छी तरह से 100 μl) - 30 मिनट; हे / एन ऊष्मायन स्वीकार्य है।
    2. Trypsinization द्वारा 96 अच्छी तरह प्लेटों में एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। महाप्राण 96 अच्छी तरह से प्लेटों से मध्यम और (सीए 2, 2 मिलीग्राम + बिना) पीबीएस के बराबर मात्रा के साथ एक बार धो लें। पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA के 50 μl जोड़ें, 10 मिनट के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ते सेल के माध्यम से 50 μl के साथ trypsin बंद करो। मल्टीचैनल विंदुक के साथ नीचे 15 बार Pipetting और सेल झुरमुटों तोड़ने के अलावा।
    3. स्थानांतरण पहले से ही 150 μl ते सेल के माध्यम से युक्त फीडर प्लेट (मास्टर) और पहले से ही 150 μl ते सेल के माध्यम से युक्त gelatinized प्लेट (प्रतिकृति) की इसी पंक्ति को शेष 50 μl की इसी पंक्ति को trypsinized सेल निलंबन के 50 μl। एक मास्टर और प्रतिकृति थाली करने के लिए कोशिकाओं में से प्रत्येक पंक्ति की प्रक्रिया। अब एक 200 μl सी युक्त (प्लेटें सेते37 डिग्री सेल्सियस पर ulture मात्रा), 5% सीओ 2 हे / एन।
      नोट: बीस 96 अच्छी तरह प्लेटें अब कर रहे हैं।
    4. अगले दिन 150 माइक्रोग्राम / एमएल G418 युक्त 100 μl ताजा ते सेल के माध्यम से कोशिकाओं को खिलाओ। कुओं में 80-90% मिला हुआ हैं जब तक दैनिक मध्यम बदलें।
  2. मास्टर प्लेटों रुक
    1. मास्टर प्लेटों के बारे में 80% मिला हुआ है जब (धारा 2.1.2 देखें) के रूप में वर्णित है, कोशिकाओं trypsinize।
    2. प्लेटें निकालें और मध्यम (60% ते सेल के माध्यम से, 20% FBS, 20% DMSO) ठंड 2x के 50 μl के साथ trypsin प्रतिक्रिया बंद करो। पिपेट और एक multichannel विंदुक के साथ 10 बार नीचे ठंड मध्यम का उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए।
    3. एक कसकर मोहरबंद स्टायरोफोम बॉक्स में 96 अच्छी तरह प्लेटें रखो और अप करने के लिए चार महीने के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जगह है। चार महीने तनाव चयन पूरा करने के लिए और मास्टर थाली से कुओं ब्याज के क्लोन होते हैं, जो की पहचान करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देगा।
      नोट: -80 & # पर भंडारण176, सी अब से 4 महीने के सेल व्यवहार्यता की गिरावट में परिणाम होगा। एक भंडारण की विस्तारित अवधि के लिए तरल नाइट्रोजन की भाप चरण में संग्रहित किया जा सकता है कि 96 अच्छी तरह प्रारूप में क्रायो-ट्यूब का उपयोग कर सकता है।
  3. प्रतिकृति प्लेटों से डीएनए प्लेटें और उप पुस्तकालय पूल तैयार
    1. 24-48 घंटा उप पुस्तकालय पूल के लिए mitomycin सी निष्क्रिय PMEF के साथ दस 100 मिमी प्लेटें तैयार, डीएनए प्लेटें और उप पुस्तकालय पूल के लिए आगे नकल करने से पहले, और डीएनए प्लेट replicates के लिए दस 96 अच्छी तरह प्लेटें gelatinized। सामान्य प्रक्रिया के लिए खंड 1.3 का संदर्भ लें।
    2. 96 अच्छी तरह से प्रतिकृति प्लेटों में कोशिकाओं Trypsinize (धारा 2.1.2 को देखें)। 10 मिनट trypsinization के चरण के दौरान, महाप्राण डीएनए प्लेटों से जिलेटिन और 150 μl ते सेल के माध्यम से युक्त G418 (150 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ बदलें। इसके अलावा, 100 मिमी फीडर थाली में 'उप-लाइब्रेरी' की पूलिंग के लिए ते सेल के माध्यम से 5 मिलीग्राम से युक्त एक जलाशय तैयार करते हैं।
    3. Trypsinization के बाद, की कोशिश बंद करोएक 12-चैनल पिपेट का उपयोग कर एक समय में ते सेल के माध्यम से एक पंक्ति के 50 μl के साथ psin। पिपेट और 10 बार नीचे सेल clumps अलग तोड़ने के लिए।
    4. स्थानांतरण 50 डीएनए प्लेट की इसी पंक्ति सेल निलंबन के μl और 5 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम से युक्त जलाशय में शेष 50 μl हस्तांतरण। एक पूर्ण 96 अच्छी तरह से थाली पूरा करने के बाद, एक 100 मिमी फीडर प्लेट का माध्यम है, जो जमा कोशिकाओं स्थानांतरित कर रहे हैं करने के लिए महाप्राण। ये जमा mutagenized कोशिकाओं को एक 'उप पुस्तकालय' के रूप में नामित कर रहे हैं।
    5. शेष नौ 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए दोहराएँ। ते सेल के माध्यम से युक्त G418 (150 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ दैनिक 96 अच्छी तरह से डीएनए प्लेटें और 100 मिमी जमा 'उप पुस्तकालय' प्लेटों फ़ीड।
      नोट: अब दस 96 अच्छी तरह से 'डीएनए' प्लेटें, और दस 100 मिमी 'उप पुस्तकालय' प्लेटों रहे हैं।
  4. डीएनए प्लेटों रुक। डीएनए की थाली में कोशिकाओं 80-90% मिला हुआ है, जब मध्यम महाप्राण 100 के साथ कोशिकाओं को दो बार धोनेबाद में जीनोमिक डीएनए अलगाव 6 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और दुकान μl। ये डीएनए प्लेट 'मास्टर' थाली में अच्छी तरह से इसी ब्याज का क्लोन होता है जो की पहचान करने के लिए पीसीआर द्वारा जांच की जाएगी।

3. डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरित Homozygous म्यूटेंट

  1. डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के लिए उप पुस्तकालय पूल और पारित होने कोशिकाओं रुक
    1. 24 घंटा, 70-80% confluency उपज डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के लिए 100 मिमी प्लेटों gelatinized दस का एक सेट तैयार करने के लिए काफी बड़े कालोनियों होने 100 मिमी 'उप पुस्तकालय' प्लेटों से पहले।
    2. प्रत्येक उप पुस्तकालय के एकल कक्ष निलंबन तैयार (वर्गों 1.4.1 और जानकारी के लिए 1.4.2 को देखें)। डॉक्सीसाइक्लिन (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ gelatinized 100 मिमी प्लेट पर स्थानांतरण 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं; 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं। शीशी प्रति 5 x 10 6 कोशिकाओं पर शेष गैर डॉक्सीसाइक्लिन में इलाज उप पुस्तकालय पूल रुक।
  2. उपस्थिति में पारित होने कोशिकाओंBlm बाहर दस्तक करने के लिए डॉक्सीसाइक्लिन की
    1. मार्ग 1 पर उप पुस्तकालयों: अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (1 माइक्रोग्राम / एमएल) की उपस्थिति में 8 हर 2-3 दिन, जो समय के दौरान-बाहर दस्तक Blm की सेल में Heterozygosity के नुकसान को बढ़ावा देंगे dox प्रेरित जनसंख्या, समयुग्मक म्यूटेंट की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है।

4. तनाव चयन और प्रतिरोधी क्लोन का अलगाव

  1. तनाव के चयन के लिए विषय डॉक्सीसाइक्लिन इलाज कोशिकाओं
    1. तैयार करते हैं, से पहले तनाव चयन के लिए डॉक्सीसाइक्लिन इलाज किया कोशिकाओं passaging को 24 घंटा दस एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 150 मिमी प्लेट, जगह gelatinized।
    2. Trypsinization द्वारा प्रत्येक उप पुस्तकालय के लिए एक एकल कोशिका निलंबन की तैयारी (धारा 1.4.1 और जानकारी के लिए 1.4.2 को देखें)। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित, 30 मिलीलीटर की कुल संस्कृति मात्रा में प्रत्येक 150 मिमी प्लेट पर 6.6 x 10 6 कोशिकाओं बीज। तनाव (10 माइक्रोन paraquat या β-mercaptoethanol की चूक के साथ कोशिकाओं को सेते हैं,जीवित कोशिकाओं चुनने के लिए कालोनियों के रूप में विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए सामान्य ते सेल के माध्यम के साथ की जगह, जिसके बाद 7 दिनों के लिए एफबीएस निष्क्रिय 7.5% गर्मी) युक्त ते सेल के माध्यम में।
    3. वैकल्पिक: शीशी प्रति 5.0 x 10 6 कोशिकाओं पर डॉक्सीसाइक्लिन इलाज कोशिकाओं पर छोड़ दिया रुक।
  2. तनाव प्रतिरोधी कालोनियों उठाओ
    1. एक सप्ताह के लिए सामान्य मीडिया बहाली के बाद, प्रतिरोधी कालोनियों मौजूद हैं कितने तनाव निरीक्षण करते हैं। कालोनियों की संख्या उठाया जाएगा पर निर्भर करता है, 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर mitomycin सी निष्क्रिय PMEF के साथ पर्याप्त कुओं तैयार एक दिन पहले से तदनुसार (विवरण के लिए खंड 1.1 को देखें)।
    2. और उठा, महाप्राण के दिन, 100 μl ताजा ते सेल के माध्यम से 96 अच्छी तरह से फीडर थाली में मध्यम जगह 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में वापस जगह है। इस समय, 50 μl 0.25% trypsin EDTA के साथ एक यू के नीचे 96 अच्छी तरह से थाली तैयार प्रति अच्छी तरह से। महाप्राण 150 मिमी तनाव चयन थाली से मध्यम और ई जोड़नेपीबीएस की योग्यता को सीधे मात्रा।
    3. 2 μl करने के लिए micropipette सेट, और अच्छी तरह से प्रति एक कॉलोनी उठा, कुओं युक्त यू-नीचे trypsin में कालोनियों जीवित 'लेने'। यह कालोनियों की वांछित संख्या उठाया गया है जब तक प्लेट आरटी पर बैठ जाने के लिए स्वीकार्य है। फिर, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 यू नीचे की थाली सेते हैं।
      नोट: आमतौर पर, हम 96 कालोनियों लेने के लिए एक घंटा ले।
    4. 50 μl ते सेल के माध्यम से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग के साथ एक समय में ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया एक पंक्ति बंद करो। पिपेट और नीचे में 15 बार एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने और पहले से ही ते सेल के माध्यम से 100 μl युक्त फीडर प्लेट की इसी पंक्ति के लिए कोशिकाओं के 100 μl हस्तांतरण करने के लिए। पूरी थाली के लिए हस्तांतरण को पूरा करें। संस्कृति कोशिकाओं 200 μl में हे / एन। अगली सुबह, महाप्राण मध्यम और 100 μl ते सेल मध्यम के साथ बदलें।
  3. 96 अच्छी तरह प्लेटें दोहराने
    1. उठाया कालोनियों के कुओं में 80-90% conflue कर रहे हैंNT, दो मिलान प्लेटें, डीएनए अलगाव के लिए एक और कोशिकाओं वापस करने के लिए दूसरे में पेश करता है। ये प्लेटें gelatinized हैं और mitomycin सी निष्क्रिय PMEF शामिल नहीं है।
    2. महाप्राण माध्यम है, और 100 μl पीबीएस से धो लें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl 0.25% ट्रिप्सिन- EDTA जोड़ें, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 150 μl ते सेल के माध्यम साथ trypsin बंद pipetting द्वारा मिश्रण है, और दो 96 अच्छी तरह से प्लेटों की इसी पंक्ति के लिए सेल निलंबन के 100 μl हस्तांतरण। मध्यम दैनिक बदलें।
    3. प्लेटों 80-90% मिला हुआ है, जब एक 'बैक-अप' (विवरण के लिए खंड 2.2 देखें) के रूप में प्लेटों में से एक सेट फ्रीज। प्लेटों के दूसरे सेट में आगे नीचे वर्णित के रूप में विस्तार कर रहे हैं।
  4. जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए विस्तार कोशिकाओं
    1. 96 अच्छी तरह से डीएनए प्लेट (विवरण के लिए 2.1.2 देखें) में एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें।
    2. एक माइकर का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह से थाली (4 कुल) के साथ-साथ करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से सेल निलंबन स्थानांतरणopipette। 'उठाया' कालोनियों मूल में 'प्रतिरूप' कर रहे हैं के रूप में किसी भी कोशिकाओं का कोई पार संक्रमण, वहाँ है सुनिश्चित करें। कुओं तक दैनिक मध्यम बदलने 0.5 मिलीलीटर ते सेल के माध्यम से संस्कृति की कोशिकाओं, 80-90% मिला हुआ हैं।
      नोट: 24 अच्छी तरह से थाली पीसीआर विश्लेषण के लिए जीनोमिक डीएनए की पर्याप्त उपज की अनुमति देगा।

पंजाब प्रविष्टि साइटों और फंस जीन के 5. पहचान

  1. 24 अच्छी तरह से थाली से जीनोमिक डीएनए अलगाव: Lyse 24 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं और आरएनए मुक्त जीनोमिक डीएनए अलग।
  2. 7.8 वर्णित के रूप में पंजाब transposon एकीकरण साइट flanking अनुक्रम टुकड़े उत्पन्न करने के लिए Splinkerette पीसीआर (SpPCR) प्रदर्शन।
    नोट: SpPCR हालांकि समय हाथों पर प्रत्येक दिन कम से कम है, एक पांच दिन की प्रक्रिया है।

उत्परिवर्ती क्लोन का 6. आनुवांशिक विश्लेषण

  1. अच्छी तरह से मास्टर जानें और ब्याज का क्लोन शुद्ध।
    1. पंजाब एकीकरण साइट गया है जबमैप किए गए, एक पीबी रिवर्स प्राइमर (जैसे, PB3' -1) 8 के साथ उपयोग करने के लिए इसी डीएनए प्लेट स्क्रीन करने के लिए एकीकरण साइट के अपस्ट्रीम आगे एक प्राइमर डिजाइन एक ही 'उप पुस्तकालय' तनाव प्रतिरोधी क्लोन उठाया गया था जिसमें से। पूरे 96 अच्छी तरह से डीएनए थाली भर में केवल एक सकारात्मक अच्छी तरह से पता लगाने के लिए की अपेक्षा करें। फीडरों पर 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए 'मास्टर' थाली से सटीक अच्छी तरह से इस पिघलना और 80-90% confluency तक कोशिकाओं को विकसित।
      नोट: इस बिंदु पर, यह अच्छी तरह से जीन-फंस क्लोन का मिश्रण होता है।
    2. 24 अच्छी तरह से थाली में 80-90% मिला हुआ, Trypsinize कोशिकाओं और एक 100 मिमी फीडर थाली में 1,000 ES कोशिकाओं प्लेट (एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित) होता है। पारित होने के विस्तार के लिए फीडरों पर एक T25 फ्लास्क शेष कोशिकाओं। कालोनियों में 80-90% मिला हुआ है जब T25 कुप्पी से कोशिकाओं रुक। बैक अप के रूप में T25 फ्लास्क प्रति 4 शीशियों रुक।
    3. कालोनियों 7 दिनों के लिए विकसित और फिर एक 96 अच्छी तरह से फ़े में 96 कालोनियों लेने की अनुमतिएदेर थाली। प्रक्रिया चुनने के लिए खंड 4.2 का संदर्भ लें। एक 'डीएनए' थाली में थाली जब तैयार दोहराने और प्लेट 'मास्टर 2 एन डी' के रूप में अन्य फ्रीज (ठंड के लिए 2.2 अनुभाग को देखें)।
    4. कालोनियों में 80-90% confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। ब्याज की शुद्ध क्लोन युक्त कुओं लगाने के लिए डीएनए प्लेट स्क्रीन। 24 अच्छी तरह से करने के लिए और बाद में एक T25 कुप्पी (फीडरों पर सभी) के लिए 96 अच्छी तरह से 2 एन डी मास्टर थाली से कोशिकाओं का विस्तार करें। T25 फ्लास्क प्रति 4 शीशियों रुक।
      नोट: इस बिंदु पर, प्रतिरूप है जीन-फंस सेल लाइन, तनाव से अवगत कराया, और माउस के उत्पादन के लिए उपयुक्त है नहीं किया गया है।
  2. पंजाब प्रविष्टि की संख्या का निर्धारण: तनाव प्रतिरोधी सेल लाइन से एक शीशी पिघलना और एक gelatinized T25 फ्लास्क में कोशिकाओं का विस्तार। जीनोमिक डीएनए अलग और पीबी transposon की प्रतिलिपि संख्या के लिए जाँच करें। इस neomycin जीन को निशाना qPCR के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
  3. जीन अभिव्यक्ति के स्तर को मापने: आत्मविश्वास के बादब्याज की सेल लाइन में एक भी पंजाब एकीकरण घटना है rming, प्रत्येक जीन के लिए विशिष्ट TaqMan जांच का उपयोग RT-qPCR द्वारा फँस जीन की अभिव्यक्ति के स्तर को मापने।
  4. उत्परिवर्ती mRNA अनुक्रम: एक एक्सॉन के लिए एक नदी के ऊपर प्राइमर annealing और जीन जाल कैसेट का ब्याह स्वीकर्ता अनुक्रम को एक बहाव प्राइमर annealing का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा एक सीडीएनए amplicon उत्पन्न करता है। अनुक्रम सीडीएनए टुकड़ा उम्मीद splicing फंस जीन में होता है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए।
  5. फंस जीन और तनाव प्रतिरोध के बीच कारण संबंध के लिए परीक्षण करने के लिए piggyBac transposon Remobilize।
    1. 24-48 घंटे एक T25 फ्लास्क पर पंजाब remobilization, पिघलना और प्लेट DR4 भक्षण और दो ​​100 मिमी प्लेटों के लिए कोशिकाओं विगलन करने से पहले। DR4 फीडरों T25 कुप्पी पर चढ़ाया जाता है के बाद कम से कम एक दिन, पंजाब प्रविष्टि युक्त सेल लाइन की एक शीशी पिघलना और DR4 फीडरों युक्त T25 फ्लास्क में कोशिकाओं थाली। ते सेल के माध्यम में कोशिकाओं को विकसित48 घंटे के लिए, दैनिक मध्यम बदल रहा है।
    2. ES कोशिकाओं की एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब 5.0 एक्स 10 6 ते कोशिकाओं को हस्तांतरण। 100 XG पर अपकेंद्रित्र, 800 μl पीबीएस में कोशिकाओं resuspend और। एक 4 मिमी क्युवेट करने के लिए निलंबन स्थानांतरण।
    3. , क्युवेट करने के लिए 20 माइक्रोग्राम mPBase प्यूरो जोड़ें pipetting द्वारा मिश्रण है, और electroporate कोशिकाओं (विवरण के लिए खंड 1.4 को देखें)। दो 100 मिमी DR4 फीडर प्लेटों पर कोशिकाओं को वितरित करें। संस्कृति कोशिकाओं हे / एन ते सेल के माध्यम में।
    4. अगली सुबह, 48 घंटे के लिए एक माइक्रोग्राम / एमएल puromycin और संस्कृति कोशिकाओं के साथ ते मध्यम के साथ कोशिकाओं को खिलाओ। 5 दिनों के लिए कोशिकाओं puromycin चयन को वापस लेने और संस्कृति के लिए जारी है। कालोनियों चुनने के लिए काफी बड़े हैं, जब एक 96 अच्छी तरह से फीडर प्लेट (4.2 खंड को देखें) में उठाओ।
    5. उठाया कोशिकाओं 80-90 confluency% तक पहुँच चुके हैं, एक डीएनए थाली में थाली के 1/6 वें विभाजित और पी एल का 1/6 वेंजमे हुए किया जा मूल की थाली में कोशिकाओं का 2/3 आरडीएस छोड़ रहा है, एक G418 थाली में खाया (ठंड के लिए 2.2 अनुभाग को देखें)।
    6. संस्कृति बाद में डीएनए अलगाव के लिए ES सेल के माध्यम में डीएनए की थाली, और 150 माइक्रोग्राम / एमएल G418 में G418 प्लेट neomycin प्रतिरोध के नुकसान के लिए परीक्षण करने के लिए। G418 युक्त संस्कृति में 72-96 घंटे के बाद कोई व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ कुओं जीन को फँसाने पीबी transposon के सफल remobilization संकेत मिलता है।
    7. 'डीएनए' थाली में इसी कुओं हटा दिया गया है पीबी transposon पुष्टि करने के लिए पीसीआर द्वारा जांच की जाएगी। डीएनए प्लेट 90% मिला हुआ है, जब जंगली प्रकार के अनुक्रम की बहाली और प्रत्यावर्तन की पुष्टि के लिए एक साधन के रूप में नव-IRES के अभाव के लिए पीसीआर स्क्रीनिंग के लिए 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप 4 में जीनोमिक डीएनए अलग।
    8. 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए मास्टर थाली से मिलान कुओं गला लें और एक T25 कुप्पी (फीडरों के साथ सभी) के लिए विस्तार। बैक अप के रूप T25 फ्लास्क प्रति चार शीशियों रुक।
    6. माउस म्यूटेंट 7. जनरेशन

    1. मास्टर प्लेटों से प्रतिरोधी ते कोशिकाओं को ठीक करने और कल्पना उत्पन्न करने के लिए भ्रूण इंजेक्शन के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं। के बारे में 15-20 ES कोशिकाओं एक व्यक्ति C57BL 6 / ब्लास्टोसिस्ट में इंजेक्ट कर रहे हैं। स्थानांतरण एक pseudopregnant महिला (तनाव आईसीआर) के गर्भाशय करने के लिए माउस प्रति 15 blastocysts। रोगाणु लाइन संचरण के लिए परीक्षण करने के लिए, और उत्परिवर्ती चूहों की एक कॉलोनी का निर्माण करने के लिए कई युवा कुंवारी C57BL / 6J महिलाओं के साथ कूड़े से बरामद (ते कोशिकाओं विशिष्ट agouti कोट रंग से दर्शाया गया है) पुरुष कल्पना मेट।
    2. पृथक और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर पर और प्रतिरोध के लिए F1 उत्परिवर्ती चूहों और जंगली प्रकार littermate से परीक्षण पूंछ त्वचा fibroblasts paraquat से 9 तक।

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Representative Results

एक ठेठ उत्परिवर्तजनन प्रयोग में, अभिकर्मक पीबी-यूपीए और MPB Transposase के साथ 3 10 x 7 ES कोशिकाओं की कुल के होते हैं। दो स्वतंत्र प्रयोगों में उत्पन्न जीन-फंस ते कोशिकाओं की संख्या 1 टेबल में संक्षेप हैं। जीन-फंसाने की दक्षता के बारे में 0.04% है। संयुक्त जीन-जाल पुस्तकालयों 22,400 स्वतंत्र म्यूटेंट, माउस जीनोम के बारे में एक पूर्ण कवरेज (23,000 जीन कोडिंग) होते हैं। अत्यधिक कवरेज दोहराया उत्परिवर्तजनन माध्यम से और अधिक म्यूटेंट पैदा करने और / या प्रक्रिया स्केलिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

जीन-जाल पुस्तकालयों यादृच्छिक म्यूटेशन होते हैं, यह एक तनाव प्रतिरोध फेनोटाइप रखने म्यूटेंट की संख्या की भविष्यवाणी करना संभव नहीं है। पीक्यू प्रतिरोध के लिए दो स्वतंत्र चयन को प्रदर्शन किया गया; 22,440 स्वतंत्र जीन-जाल म्यूटेशन के संयुक्त स्क्रीनिंग पीक्यू के लिए सेलुलर प्रतिरोध (0.08%) (1 टेबल) प्रदान कि 17 म्यूटेशन का पर्दाफाश किया।

<पी वर्ग = "jove_content"> हम आगे के विश्लेषण और माउस के उत्पादन के लिए मास्टर प्लेटों से, 3 उत्परिवर्ती क्लोन, Pigl, Tiam1, और Rffl को शुद्ध है। विषमयुग्मजी Rffl उत्परिवर्तन के साथ कोशिकाओं को सफलतापूर्वक Blm बाहर दस्तक द्वारा समयुग्मक संतान का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया गया। हालांकि, हम Pigl और Tiam1 म्यूटेंट से, शायद कारण एक homozygosity से जुड़े सेल मारक के लिए किसी भी समयुग्मक म्यूटेंट का उत्पादन करने में विफल रहा है। 2-mercaptoethanol (2-एमई) और पीक्यू की चूक (चित्रा 2): इन शुद्ध क्लोन के तनाव प्रतिरोध तनाव के दो अलग अलग प्रकार का उपयोग करके इसकी पुष्टि की थी। इन क्लोन से पंजाब हटाने पर, जुड़े तनाव प्रतिरोध फेनोटाइप भी जीन-जाल म्यूटेशन कारण कारक हैं कि इस बात की पुष्टि, (चित्रा 2) खो गया था। यह देखा phenotype के कारण के रूप में तनाव चयन के दौरान स्टोकेस्टिक घाव बाहर शासन होगा के रूप में मास्टर प्लेटों से बरामद क्लोन की विशेषता महत्वपूर्ण है।

3 से बाहरउत्परिवर्ती ES कोशिकाओं माउस उत्पादन (तालिका 2), 2 लाइनों (Pigl और Tiam1) germline प्रसारण दिखाने के लिए blastocysts में पेश किया जा रहा है। Rffl इंजेक्शन के साथ शुरू करने के लिए कल्पना का एक इष्टतम संख्या नहीं था, जो केवल एक महिला कल्पना का उत्पादन किया। इस प्रकार, Rffl की germline संचरण की विफलता की वजह से एक अक्षम कल्पना की संभावना है। हम Pigl उत्परिवर्ती चूहों से अलग त्वचा fibroblasts की सेलुलर phenotype परीक्षण किया है और वे पीक्यू करने के लिए कम अंतर्जात प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर (आरओएस) के साथ ही तनाव प्रतिरोध (चित्रा 3) को बनाए रखा है कि पता चला है।

चित्र 1
चित्रा 1. ते सेल उत्परिवर्तजनन और तनाव चयन। (ए) पीबी संप्रग वेक्टर। एक ब्याह स्वीकर्ता (एसए), गोजातीय वृद्धि हार्मोन पाली adenylate संकेत (देहात), phosphog की जिसमें एक निष्पक्ष Pólya (संप्रग) के जाल वेक्टरlycerate काइनेज (PGK) प्रमोटर, neomycin phosphotransferase (नव), आंतरिक ribosomal प्रविष्टि साइट (IRES), और (3 अलग अलग पढ़ने फ्रेम में) एक ब्याह दाता कृत्रिम ATG साथ (एसडी) 3 'से घिरे, piggyBac transposon में क्लोन किया गया था और 5 'लंबे टर्मिनल दोहराने (लीटर)। तनाव प्रतिरोधी क्लोन के लिए (बी) रैंडम ES कोशिकाओं के उत्परिवर्तजनन और चयन। ES कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर चढ़ाना द्वारा पीछा किया पीबी-यूपीए और mPBase साथ electroporation द्वारा सह ट्रांसफ़ेक्ट थे। जीन फंस क्लोन G418 प्रतिरोध द्वारा चयन किया गया था; मिला हुआ है, एक बार वे 2 प्रतिकृति सेट में विभाजित किया गया। एक प्रतिकृति सेट आगे paraquat (पीक्यू) द्वारा डीएनए अलगाव और तनाव के चयन के लिए दो आधे में विभाजित किया गया था; अन्य प्रतिकृति सेट (गुरु) नीचे जम गया था। तनाव उपचार से बरामद जीवित ते सेल कालोनियों सपा पीसीआर द्वारा पंजाब प्रविष्टि के लिए molecularly विश्लेषण किया गया। प्राइमर तब से जो अच्छी तरह से sibli युक्त प्रतिकृति डीएनए प्लेट स्क्रीन करने के लिए डिजाइन किए गए थेएनजी पीक्यू आर क्लोन मास्टर प्लेट पर स्थित हो सकता है। इन कोशिकाओं को अलग तनाव पर तनाव प्रतिरोध परख के लिए और माउस के उत्पादन के लिए कर रहे हैं। चिकी एट अल। 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
उत्परिवर्ती ES कोशिकाओं में चित्रा 2. तनाव प्रतिरोध। 2-mercaptoethanol (2-इ) वापसी के लिए (ए) प्रतिरोध। (बी) paraquat (पीक्यू) के लिए प्रतिरोध। पिछले एक अध्ययन 5 से बरामद: (लाल 4C11), और तीन जीन-जाल क्लोन (ग्रे), एक तनाव-प्रतिरोधी नियंत्रण ES सेल क्लोन,: पैतृक जंगली प्रकार ES कोशिकाओं (पीला C9) कर रहे हैं दिखाया गया है। प्रकोष्ठों व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गिनती की गई थी, जिसके बाद दो दिनों के लिए उपचार तनाव के अधीन थे। < उन्हें> Pigl, Tiam1, और Rffl heterozygotes। (पीबी / +: अंधेरे ग्रे) इन तनाव दोनों के लिए प्रदर्शनी प्रतिरोध Rffl समयुग्मज (पीबी / पंजाब: काला) heterozygotes की तुलना में मजबूत तनाव प्रतिरोध दिखा रहे हैं। (: हल्के भूरे रंग के + + /) पीबी सम्मिलन हटा दिया गया जब दोनों तनाव के लिए प्रतिरोध खो गया था। त्रुटि सलाखों मतलब के एसडी प्रतिनिधित्व (एन = 4)। * पी <0.001, # पी = छात्र टी -Test द्वारा मूल्यांकन जीन-जाल क्लोन और जंगली प्रकार माता पिता का C9, के बीच 0.01। पीक्यू (10 माइक्रोन) के उपचार के तहत (सी) ते सेल कॉलोनी गठन। तनाव के लिए प्रतिरोधी ते क्लोन जंगली प्रकार के क्लोन से कालोनियों की संख्या और आकार काफी कम हो गई थी, जबकि पीक्यू उपचार के तहत संस्कृति में कालोनियों के रूप में करने में सक्षम थे। चिकी एट अल। 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

NT "के लिए: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> चित्र तीन
Pigl पीबी / + fibroblasts की चित्रा 3. विशेषता। (ए) रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) स्तर। जंगली प्रकार (WT) और Pigl पीबी / + चूहों से अलग पूंछ त्वचा fibroblasts के मुख्यमंत्री DCFCA के साथ दाग थे और प्रतिदीप्ति Hoechst के खिलाफ सामान्यीकृत था। आरओएस सामग्री के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाई (RFU) के रूप में व्यक्त की गई थी। पी मूल्य दो पूंछ छात्र के टी -Test द्वारा मूल्यांकन किया गया था (एन = 8)। (बी) पीक्यू प्रतिरोध। जंगली प्रकार (WT) और Pigl पीबी / + चूहों से पूंछ त्वचा fibroblasts कोशिकाओं की व्यवहार्यता MTT संसाधनों द्वारा मापा गया जिसके बाद 6 घंटा, के लिए 4 मिमी पीक्यू से अवगत कराया गया। पीक्यू इलाज के बाद जीवित कोशिकाओं का प्रतिशत पीक्यू इलाज सीई से प्राप्त absorbance के अनुपात द्वारा गणना की गईLLS और संयुक्त राष्ट्र के इलाज कोशिकाओं से है। पी मूल्य एक पूंछ छात्र के टी -Test द्वारा मूल्यांकन किया गया था (एन = 8)। चिकी एट अल। 7 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पुस्तकालय उप-पुस्तकालयों ते सेल तनाव जीन फंस क्लोन की संख्या पीक्यू आर क्लोन की संख्या
1 C9PA01 - C9PA10 C9 (Blm tet / टीईटी) 9000 7
2 C9PA11 - C9PA20 C9 (Blm tet / टीईटी) 13,440 10
कुल 22,440 17

तालिका 1 PiggyBac जीन-जाल पुस्तकालय निर्माण और पीक्यू प्रतिरोधी क्लोन की वसूली। चिकी एट अल से संशोधित। 7।

<Tr />
ते सेल क्लोन इंजेक्ट कल्पना की संख्या बरामद जर्मलाइन संचरण *
Pigl पंजाब / Pigl + 4 हाँ
Tiam1 पंजाब / Tiam1 + 2 हाँ
Rffl पंजाब / Rffl + 1 नहीं

चूहों की तालिका 2 जनरेशन। चिकी एट अल। 7 से संशोधित।

* जर्मलाइन संचरण पीसीआर जीनोटाइपिंग द्वारा पता लगाया जीन-जाल एलील की विरासत से पुष्टि की गई।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture
500-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU05RE
250-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU02RE
50-ml Steriflip-GV filters EMD Millipore SE1M179M6
KO DMEM Life Technologies 10829-018
DMEM Sigma-Aldrich D6429
FBS Tissue Culture Biologicals 104
Heat Inactivated FBS Sigma-Aldrich F4135-500
LIF EMD Millipore ESG1107
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Pen/Strep Life Technologies 15140148
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) Sigma-Aldrich 856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX Sigma-Aldrich D2650
EmbryoMAX 0.1% gelatin EMD Millipore ES006B
DPBS/Modified HyClone SH30028.02
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
T25 Flask Corning 353108
T75 flask Corning 353135
100-mm  plate Corning 353003
150-mm  plate Corning 430599
96-well  plate Corning 3585
96-well U-bottom plate Corning 3799
24-well plate Corning 3526
50-ml reservoir  Corning 4870
15-ml tubes VWR International, LLC 82050-276
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts EMD Millipore PMEF-NL
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts Applied StemCell ASF-1001
Mitomycin C Fisher BioReagents  BP25312
Geneticin (G418) Life Technologies 11811-023
Doxycycline Fisher BioReagents  BP26531
Cryotubes Thermo Scientific 377267
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5702
TC10 cell counter Bio-Rad
Counting Slides (for TC10) Bio-Rad 1450011
Electroporation
Gene Pulser Xcell Bio-Rad 1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) Bio-Rad 1652088
Molecular Biology
Thermal Cycler Eppendorf Mastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit B Qiagen 158745
Topo-TA Cloning kit Life Technologies  450030
High Capacity cDNA synthesis kit Applied Biosystems 4368814
NaCl Fisher BioReagents  BP358-212
100% ethanol Decon Laboratories, Inc. 2716
Double Processed Tissue Culture Water Sigma-Aldrich W3500
Sau3A1 New England BioLabs R0169L
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202T
EcoRV New England BioLabs R3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric Acid Fisher BioReagents  A144-212
EDTA Sigma-Aldrich E5134
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L5777
Proteinase-K Fisher BioReagents  BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad 170-4469EDU
LE Agarose  GeneMate E3120500
Ethidium Bromide  Fisher BioReagents  BP1302
100 BP DNA Ladder New England BioLabs N3231S
1 Kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S
2-log DNA Ladder New England BioLabs N3200L

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 105 तनाव प्रतिरोध दीर्घायु भ्रूण स्टेम कोशिकाओं piggyBac आगे आनुवंशिकी कार्यात्मक जीनोमिक्स paraquat माउस।
आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण चूहे में तनाव प्रतिरोध जीनों उजागर करने के लिए - ES कोशिकाओं में एक उच्च throughput स्क्रीन
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Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick,… More

Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick, W. S. Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice — A High-throughput Screen in ES Cells. J. Vis. Exp. (105), e53062, doi:10.3791/53062 (2015).

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