Summary
Resistência ao estresse é uma das marcas para a longevidade e é conhecido por ser geneticamente governada. Aqui, desenvolvemos um método de alto rendimento imparcial para triagem de mutações que conferem resistência ao estresse em células ES com que para desenvolver modelos de rato para estudos de longevidade.
Introduction
A longevidade tem uma relação íntima com a resistência ao estresse. Em geral, as espécies de vida longa demonstram muitas vezes uma maior resistência para vários factores de stress, tais como peróxido de hidrogénio, paraquato (PQ), UV, calor, e metais pesados 1,2. Em contraste, o aumento da sensibilidade ao stress tende a predizer a vida encurtada e / ou um fenótipo de doença mais propensas. A via de eliminação de anti-oxidante tem sido especulado para desempenhar um papel importante no que confere resistência de stress ao animal. No entanto, com poucas exceções, os estudos de uma variedade de animais transgênicos com manipulações em várias enzimas anti-oxidantes (por exemplo, SOD) indicam que o aumento do nível de enzimas eliminadoras oxidantes não aumenta vida útil ou extensão de saúde 3. Estes dados sugerem que o traço de resistência ao estresse consistentemente observado em animais de longa duração é mediada por outras vias celulares ainda para ser descoberto.
Nós pegamos uma frente imparcialabordagem genética para identificar genes, que após mutação, poderia conferir um fenótipo de resistência ao estresse em células estaminais embrionárias cultivadas (ES). As células ES oferecem duas vantagens principais neste estudo: (1) manipulação genética sofisticadas estão disponíveis para modificar o genoma das células ES; e (2) as células ES resistentes estresse recuperados a partir do ecrã pode ser usado directamente para a produção do mouse, permitindo rápida tradução em estudos com animais inteiros para medir tempo de vida útil e de saúde.
Neste relatório, nós descrevemos o uso de linha de células C9 ES, em que os alelos Blm estavam sob controle por um elemento que responde a tetraciclina. Tratamento de doxiciclina (dox) transitoriamente desligada a expressão de Blm levando a um aumento de incidentes de troca de cromátides irmãs. Este curto prazo Blm knock-out permitiu a geração de mutações homozigotas numa população de heterozigotos, de modo que mutações recessivas para resistência stress pode ser capturado no processo de rastreio. Nóstambém descreveram a utilização de piggyBac (PB) como a transposão mutagénica para inserir aleatoriamente um poli-A cassete armadilha (PB-UPA) para mutar os genes no genoma. As células com um gene de ruptura pela poli-A armadilha se tornou resistente a G418 e pode ser recuperado de modo a que um conjunto de mutantes de gene-trap (biblioteca de genes-trap) pode ser feita, e subsequentemente pesquisada quanto a clones mutantes que eram resistentes ao estresse.
Os clones resistentes de Stress recuperados a partir da selecção poderia ser caracterizada bastante rapidamente por meio de técnicas moleculares no que se refere ao número de inserções (qPCR), o local de inserção (splinkerette PCR), a identidade do gene interrompido (BLAST), e o seu nível de expressão ( RT-qPCR). A inserção pode ser PB remobilizados por expressão transiente de MPB transposase no clone para restaurar a sequência de ADN de tipo selvagem e, portanto, para testar a perda de resistência à tensão. Estas são maneiras poderosas para confirmar a causalidade da mutação, o que deve ser feito antesa produção caro mouse. Estudos anteriores mostraram que as células expostas a estressores perderam a 4,5 pluripotência. Assim, neste protocolo, a preservação de um conjunto de réplicas de células mutantes, que não seriam tratados com fatores de estresse é fundamental para a produção bem sucedida mouse.
Nosso laboratório projetou a linha de células ES C9 eo vetor PB-UPA, ambos estão disponíveis para outros pesquisadores, mediante solicitação. O protocolo aqui relatado começará pela geração da biblioteca de de novo de células ES preso por genes com OP-UPA (Figura 1A), seguido de réplica de placas e selecção de stress para isolar os clones resistentes de tensão (Figura 1B). Nós demonstramos a seleção com paraquat, um potente gerador de radicais livres dentro das células. Praticamente, qualquer composto citotóxico ou toxina, por exemplo, factores de stress ER (por exemplo, tapsigargina e tunicamicina), neuronal oxidante (por exemplo, MPP +, dopamina 6-hidroxi, e rotenona), do calor, e pesadometais (por exemplo, CD, SE), poderia ser adaptada para o método de escolha para os respectivos mutantes resistentes.
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Protocol
1. preso Gene-ES celular Biblioteca da construção que usa piggyBac Transposon
- Prepare rato primária fibroblastos embrionárias (PMEF) como alimentadores para cultura de células ES
- Descongelar um frasco de mitomicina-C PMEF inactivadas (5,0 x 10 6) em um banho de água a 37 ° C. Transferir as células em 5 ml de meio de células ES (DMEM contendo FBS a 15%, 1.000 unidades / mL de factores de inibição de leucemia, 100 uM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de glutamina, 55? M de 2-mercaptoetanol, e 25 unidades / ml de penicilina / estreptomicina ), e centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 30 ml de meio de células ES, seguido de distribuição em dois frascos T25 (5 ml cada) e duas placas de 100 mm (10 ml cada). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Cultura e expandir as células C9 ES
- Descongelar um frasco de células ES em C9 (2,5 x 10 6 células em 0,5 ml) num banho de água a 37 C ° e transferir océlulas em 5 ml de meio de células ES. Centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células ES em 5 ml de meio de células ES seguido por plaqueamento para o balão T25 alimentador. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Substitua meio de células ES diária.
- Após 2 dias de cultura, as células ES devem tornar-se ~ 80% confluentes, e está pronto para ser passado. Lavar as células com 5 ml de PBS (sem Ca 2+ e Mg 2+) e, em seguida, adicionar 2,5 ml pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 10 min. Adicionar 2,5 ml de meio de células ES para parar a tripsina; pipeta cima e para baixo 15 vezes para quebrar aglomerados de células. Centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 4 ml de meio de células ES. Transferir 1 ml de células por placa de 100 mm contendo meio de células ES 9 mL; preparar duas placas de 100 mm. Este é um 1: passagem 8. Alimentar as células diariamente com 10 ml de meio de células ES.
- Prepare a placas de 96 poços de alimentação para a biblioteca
- Conforme descrito no item 1.1.1, descongelar três frascos de mitomicina-C inativadas PMEF (cada um contendo 5 x 10 6 células) e células ressuspender de cada frasco com meio de células ES 33,3 ml. Combinar as células para se obter uma suspensão de células de 100 ml.
- Placa de 100 células por poço em ul dez placas de 96 poços. Estas placas de 96 poços de alimentação deve ser preparada, pelo menos, um dia antes da transfecção de células ES com C9 transposão PB.
- A electroporação das células ES C9 com o vector OP-UPA
- Tripsinizar e contar as células C9 ES expandidas utilizando um contador de células automatizado. Lava-se cada placa de 100 mm de células ES C9 com 10 ml de PBS. Adicionar 8 mL de pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C durante 10 min.
- Pare de tripsina por adição de 2 ml meio de células ES. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e pipeta-se para baixo e 15 vezes para quebrar aglomerados de células. Imediatamente centrifugar a 100 xg durante 5 minutos, seguido de aspiração do sobrenadante.
- Ressuspender celulars em 10 ml de células ES médio e contar as células-tronco embrionárias usando um hemocitômetro. Prepare a seis tubos de 15 ml de suspensão de células, cada uma contendo 5 x 10 6 células ES. Centrifugar a 100 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender cada pelete de células em 0,8 ml de PBS.
- Prepare seis cuvetes de electroporação (4 mm de intervalo) com 0,8 ml as quais as células são transferidas. A cada cuvete, adicionar 1 mg PB-UPA e 20 ug MPB transposase (mPBase); misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Colocar as cuvettes no gelo. Execute eletroporação com um electroporador usando a configuração exponencial em 250 V, 500 mF, e infinito ohm.
NOTA: Tipicamente, a constante de tempo é cerca de 10 a 12 ms para um electroporação bem sucedida, que produzem cerca de 1.500 a 2.000 transformantes resistentes a G418 por 5 X 10 6 células. - Recuperar e reunir as células transfectadas a um frasco T75 contendo meio de células 98 ml ES. Misturar as células por pipetagem suave e, em seguida, transferir células de um reservatório (50 mL). Nósing uma pipeta de 12 canais, transferir 100 ul de células por cavidade às placas alimentadoras previamente preparada de 96 poços (10 no total). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Após 24 horas, as células alimentar fresco diariamente com meio de células ES contendo G418 (150 ug / ml) para seleccionar para os clones de genes preso.
NOTA: Tipicamente cada poço vai conter cerca de dez colónias resistentes a G418. Quando estas colónias crescer até um tamanho suficiente (tipicamente 5-7 dias), as placas de 96 poços (a biblioteca) será replicado em 2 conjuntos de armazenagem e de selecção, respectivamente. Cada uma das placas na biblioteca é designada como "sub-biblioteca", portanto, neste caso, existem 10 sub-bibliotecas.
2. Biblioteca Replication
- Replicar as placas mestras
- 24-48 h antes das colónias resistentes a G418 atingindo 50-60% de confluência, descongelar mais três frascos de mitomicina-C inativado PMEF em dez placas de 96 poços como alimentadores (consulte a seção 1.3). Gelatinaize dez placas de 96 poços por incubação de 0,1% de gelatina (100 ul / poço), a 37 ° C durante pelo menos 15 - 30 minutos; O / N de incubação é aceitável.
- Preparar suspensões de células individuais em placas de 96 poços através de tripsinização. Aspirar o meio das placas de 96 poços e lava-se uma vez com igual volume de PBS (sem Ca 2+, Mg 2+). Adicionar 50 ul de pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA, incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 10 min. Parar de tripsina com 50 ul de meio de células ES. Separar os aglomerados de células por pipetagem cima e para baixo 15 vezes com a pipeta multicanal.
- Transferir 50 uL da suspensão de células tratadas com tripsina para a linha correspondente da placa de alimentação (principal) que já continham 150 ul de meio de células ES e os restantes 50 ul para a linha correspondente da placa gelatinizado (réplica) já contendo 150 ul de meio de células ES. Processar cada linha de células para uma placa mestre e de réplica. Incubar as placas (agora contendo um c 200 ulultura de volume) a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
NOTA: Existem agora vinte placas de 96 poços. - No dia seguinte as células com alimentar 100 ul de meio de células ES fresco contendo 150 ug / ml de G418. Substituir o meio dia até os poços são 80-90% confluentes.
- Congelar as placas mestres
- Quando as placas principais são cerca de 80% confluentes, trypsinize as células como descrito (consulte a seção 2.1.2).
- Retirar as placas de reacção e parar de tripsina com 50 ul de meio 2x (60% de meio de células ES, 20% de FBS, 20% de DMSO) de congelamento. Pipeta cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta multicanal para garantir a mistura adequada do meio de congelamento.
- Colocar as placas de 96 cavidades numa caixa de Styrofoam hermeticamente fechado e colocá-lo no freezer -80 ° C para armazenamento até quatro meses. Quatro meses irá permitir tempo suficiente para completar a selecção de stress e para identificar quais os poços da placa mestre conter os clones de interesse.
NOTA: O armazenamento a -80 & #176; C durante mais de 4 meses irá resultar na redução da viabilidade das células. Pode-se utilizar material crio-tubos em formato de 96 poços que podem ser armazenadas na fase de vapor de azoto líquido durante um longo período de armazenamento.
- Prepare placas de DNA e piscinas sub-biblioteca a partir de placas de réplicas
- 24-48 h antes da replicação de ADN na sequência de placas e piscinas sub-biblioteca, preparar dez placas de 100 mm com mitomicina-C inactivado PMEF para o agrupamento de sub-biblioteca, e dez gelatinizado placas de 96 cavidades para a placa de DNA replica. Consulte a seção 1.3 para procedimento geral.
- Tripsinizar as células em placas de 96 poços réplica (consulte a seção 2.1.2). Durante o passo de tripsinização 10 min, gelatina aspirado das placas de ADN e substituir com 150 ul de meio de células ES contendo G418 (150 ug / mL). Além disso, preparar um reservatório contendo 5 ml de meio de células ES de pooling de os «sub-bibliotecas" na placa alimentador de 100 mm.
- Seguindo tripsinização, parar de tentarpsin com 50 ul de células ES meio de uma linha de cada vez, utilizando uma pipeta de 12 canais. Pipeta cima e para baixo 10 vezes para quebrar aglomerados de células.
- Transferir 50 uL da suspensão de células para a linha correspondente da placa de ADN e transferir os restantes 50 ul para o reservatório que contém 5 ml de meio de células ES. Depois de completar um total de 96 poços, aspirar a forma de um alimentador de placas de 100 mm para que as células reunidas são transferidos. Estas células mutagenizadas reunidas são designados como um 'sub-biblioteca'.
- Repetir para os restantes nove placas de 96 poços. Alimentar as placas de ADN de 96 cavidades e as placas de 100 mm em pool "sub-biblioteca 'diariamente com meio de células ES contendo G418 (150 ug / mL).
NOTA: Existem hoje dez placas de 96 poços 'DNA', e placas de 'sub-biblioteca' dez 100-mm.
- Congelar as placas de ADN. Quando as células na placa de ADN são 80-90% confluentes, aspirar o meio, lavar as células duas vezes com 100ul de PBS e armazenar a -20 ° C para o isolamento de ADN genómico posterior 6. Estas placas de DNA serão rastreadas por PCR para identificar quais correspondente poço na placa "mestre" contém o clone de interesse.
3. induzida pela doxiciclina mutantes homozigotos
- Congelar as piscinas sub-biblioteca e células de passagem para tratamento de doxiciclina
- 24 horas antes de as placas de 100 mm 'sub-biblioteca »com colônias grandes o suficiente para produzir 70-80% de confluência, preparar um conjunto de dez gelatinizado placas de 100 mm para o tratamento doxiciclina.
- Prepare suspensões de células individuais de cada sub-biblioteca (consulte as seções 1.4.1 e 1.4.2 para mais detalhes). Transferência de 5 x 10 6 células para a placa-gelatinizado 100 mm com doxiciclina (1? G / mL); incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Congelar os restantes não-tratados doxiciclina piscinas sub-biblioteca em 5 x 10 6 células por frasco.
- Células passagem na presençade doxiciclina para nocautear Blm
- A passagem das sub-bibliotecas de 1: 8 a cada 2-3 dias na presença de doxiciclina (1? G / mL) durante até duas semanas, durante o qual tempo DOX-induzida knock-out de Blm vai promover a perda de heterozigosidade no célula população, permitindo a geração de mutantes homozigóticos.
4. Selecção de Stress e Isolamento de clones resistentes
- Células tratadas com doxiciclina Assunto para a seleção de estresse
- 24 h antes da passaging células tratadas doxiciclina para selecção de stress, preparar gelatinizado dez placas de 150 mm, em lugar de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora humidificada.
- Prepare uma suspensão de células individuais de cada sub-biblioteca por tripsinização (consulte a seção 1.4.1 e 1.4.2 para mais detalhes). Semente 6.6 x 10 6 células em cada placa de 150 mm em 30 ml de volume total da cultura, distribuir as células uniformemente. Incubar as células com estressor (10 uM paraquat ou omissão de β-mercaptoetanol,em meio de células ES contendo 7,5% de FBS inactivado pelo calor), durante 7 dias, após o que substituir com meio normal de células ES para permitir que as células sobreviventes se desenvolvessem em colónias para a colheita.
- Opcional: Congele a esquerda sobre células tratadas com doxiciclina a 5,0 x 10 6 células por frasco.
- Escolha colónias resistentes à tensão
- Após o restabelecimento da mídia normal para uma semana, observe quantas estresse colónias resistentes estão presentes. Dependendo do número de colónias para ser escolhido, prepare poços suficientes com mitomicina-C inativado PMEF em placas de 96 poços um dia de antemão de acordo (consulte a seção 1.1 para mais detalhes).
- No dia da colheita, aspirado e substituir o meio no alimentador de placas de 96 poços com 100 ul de meio de células ES fresco, colocar novamente em 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora humidificada. Neste momento, a preparação de um L-inferior placa de 96 poços com 50 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por cavidade. Aspirar médio da placa de estresse seleção de 150 mm e adicionar eQual o volume de PBS.
- Defina a micropipeta para 2 l, e 'pegar' colónias sobreviventes na tripsina U-inferior contendo poços, pegando uma colônia por poço. É aceitável para permitir que a placa de sentar-se à temperatura ambiente, até o número desejado de colônias foi escolhido. Em seguida, incubar a placa de fundo em U, a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min.
NOTA: Normalmente, levamos 1 hora de escolher 96 colônias. - Parar a reacção de tripsina de uma linha de cada vez com 50 ul de meio de células ES utilizando uma pipeta multicanal. Pipeta cima e para baixo 15 vezes para se obter uma suspensão de células única e Transferir 100 uL de células para a linha correspondente da placa de alimentação já contendo 100 ul de meio de células ES. Concluir a transferência para a placa inteira. Células de cultura o / n em 200 ul. Na manhã seguinte, médio aspirado e substituir com 100 � de meio de células ES.
- Replicar as placas de 96 poços
- Quando os poços das colónias escolhidas são de 80-90% confluent, replicar-se em duas placas correspondentes, uma para isolamento de ADN e o outro para as células de back-up. Estas placas são gelatinizados e não contêm mitomicina-C PMEF inactivado.
- Aspirar o meio e lava-se com 100 ul de PBS. Adicionar 50 ul 0,25% tripsina-EDTA a cada poço, incuba-se a 37 ° C durante 10 min. Pare a tripsina com 150 ul de meio de células ES, misturar por pipetagem, e transferir 100 ul de suspensão de células para a fila correspondente de duas placas de 96 poços. Mudar médio diário.
- Quando as placas são de 80-90% confluentes, congelar um conjunto de placas como um 'back-up' (consulte a secção 2.2 para mais detalhes). O outro conjunto de placas são ainda mais expandido, tal como descrito abaixo.
- Expansão de células para isolamento de ADN genómico
- Prepara-se uma suspensão de células individuais na placa de 96 poços de ADN (ver 2.1.2 para mais detalhes).
- Transferir suspensão de células de cada poço individual da placa de 96 poços para o poço de uma placa de 24 poços (total de 4) utilizando um micropipette. Verifique se não há contaminação cruzada de todas as células, como as colônias 'escolhidas' são 'clonal' na origem. Células de cultura em 0,5 ml de meio de células ES, mudança de meio dia até poços são 80-90% confluentes.
NOTA: A placa de 24 poços permitirá rendimento suficiente de ADN genómico para análise de PCR.
5. Identificação das PB Sites inserção e Genes Trapped
- Isolamento de DNA genómico a partir de placa de 24 poços: lise de células na placa de 24 poços e isolar ADN genómico livre ARN.
- Realizar Splinkerette PCR (SpPCR) para gerar fragmentos de sequência flanqueadora local de integração do transposão o PB como descrito 7,8.
NOTA: SpPCR é um processo de cinco dias, apesar de hands-on tempo cada dia é mínima.
6. Análise genética dos clones mutantes
- Localize mestre bem e purificar clone de interesse.
- Quando o local de integração PB tem sidomapeado, conceber um iniciador de sentido directo a montante do local de integração a ser usado com um iniciador inverso PB (por exemplo, PB3'-1) e o ecrã 8 da placa de ADN que corresponde à mesma "sub-biblioteca 'a partir do qual o clone resistente à tensão foi retirado. Espera encontrar apenas um poço positivo ao longo de toda a placa de ADN de 96 poços. Descongelar esta bem exacta da placa "mestre" de uma placa de 24 poços em alimentadores e células crescer até 80-90% de confluência.
NOTA: Neste ponto, este poço contém uma mistura de clones preso por genes. - Quando a placa de 24 poços é de 80-90% confluentes, as células Trypsinize e placa 1.000 células ES em um alimentador de placas de 100 mm (assegurar a suspensão de célula única). Passagem as restantes células para um frasco T25 em alimentadores para expansão. Congelar as células do frasco T25 quando as colónias são 80-90% confluentes. Congelar 4 frascos por frasco T25 como back-ups.
- Permitir que as colónias a crescer durante 7 dias e, em seguida, pegar 96 colônias em um de 96 poços feplaca eder. Consulte a seção 4.2 para pegar procedimento. Replicar a placa quando estiver pronto para uma placa de 'DNA' e congelar o outro como '2 nd -master' placa (consulte a secção 2.2 para congelamento).
- Permitir que as colónias se chegar a 80-90% de confluência. Tela a placa de DNA para encontrar poços contendo o clone purificado de interesse. Expandir as células da placa de 96 poços a 2 nd -master de 24 poços e subsequentemente para um frasco T25 (todos em alimentadores). Congelar 4 frascos por frasco T25.
NOTA: neste momento, a linha de células preso-gene é clonal, não foi exposta ao stressor, e é adequado para a produção de rato.
- Quando o local de integração PB tem sidomapeado, conceber um iniciador de sentido directo a montante do local de integração a ser usado com um iniciador inverso PB (por exemplo, PB3'-1) e o ecrã 8 da placa de ADN que corresponde à mesma "sub-biblioteca 'a partir do qual o clone resistente à tensão foi retirado. Espera encontrar apenas um poço positivo ao longo de toda a placa de ADN de 96 poços. Descongelar esta bem exacta da placa "mestre" de uma placa de 24 poços em alimentadores e células crescer até 80-90% de confluência.
- Determinar o número de inserção PB: Descongelar um frasco de a linha de células resistente à tensão e expandir as células num frasco T25 gelatinizado. Isolar DNA genômico e buscar por número de cópias do transposon PB. Isto pode ser conseguido por qPCR segmentação do gene da neomicina.
- Medir o nível de expressão genética: Após confirmando há um único evento de integração PB na linha de células de interesse, medir o nível de expressão do gene preso por RT-qPCR utilizando sondas Taqman específicos para cada gene.
- A sequência de ARNm mutante: gerar um amplicão de ADNc por RCP, utilizando um iniciador a montante de recozimento para um exão e um emparelhamento de iniciador a jusante com a sequência de aceitador de splicing do gene da cassete de armadilha. Sequência do fragmento de cDNA para confirmar que o esperado splicing ocorre no gene preso.
- Remobilizar o transposon piggyBac para testar a relação causal entre o gene preso e resistência ao estresse.
- 24-48 h antes de descongelar as células para PB remobilização, descongelamento e placa DR4 alimentadores em um frasco T25 e duas placas de 100 mm. Pelo menos um dia após os alimentadores de DR4 são plaqueadas sobre o frasco T25, descongelar uma ampola de a linha de células contendo a inserção PB e placa das células no frasco T25 contendo alimentadores DR4. Crescer as células em meio de células ESdurante 48 horas, mudando médio diário.
- Prepara-se uma suspensão de células individuais de células ES. Contar as células com um contador de células automatizado, e transferir 5,0 x 10 6 células ES para um tubo de 15 ml. Centrifuga-se a 100 xg, e ressuspender as células em 800 ul de PBS. Transferir a suspensão para uma cuvete de 4 mm.
- Adicionar 20 ug mPBase Puro para a tina, misture por pipetagem e células electroporate (consulte a secção 1.4 para mais detalhes). Distribuir as células transfectadas em duas placas alimentadoras DR4 100 mm. Células de cultura de O / N em meio de células ES.
- Na manhã seguinte, as células alimentar com meio ES com / ml de cultura de células puromicina e 1 ug por 48 h. Retirar selecção puromicina e continuar a cultura das células durante 5 dias. Quando as colônias são grandes o suficiente para a colheita, escolher em uma placa alimentador de 96 poços (consulte a secção 4.2).
- Quando as células colhidas atingiram 80-90% de confluência, dividir 1/6 th da placa em uma placa de DNA e 1/6 th do plComeram em uma placa G418, deixando 2/3 RDS das células na placa original para ser congelado (consulte a secção 2.2 para congelamento).
- Cultura a placa de ADN em meio de células ES para o isolamento de DNA mais tarde, e a placa G418 em 150 ug / ml de G418 para testar a perda de resistência à neomicina. As cavidades sem células viáveis após 72-96 horas em cultura contendo G418 indicam remobilização bem sucedida do transposon PB-trapping gene.
- Os poços correspondentes na placa 'de ADN' serão rastreadas por PCR para confirmar a transposão PB foi removido. Quando a placa de ADN é 90% confluentes, isolar o ADN genómico de 96 poços em formato de placa 4 para o rastreio por PCR para o restauro da sequência do tipo selvagem e a ausência de neo-IRES como um meio para confirmar a reversão.
- Descongelar as cavidades correspondentes da placa mestre para placa de 24 poços e expandir-se para um frasco T25 (todos com alimentadores). Congelar quatro frascos por frasco T25 como back-up.
7. Geração de mouse Mutantes - Recuperar células ES resistentes das placas principais e usá-los para injecção de embriões para gerar quimera. Aproximadamente 15-20 células ES são injectadas em um indivíduo C57BL / 6 blastocisto. Transferência de 15 blastocistos por rato para o útero de uma fêmea pseudo (estirpe ICR). Companheiro da quimera do sexo masculino (indicado pela células específicas cor da pelagem agouti ES) recuperado do lixo com vários jovens virgens C57BL / 6J fêmeas para testar a transmissão da linha germinal, e para construir uma colônia de ratos mutantes.
- Isolar e fibroblastos da pele da cauda teste de ratinhos mutantes F1 e do tipo selvagem da mesma ninhada de espécies reativas de oxigênio e nível de resistência (ROS) para paraquat 9.
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Representative Results
Numa experiência típica a mutagénese, a transfecção é constituído por um total de 3 x 10 7 células ES com OP-UPA e MPB transposase. Os números de células ES preso de gene gerados em duas experiências independentes estão resumidos na Tabela 1. A eficiência do gene-aprisionamento é de cerca de 0,04%. As bibliotecas de genes-armadilha combinadas contêm 22.400 mutantes independentes, sobre a cobertura completa do genoma do rato (23.000 genes codificadores). Excesso de cobertura poderia ser conseguido através da geração de mais mutantes através de mutagénese repetido e / ou intensificação do processo.
Uma vez que as bibliotecas de genes de armadilhas conter mutações aleatórias, não é possível prever o número de mutantes que possuem um fenótipo de resistência à tensão. Duas selecções independentes para resistência PQ foram realizadas; o rastreio combinado de 22,440 independentes mutações do gene descoberto-trap 17 mutações que conferem resistência celular a PQ (0,08%) (Tabela 1).
<p class = "jove_content"> Temos purificado 3 clones mutantes, o Pigl, Tiam1, e Rffl, a partir das placas principais para posterior análise e produção de mouse. As células com mutação Rffl heterozigotos foram induzidas com sucesso para produzir descendência homozigoto batendo para fora Blm. No entanto, nós não produziu quaisquer mutantes homozigotos dos mutantes Pigl e Tiam1, presumivelmente devido a uma célula ligada letalidade-homozigose. A resistência à tensão destes clones purificados foi confirmada utilizando-se 2 tipos diferentes de stress: omissão de 2-mercaptoetanol (2-ME) e PQ (Figura 2). Após a remoção do PB a partir destes clones, o fenótipo de resistência à tensão associada também foi perdido (Figura 2), confirmando que as mutações do gene de armadilhas são o factor causal. Caracterização dos clones recuperados a partir das placas principais é crucial, uma vez que excluiria lesão estocástica durante a seleção de estresse como a causa do fenótipo observado.De 3As células ES mutantes sendo introduzidas em blastocistos para a produção de rato (Tabela 2), 2 linhas (Pigl e Tiam1) mostram a transmissão da linha germinal. A injeção Rffl produzido apenas uma quimera feminino, que não era um número ideal de quimera para começar. Assim, a falha de transmissão da linha germinativa de Rffl é provavelmente devido a uma quimera incompetente. Testou-se o fenótipo celular de fibroblastos da pele isolados a partir dos ratinhos mutantes Pigl e mostrou que eles mantiveram o nível reduzido de espécies de oxigénio reactivas endógenas (ROS), bem como a resistência à tensão a PQ (Figura 3).
Figura 1. ES mutagénese e selecção de células de stress. Vetor (A) PB-UPA. Um vector de poli (UPA) armadilha imparcial composto de um receptor de splice (SA), o sinal de poli-ciclase hormônio de crescimento bovino (PA), phosphoglycerate cinase (PGK), a neomicina fosfotransferase (neo), o local de entrada do ribossoma interno (IRES), e um dador de splicing (SD) com ATG artificial (em 3 diferentes grelhas de leitura) foi clonado no transposão piggyBac, flanqueado por 3 ' e 5 'long terminal repeat (LTR). (B) A mutagénese aleatória de células ES e selecção de clones resistentes de stress. Células ES foram co-transfectadas por electroporação com OP-UPA e mPBase seguido por plaqueamento em placas de 96 poços. Gene clones foram presas seleccionadas por resistência a G418; uma vez confluentes, que foram divididos em 2 conjuntos de réplicas. Um conjunto de réplicas foi dividido em dois meio para isolamento de DNA e seleção estresse por paraquat (PQ); o outro conjunto de réplicas (master) foi congelado para baixo. Os sobreviventes colônias de células ES recuperados a partir do tratamento de estresse foram analisados molecularmente para a inserção PB por Sp-PCR. Os iniciadores foram então concebidos para o rastreio da placa réplica do ADN a partir do qual o poço que contém o Shibling PQ R clone poderia ser localizado na placa mestre. Estas células são para o ensaio de resistência ao estresse em diferentes estressores e para a produção de mouse. Modificado de Chick et al. 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. resistência estresse em células ES mutantes. (A) A resistência ao 2-mercaptoetanol (2-ME) retirada. (B) A resistência ao paraquat (PQ). São mostrados os do tipo selvagem células parentais ES (C9: amarelo), um controle ES clone de células resistentes ao estresse, (4C11: vermelho), recuperado de um estudo prévio 5, e três clones gene-armadilha (cinza). As células foram submetidas a um tratamento de estresse durante dois dias, após o qual o número de células viáveis foi contado. < em> heterozigotos Pigl, Tiam1, e Rffl. (PB / +: cinza escuro) exibem resistência a estes dois estressores Rffl homozigotos (PB / PB: preto) apresentam forte resistência ao estresse em comparação com os heterozigotos. Resistência a ambos os estressores foi perdida quando as inserções PB foram removidos (+ / +: cinza claro). As barras de erro representam DP da média (n = 4). * P <0,001, # P = 0,01 entre os clones gene-armadilha e do tipo selvagem C9 parental, avaliados pelo teste t de Student. Formação de colónias (C) ES célula sob PQ (10 mM) de tratamento. Os clones ES que resistem a esforços foram capazes de formar colónias em cultura sob tratamento PQ, enquanto o número e tamanho das colónias de tipo selvagem clone foram reduzidos significativamente. Modificado de Chick et al. 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Caracterização de Pigl PB / + fibroblastos. (A) espécies reativas de oxigênio (ROS) nível. Fibroblastos isolados a partir de pele da cauda de tipo selvagem (WT) e Pigl Pb / + ratinhos foram coradas com CM-DCFCA e a fluorescência foi normalizada contra a Hoechst. O teor de ROS foi expressa em unidade de fluorescência relativa (RFU). O valor de P foi avaliada pelo teste t de Student dois atados (n = 8). (B) PQ resistência. Fibroblastos de pele da cauda de tipo selvagem (WT) e Pigl Pb / + ratinhos foram expostos a PQ 4 mM durante 6 horas, após o que a viabilidade das células foram medidas por ensaios MTT. A percentagem de células vivas após o tratamento PQ foi calculada pela relação da absorvância obtida a partir da ce tratou-PQlls e que a partir de células-un tratado. O valor de P foi avaliada pelo teste t de Student um atado (n = 8). Modificado de Chick et al. 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Biblioteca | Sub-bibliotecas | ES estirpe celular | Número de gene preso clone | Número de clones de R PQ |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (BLM tet / tet) | 9000 | 7 |
| 2 | C9PA11 - C9PA20 | C9 (BLM tet / tet) | 13.440 10 | |
| Total | 22.440 | 17 |
Tabela 1. piggyBac gene-trap construção da biblioteca e da recuperação de clones resistentes PQ. Modificação de Chick et al. 7.
| ES clone de célula injectado | Número de quimera recuperado | Transmissão germinal * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | sim |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | 2 | sim | </ tr>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | Não |
Tabela 2. Geração de ratos. Modificação de Chick et al. 7.
* Transmissão germinal foi confirmada por herança do alelo gene armadilha detectado por PCR genotipagem.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
