Summary
구개 개발의 연구는 구개열, 엄청난 의료 부담을 부과하고 외관을 손상하는 지속 남길 수 있습니다 출생 결함의 발생에 의해 좌우된다. 우리는 여기서 구개 개발 및 융합에 관련된 다른 신호 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다 배양 구개 선반 기술을 보여준다.
Abstract
구순 구개열은 모든 출생 결함의 가장 흔한 중입니다. 중간 선 상피 솔기를 형성하기 위해 부착 상피로 덮여 중간 엽 선반에서 보조 구개 형태 (MES). 이론은 MES 세포 융합 미각 (1)을, 중간 엽 전이 (EMT), 세포 사멸 및 마이그레이션 상피를 수행하는 것이 좋습니다. MES의 전체 붕괴는 중간 엽 세포를 둘러싼 구개 합류의 마지막 필수 단계입니다. 우리는 구개 장기 배양 방법을 제공한다. 체외 프로토콜 개발이 융합 동안 생물학적 및 분자 프로세스의 연구를 할 수 있습니다. 이 기술의 응용 프로그램은 외인성 화학 약품에 대한 평가 응답, 규제 및 성장 요인과 특정 단백질의 효과를 포함, 수많은 있습니다. 구개 기관 배양 물이 생체 내 연구에서 사용 불가능 개발의 다른 단계에서의 조작을 포함하여 다수의 이점을 갖는다.
Introduction
구강 안면 쪼개진 조각은 가장 지배적 인 두개 안면 기형이다. 또한, 고려 모든 가능한 두개 안면 결함을 가지고,이 신생아 2에서 두 번째로 가장 흔한 선천성 기형이다. 구개 파열은 약 1 미국 (US) 매년마다 700 출생에서 발생, 구개열의 발생 빈도는 갈라진 달에 입맛 또는 3 일 당 쪼개진 조각 15 아이들과 함께 탄생 475 어린이와 동일하다. 어린이의 약 1 %가 매년 전시를 전세계 두개 안면 dysmorphology 어떤 형태의 탄생.
입천장과 입술의 갈라진 틈이 이상이 환자의 평생의 의미와 매우 비싸고 복잡한 절차가 필요합니다. 구강 갈라진 각 환자에 대한 예상 비용은 약 $ 100,000 4입니다. 구순 구개열 환자의 치료는, 두개 안면 외과, 이비인후과, 유전 학자, 마취를 포함하여 의사의 팀이 필요합니다음성 언어 병리학 자, 영양사, 치열 교정, 보철, 심리학자, 신경 외과 및 안과.
palatogenesis에서 보조 구개는 처음에 수직으로 성장하고 혀의 배부 위에 구개 선반 높이를 받아야 쌍의 outgrowths로 발생한다. 해발 고도에 따라, 한 쌍의 구개 선반 (인간의 마우스에서 E14.5 -E15에서와 주 9) 중간 선을 향해 성장한다. 선반 팁을 포함 내측 가장자리 상피 (MEE)는 중간 선 상피 솔기를 형성 준수합니다.
이것은 간엽 합류 할 수 있도록 중간 엽 전이 및 / 또는 아폽토시스에 의해 상피 이어진다. 반대 MEE의 접착은 그 변경 구개 파열을 일으키는 중요한 이벤트입니다. 그러나, 몇몇 연구는 구개 선반 (5)의 초기 접착력을 조사 하였다. 조골 세포로 중간 엽 세포의 분화에 의해 하드 구개 형성한다. 음자리표를 생산할 수있는 미각의 이상 개발T와 함께 또는 입술의 개입없이 입맛.
미각 기관 배양 기술은 지난 30 년 동안 많은 실험실 -6,7- 위해 널리 사용되었다.
이 프로토콜에서 우리는 세부 사항에 구개 해부 및 정적 기관 배양하는 방법을 설명합니다. 움직 기관 배양의 장점은 선반 구개 융합 할 수 있다는 것이다. 이 기술은 많은 융합 및 신호 실험 8,9에 대한 우리의 실험실에서 성공적으로 사용되었다. 기술의 범위는 광대 한 정적 기관 배양 물 시스템은 외인성 화학 물질에 대한 반응의 평가를 포함하여, 필요할 때마다 이용 될 수 있지만, 다른 경로 및 특정 단백질 규제 성장 인자의 효과.
그림 1. 마우스 Palatogenesis. 쥐의 미각의 발달 단계. (BF) 스캔 ELE대표 발달 시간에 차 구개의 ctron 현미경 (SEM). 빨간색 화살표 : 구개 부착 및 융합의 초기 부분을 보여줍니다. 노란색 화살표 : 융합 후 사라집니다 기본 및 보조 입맛 사이의 공간에 포인트 (PLoS의 하나의 허가 카우프만 (11)에서 재 인쇄).
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Protocol
설명하는 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다.
해부 악기와 문화 미디어 1. 준비
- 예비 세탁 모든 악기는 3 %의 과산화수소와 20 분 동안 121 ℃에서 다음 오토 클레이브로 절개하여 사용할 수있다. 후드에서 진공 흡입으로 0.22 μm의 기공 크기의 필터를 사용하여 항생제와 항진균제 솔루션 BGJb 미디어를 필터링합니다.
문화 장비 2. 준비
- 70 % 알코올 스프레이, 작은 삼각형의 구개 기관을 지원하는 폴리 카보네이트 멤브레인 필터를 잘라하고 건조 할 수 있습니다. 기관 배양 접시 위에 깨끗하고 살균 등변 삼각형 모양의 와이어 그리드 (20mm)를 배치하여 센터 - 글쎄 장기 배양 접시 (60x15 mm)를 준비합니다. 그 다음 B의 1 ㎖로 잘 채우기GJB 미디어 문화 미디어. 참고 : 용지가 입맛을 잠수없이 그리드의 수준에 도달하기에 충분해야한다. 실험에 .Depending 그리드의 상단에있는 멤브레인 필터, 아래 반짝이는면, (그리드 당 3 ~ 4 막)을 배치, 치료 (단백질, 항체 또는 억제제) 미디어에 추가 할 수 있습니다
3. 마우스 배아 수집 및 문화에 대한 준비
- 야생형 마우스 배아를 얻기 위해, 사용은 13.5 임신 한 CD-1 마우스 유전 적 배경의 피로를 시간이 초과되었습니다. 70 % 에탄올로 해부 영역을 청소합니다.
참고 : 마우스의 다른 균주를 사용할 수 있습니다. 때문에 우리는 더 큰 쓰레기 수의 CD-1 마우스를 선호합니다. - 승인 된 프로토콜을 사용하여 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음에 5 %의 이소 플루 란 E13.5 DPC (일 성교를 게시)에서 임신 한 쥐를 안락사.
- 악기에 복부 머리 스틱을 피하기 위해 복부 복부 표면에 70 % 에탄올 스프레이. 그리고 복부 복강을 엽니 다날카로운 무딘 운영 가위 마이크로 해부 집게를 사용하여 자궁을 찾습니다. 집게를 사용하여, 전체 자궁을 들어 올려 자궁 몸을 절단 및 광 운영 가위로 자궁 뿔의 끝을 몸에서 분리.
- (관리 및 실험 동물의 사용을위한 프로토콜 가이드에 따르면) 얼음 위에 깨끗한 종이 타월에 자궁을 놓습니다. 오염을 방지하기 위해 다른 깨끗한 종이 타월로 자궁을 커버. 사용하기 전에 추가로 70 % 에탄올을 사용하여 스프레이기구를 살균. 자궁과 태아는 얼음에 실험실로 운반 할 수있다.
- 오픈 층류 후드에서 신중하게 날카로운 무딘 운영 가위 마이크로 해부 집게를 사용하여 난황에 작은 구멍을합니다. 개방 폭 넓은 확인하고 부드럽게 난황에서 배아를 외면 화하다하기 위해 밀어 넣습니다.
- 차가운 인산 완충 생리 식염수 1X (PBS)의 pH 7.4와 페트리 접시에 즉시 배아를 전송합니다. 적절한 단계, 예를 보장하기 위해몸체, 머리의 크기와 형태에 대한 사지 해부 현미경 배아 아민.
참고 : 개발의 오른쪽 단계에 있지 배아 실험에 사용되지 않습니다.
그림 2. 사지 버드 형태학은. 앞과 뒷다리는 숫자 사이의 웨빙 들여 쓰기의 정도를 검사한다. E13.5에서, 모든 자리 응축은 숫자 사이의 웨빙과 말초 들여 쓰기가 매우 뚜렷한 표시로, 눈에 띄는. 뒷 자리는 반 하루 뒤에 있습니다 (12) 상단 행 :. 앞다리, 낮은 행 : 뒷다리.
4. 미각 해부
- 해부 현미경 PBS와 페트리 접시에 한 번에 하나의 배아를 놓습니다. 사용 작은 해부 가위와 핀셋은 태아의 몸에서 머리를 분리합니다.
- 조심스럽게 집게와 눈높이 위의 마우스 두개골을 들고 (피상악 프로세스) 립 라인의 양측에 두 개의 절개를 만든다. 그리고 하악과 혀를 제거합니다. 눈 높이에서 절단하여 상악 프로세스 영역을 분리하고, 뇌, 눈, 코 중격 및 인접 조직을 제거합니다.
그림 3. 구개 조직이 입천장 선반이 상승했다 13.5 배아에서 수집하지만 연락을하지. 구개 선반이 정적 모델에서 72 시간 동안 공기 미디어 인터페이스에서 필터에 장기 문화에 넣었다. (A) 수준 E13.5 배아에 해부. (B) 블루 스타 해부 동안 집게로 조직을 유지하기 위해 지역의 경계. 사다리꼴 필터 멤브레인에 배치 해부 구개 선반 (C)보기. 배양 접시의 (D) 측면 뷰를 배치 한 후 해부 입맛과 문화 미디어의 추가.
- 후방에 전방에서 동양을 돕기 위해 첨부 된 기본 미각을 유지, 구개 구강 측면을 놓고 비중격과 주위 조직을 제거합니다. 숟가락 주걱을 사용하여 매우 신중하게 배양 접시에 그리드에 준비된 필터에 (코 쪽 아래) 구개 선반을 전송합니다. 주 : 적절한 공기 미디어 인터페이스를 허용하는 미디어의 볼륨을 조절합니다.
- 스테레오 현미경, 기본 미각을 해부하고 서로 가까이 구개 선반을 배치 핀셋을 사용합니다. 그들이 접촉에 배치되지 않은 경우 구개 선반 융합되지 않습니다. 입천장의 앞쪽 부분이있는 삼각형의 멤브레인 필터를 잘라. 사다리꼴 모양은 미각의 앞쪽 부분을 국산화에 도움이됩니다.
- 배양 구개 가구 단독으로 또는 2 종 BGJb 배양 배지를 사용하여 동일한 기관 배양 접시에 3 개.
5. 배양 마우스 구개 선반
- tissu을 품어72 시간 동안 가습 가스 혼합물 (5 % CO 2, 95 % 공기)에서 37 ° C에서 ES, 그리고 매체마다 24 시간을 변경합니다.
조직 학적 분석 6. 미각 처리
- / N은 4 °에서 4 % 포름 알데히드 / 인산염 완충 생리 식염수 O와 문화에 72 시간 후 입맛을 수정 C. 그런 다음, 부드럽게 전송 피펫 PBS로 배양 접시에 조직을 씻는다. 카세트를 포함에 실험실 와이프과 장소의 조각에 입맛을 감싸.
참고 : 실험실 와이프의 입맛 포장은 탈수 과정에서 자신의 손실을 방지 할 수 있습니다. - 70 %, 80 % 및 다음과 같은 정규 파라핀 매립 절차이어서 1 시간 동안 100 % 에탄올 세척, 최대 조직 탈수. 내장의 경우, 트레이에 직면 미각의 앞쪽 부분을 놓습니다.
- 전치부에서 관상 방향으로 직렬 6 μm의 섹션을 잘라. 전체 섹션 미각은 350-450 섹션에 ì을 얻을 것입니다기능. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E). 10 점수 앞서 설명한 평균 퓨전 점수를 사용하여 매 20 번째 섹션 (MFS) 규모 (표 1)와 섹션을 얼룩. (8)
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Representative Results
기술이 연구 experiments.The 다음의 다른 종류에 적용될 수는 구개 융합에 체외 니코틴 기형 효과를 시험하기 위해 설계되었다. 마우스의 두 균주는이 실험에 이용 된, CD1 및 C57.Palatal 조직 니코틴 헤미 0.06 및 6 mM의 농도로 처리 하였다. 그것은 구개 융합 패턴 및 타이밍이 서로 다른 두 균주에서 다르다는 것을 관찰 하였다. CD1 쥐에서, 대조군 구개 가구는 시간 의존적 방식으로 융합을 계속했다. 그러나, 특히 6MM 니코틴 농도 (그림 4A)에서 처리 된 그룹 니코틴 지연 융합. CD1 마우스 입맛의 조직학 섹션 제어 시편에 72 시간 후에 총 융합 하였다. 니코틴의 낮은 복용량에서 구개 선반은 준수하지만 상피 세포는 배양 3 일 후에 남아있다. 니코틴의 고용량에서 배양 구개 선반 배양 72 시간 후 연락을하지 않았다.
(도 4B)에 대한 니코틴의 0.6 mM의 농도에서 배양 시료와 비교하여 48 시간 동안 배양 하였다 그러나 C57 마우스의 구개 선반 6 mM의 농도에서 더 높은 점수를 보였다. C57 마우스의 입맛의 조직학 섹션은 치료 그룹에 연속 상피 이음매가 중간 선에서 유지 것으로 나타났다. 융합 72 시간에서 대조군 단지 관찰되었다.
우리는 마우스의 두 종류에서 그 구개 융합은 니코틴의 과다 복용에 의해 영향을 받았다 관찰했다. 그러나 C57에서 입맛은 니코틴에 더 현명한했다. 결론적으로, 우리의 결과는 쥐의 유전 적 배경이 구개 조직에서 니코틴 반응에 영향을 미치는 것을 보여줍니다.
| 점수 | 기준 |
| 1 | 더 접착 비 융합. |
| (2) | 몇 가지 명백한 접착 비 융합. |
| 3 | 일부 MEE 층의 붕괴와 명확한 부분 중간 엽 합류와 접착. |
| 4 | MEE 세포 또는 심 나머지의 일부 흔적을 완료 융합. |
| (5) | MEE 세포 또는 심 볼의 증거와 완벽한 융합. |
표 1 : 평균 퓨전 점수 (MFS) 규모 (강 및 스바, 2002). 전방 각 미각에 대한 점수를 계산 (섹션 1-150), 중간 (섹션 150-300)과 후방 (섹션 300-450). (8)
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Discussion
이 문서의 프로토콜은 배아 일 13.5에서 배아에서 구개 선반을 해부하는 방법을 제공한다. 마우스 배아 구개 가구는 37 ° C에서 95 % O 2, 5 % CO 2 분위기하에 무 혈청 배지에서 배양 하였다. 성공적인 구개 해부는 문화의 완료에 안락사 쥐의 배아 시간의 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존한다. 구개 융합을 좌우하는 가장 중요한 요소 중 하나는 기관 배양을 시작하는 데 걸리는 시간이다; 배아는 배아 일 13.5 보조 구개 선반은 수평으로에있을 필요가 있지만, (그림 1)을 융합하기 시작하지 않았습니다.
절차를 수행하는 동안 또 다른 중요한 점은 난황에서 배아의 exteriorization입니다. 이 단계는 얼굴 구조에 대한 손상을 방지하기 위해 세심한주의를 요구한다. 배아 SAC로부터 제거되면, 헤드로부터 제거페트리 접시에 넣고 몸을 양쪽에서 광섬유 조명 실체 현미경으로 볼 수있다. 하악과 혀가 입천장을 노출, 제거됩니다. 뇌 및 잔류 조직을 눈 높이에서 제거됩니다. 이 시점에서 그 주위 가구 상피층을 고려하는 것이 중요하다. 이들 세포의 무결성을 유지하기 위해 매우 조심스럽게 조직을 조작 할 필요가있다. 상피 세포는 MES의 준수 및 형성에 대한 책임이 있습니다.
각 해부 미각은 비중격에서 어떤 연골을 청소 아래로 구강 측 설정되어 있습니다. 이 조직은 구개의 전방 측에 있으며 하얀 더 응축 나타납니다. 불필요한 조직이 없도록 구개 선반 배양 접시로 옮겨 여과막의 상부에 배치된다. 가구의 위치가 스테레오 해부 현미경으로 다시 검사된다. 그들은 구개 융합에 부착하고 추가 할 수 있도록 함께 눌러야합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100 x15 mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60 x15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| CO2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 |
References
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