Introduction
رئيس تثبيت أو رئيس الزجرية هو أسلوب من شل حركة رأس الحيوان عن طريق ربط الإطار أو لوحة على الجمجمة للقط جامدة. وقد تم اعتماد هذه التقنية لالتحفيز الحسي الدقيق، والاستشعار السلوكي مع أو بدون تسجيل العصبي في الحيوانات المستيقظة 1-3 والعلامات juxtacellular خلال دورة النوم واليقظة 4. كما أنها تستخدم في الجسم الحي تصوير الدماغ 5،6. الآن تقنية رأس تثبيت أداة تستخدم عادة في علم الأعصاب والبحوث السلوكية.
في الأساس، رئيس التثبيت التقليدية يتطلب مرفق جراحي من المعدن الرأس المشاركات على الجزء العلوي من الجمجمة 6-8. ثم فرضت المرفقات إلى منصة ثابتة، مما أدى إلى شل حركة الرأس. بحث العصبي في الحيوانات المستيقظة مثل العصبية و / أو تسجيل البصرية، تدخل دوائر الدماغ، ويرافق تصوير الدماغ عن طريق الجراحة زرع باستخدام الأكريليك الأسنان. بناءا عليه،يبدو مهمة بسيطة لتنفيذ تثبيت الرأس في تلك المختبرات عندما يكون ذلك ضروريا تجريبيا. وينبغي تصميم الإطارات لتكون خفيفة الوزن وصغيرة بما فيه الكفاية على عدم تعكير صفو السلوك الطبيعي الحيوان في أقفاص وطنهم. كما يوفر الصلابة الميكانيكية عندما فرضت على منصة ثابتة. لديها أيضا توافق مع الحياة اعتمادا على أغراض تجريبية. وبالتالي، فمن الصعب من الناحية الفنية لتصميم وتصنيع هذه الوظائف الرأس في معدات المختبرات العامة.
في هذه الدراسة، وصفت طريقة رئيس تثبيت الرواية، وتوفير صلابة ميكانيكية من خلال لقط مريحة دون استخدام المعادن الرأس المشاركات. باستخدام الطريقة، يمكن أن يتم تثبيت الرأس تحت ظروف المختبر العامة، حيث عادة ما يتم إجراء جراحة زرع في القوارض لدراسة الدماغ. يتم استبدال المعادن الرأس المشاركات مع الاكريليك الاسمنت الراتنج مصبوب جزئيا بار رئيس التثبيت حسب الطلب وعملية الصب يتم خلال implanجراحة الكساء. يوفر شريط تثبيت التوافق مكانية عالية مع غرسات أخرى، مثل تحقيقات تسجيل العصبية، أقطاب التحفيز. كما أنه يبسط خطوات تحامل رأس الحيوان على منصة تثبيت عن طريق إزالة المسمار الربط. استخدمنا هذه الطريقة في الدراسة السلوكية السابقة وخلصنا إلى أن هذه الطريقة هي سهلة التنفيذ ومريحة في التجريب العملي 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق:
تمت الموافقة على هذه التجربة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة كيونغ بوك الوطنية، وأجريت وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المعهد الوطني للصحة، 1996). بعد التجربة، تم ذبح الحيوانات تحت غاز ثاني أكسيد الكربون القتل الرحيم.
1. تصميم شريط الرأس التثبيت للجرذان
ملاحظة: هذه الخطوة هي توجيهي عام لتصميم شريط التثبيت. أي تعديل عن البعد والمادية ممكن اعتمادا على الحيوانات أو زراعة. تصميم شريط الرأس التثبيت باستخدام برامج CAD يوصى لكن ليس من الضروري.
- استخدام برنامج CAD لتصميم شريط التثبيت.
- تصميم شريط التثبيت من شكل مستطيل (123 × 35 × 6 مم) (الشكل 1A). جعل الشق مستطيلة (16 × 20 مم؛ ميناء) في منتصف شريط التثبيت. إضافة المنحدرات أو حزوز حركتيح بمثابة دليل السكك الحديدية على حدود ميناء (الشكل 1A-لذلك، 1B الشكل -arrows).
ملاحظة: تأكد من أن منطقة الميناء تغطي المستطيل يقدر الجمجمة الفئران على مدى الدماغ للسماح المداخل الرأسية باستخدام تتلاعب التجسيمي على معظم مناطق الدماغ من خلال حج القحف. - نعلق لوحات (50 × 20 × 6 مم) مع اثنين من الثقوب رسو ممدود على جانبي شريط التثبيت. تأكد من أن هذه الثقوب تمر مسامير 6 مم (الشكل 1A-د). جعل حفرة قطرها 3 مم أمام الميناء لقفل هوك (الشكل 1A-ب).
- جعل مربع جود الكلمة (135 × 305 ملم) والجدران الجانبية (305 × 76 ملم). حفر اثنين من الثقوب قطرها 6 مم كما هو مبين في الشكل 1A (الشكل). إضافة الجدران الداعمة على شريط التثبيت (الشكل 1A-ه).
- تصميم شريط التثبيت من شكل مستطيل (123 × 35 × 6 مم) (الشكل 1A). جعل الشق مستطيلة (16 × 20 مم؛ ميناء) في منتصف شريط التثبيت. إضافة المنحدرات أو حزوز حركتيح بمثابة دليل السكك الحديدية على حدود ميناء (الشكل 1A-لذلك، 1B الشكل -arrows).
- تصنيع شريط تصميم والمربع وتجميع كل منهم باستخدام cyanoacrylate كماهو مبين في الشكل 1A (الشكل). تجميع شريط على مربع باستخدام مسامير 6 مم. تطبيق منحدر من خلال تعديل موقف المسمار شريط لرئيس تثبيت مريح (الشكل 1A-الشكل).
ملاحظة: بالنسبة للفئران، والبعد من شريط التثبيت هو 60 × 20 × 4 ملم (تتألف من طبقتين من 2 ملم لوحات الاكريليك سميكة). المنفذ مربع من 8 مم العرض (الأعلى) و 9 × 10 ملم (أقل) كما هو مبين في الشكل 1C. لوحات ترسيخ هي نفس الحجم من الفئران. الجدران لوحة مربع والجانب هي 100 × 72 مم و 100 × 50 مم، على التوالي.
2. رئيس المركب البناء خلال جراحة زرع
تنبيه: كن حذرا عند التعامل مع راتنج الاكريليك الأسنان. السائل قد يسبب تهيج الجلد. وضع على قناع وارتداء القفازات. العمل في منطقة جيدة التهوية.
- التحضير قبل الجراحة
- بإحكام التفاف الحدود من ميناء شريط التثبيت باستخدام ا ف بفيلم araffin لمنع التصاق الراتنج التطبيقية الاكريليك لشريط (انظر الشكل 1B والشكل 2A). معطف الحدود من الميناء الفيلم البارافين مغطاة بطبقة رقيقة من راتنج الأكريليك.
- استخدام الأدوات الجراحية المعقمة. بدقة تطهير إطار التجسيمي ومحيطها باستخدام 70٪ الكحول الإيثيلي.
- إجراء جراحة زرع التجسيمي
- تخدير الحيوان عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط كوكتيل (2 مل / كغ) من الكيتامين 10 مل (50 ملغ / مل)، زيلازين هيدروكلوريد 1.5 مل (23.32 ملغ / مل)، والمالحة 2.5 مل. تأكد من أن الحيوان تخدير كامل ولم يستجب الى الذيل وأخمص القدمين القرصات. حقن خليط كوكتيل من 1 مل / كغ خلال عملية جراحية عند الضرورة.
- إصلاح الحيوان إلى جهاز التجسيمي. تطبيق مرهم على العينين لمنع جفاف أثناء الجراحة. حلاقة وتنظيف فروة الرأس مع الايثانول 70٪. إعطاء الحقن تحت الجلد من 2٪ ليدوكائين وشق هيئة السلع التموينيةليرة لبنانية على طول خط الوسط من الجمجمة. تتخلص تماما من السمحاق. شطف مع المياه المالحة عدة مرات.
- جعل لدغ حفرة الحفر بالقرب من حافة الجمجمة. مسامير زرع 4-5 المنعطفات (تصل إلى 1 مم العمق) من على سطح الجمجمة لمنع خرق جافية. تأكد من عدم تسرب السائل النخاعي والدم على سطح الجمجمة بعد المسمار الزرع. شطف مع المياه المالحة وتجفيف سطح الجمجمة باستخدام الهواء نفخة، وخصوصا حول مسامير.
- معطف سطح الجمجمة مع طبقة رقيقة من "لاصق الأسنان (سوبر بوند C & B)". لا تغطي كامل سطح الجمجمة بما في ذلك bregma إذا تم جدولة زرع قطب كهربائي إضافي. استخدام bregma لوسم الإحداثيات حج القحف. أقطاب الزرع و / أو مايكرو محرك وإصلاحه على الجمجمة من خلال تطبيق راتنج الأكريليك حوله.
- تطبيق راتنج الأكريليك إضافية على أعلى من الاسمنت الأسنان. استخدام كمية مناسبة من راتنج الأكريليك لترك مساحة كافية بين ملء المغلفة شريط الراتنج لد الراتنج الأولي التركيب عند تثبيت مكان مسامير و / أو أقطاب (الشكل 2A).
- وضع شريط الرأس التثبيت 5 ملم أو أكثر فوق سطح الجمجمة ومواءمة وسطها (الشكل 2A -Left).
- تطبيق راتنج الاكريليك في الفجوة بين قاعدة الجمجمة وراتنجات الأولية المتزايدة. (الشكل 2A -Center). الانتظار حتى يصبح من الصعب الراتنج.
- إزالة الأذن بار وسحب المركب مصبوب من ميناء شريط التثبيت. (الشكل 2A من اليمين). تطبيق بعناية راتنج الاكريليك إضافية حول القضبان حافة المركب مصبوب إذا لزم الأمر.
- شطف سطح الجرح من فروة الرأس بمحلول ملحي معقم. حقن مضاد حيوي (enrofloxacin، 5 ملغ / كغ الشوري) و(طرطرات بوتورفانول، 2 ملغ / كغ الشوري) مسكن فورا بعد الجراحة. إيواء الحيوانات بشكل فردي في قفص واحد.
3. التعود الحيوانات إلى الرأس التثبيت
ملاحظة: هذه الخطوة ديالكتبة جداول التعود على أساس تقديرات المؤلفين الناجحة تجريبيا. لمحة عامة عن إجراء التعود على الرأس التثبيت، راجع شوارتز 10 أو 11 قوه العمل.
- إعطاء فترة نقاهة كافية (أسبوع أو أكثر) للحيوانات. في يوم 1، والتعامل مع الحيوانات في كثير من الأحيان على دورات قصيرة المقسمة.
- في اليوم التالي (يوم 2)، وتعريض الحيوان للبيئة التثبيت (مربع). لا تدخل رئيس المركب بهم إلى ميناء شريط التثبيت. ترك الحيوانات والتعود على البيئة. آمن والاستيلاء على المركب الرأس باستخدام اليد ل1-2 ثانية، والإفراج عنها فورا. كرر التثبيت على المدى القصير من جهة الاستيلاء على عدة مرات.
- في يوم 3، روض الحيوانات لالرأس التثبيت.
- جلب الحيوانات من أقفاص الداخل وتسويتها في المربع توجيه رؤساء نحو ميناء شريط التثبيت. الاستيلاء على المركب الرأس وأدخله في ميناء شريط التثبيت.
- ربط المركب (الحيوانالرأس) لربط قفل شريط التثبيت باستخدام الشريط المطاطي. الوقوف لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: لا تلمس الجذع أو ذيل الحيوان بعد التثبيت، الأمر الذي يؤدي الحيوان لصرير والنضال زيادة التوتر الحيوان. عندما يستمر الحيوان يكافح أكثر من 1 دقيقة، والإفراج عنها والمحاولة لاحقا. من هذه الخطوة، تظهر الحيوانات البول والبراز إفراز كلما تعرضت لرئاسة التثبيت ولكن هذا يحصل تدريجيا خفض كعائدات التعود. - استرداد تأمين الشريط المطاطي وإخراج المركب خارج الميناء. وضع الحيوانات الى قفص المنزل وتقديم قطعة من الحبوب أو بذور عباد الشمس في قفص المنزل كمكافأة. بدء المحاكمة القادمة في 30 دقيقة. كرر 3.4.1 إلى 3.4.4 خمسة أو أكثر خلال يوم واحد.
- في يوم 4-7، وتعريض الحيوانات لرئاسة التثبيت كما هو موضح في بروتوكول 3.4. تدريجيا زيادة مدة رئيس تثبيت (10 دقيقة، 20 دقيقة، 30 دقيقة، و 50 دقيقة كعائدات التعود).
ملاحظة: إذا لم تفعل الحيواناتتي إطعام مكافأة الغذاء، يمكن أن يكون علامة على وجود مستوى عال من التوتر. لا زيادة وقت التثبيت. إذا الحيوانات تظهر المتكررة تكافح السلوك، روض لهم لفترة أطول. - تحقق من وزن الجسم الحيوان يوميا. النظر في التعود ناجحة عندما وزن الجسم يتناقص. الشروع في المهام السلوكية مع تثبيت الرأس بعد التعود ناجحة.
ملاحظة: الناجحة التعود يسهل التدريب السلوكي لاحقة (الشكل 3E وF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا الأسلوب رئيس تثبيت ينطبق على كل من الفئران والجرذان. تلقت مجموع ثمانية فئران زرع الثنائي لتحفيز كهربائي في حزمة الدماغ الأمامي وسطي. لمدة أربعة للخروج منها، وتطويعه أقطاب سلك التنغستن (ميكرودريفيس) تم زرعها بالإضافة إلى منطقة forelimb M1 (الشكل 2C). بالنسبة للفئران (ن = 2)، تم زرع أربعة أقطاب أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ في المناطق القشرية الأمامية / القذالي. أثناء الجراحة، ومصبوب mounters رئيس لتثبيت الرأس في كل من الجرذان والفئران، كما وصف في بروتوكول القسم 2. بعد التعافي من الجراحة، وتعرضوا لجلسات يومية من رئيس تثبيت إما التعود أو المهمة السلوكية. بقي mounters رئيس مصبوب حتى نهاية التجربة (40.5 ± 1.73 (يعني ± SD) يوما بالنسبة للفئران و 81 ± 5.66 (يعني ± SD) يوما بالنسبة للفئران بعد الجراحة). تعرض الفئران يوميا 40-60 دقيقة رأس تثبيت أثناء مهمة السلوك. تعرض الفئران يوميا 20-40 دقيقة من تكونhavior المهمة.
في السابق كنا نستخدم هذا الأسلوب لتدريب الفئران الشد والجذب وسيلة للضغط تحت رأسه التثبيت. وكانت مكافأة التحفيز الكهربائي مباشرة من حزمة الدماغ الأمامي وسطي. على الرغم من أنه يتسبب السلوك الحركي المبالغ فيه، واستمر رئيس تثبيت بحزم دون فصل المركب عرضي.
بعد التعود، لرسو السفن والمركب الرئيسي في ميناء شريط التثبيت اكتمل في بضع ثوان قبل قفل الشريط المطاطي على هوك. عندما قدم للمرة الأولى إلى تثبيت الرأس، الحيوانات ويعرض تكافح السلوكيات مثل تشغيل في المكان، تصويب أرجلهم (3A الشكل وB). ومع ذلك، فإن مثل هذه السلوكيات تضاءلت مع التعود. ويمكن التأكد من نجاح التعود أن الحيوانات لا تظهر أي سلوك أكثر تناضل مع رئيس ثابتة (الشكل 3C وD).
الشكل 1. تصميم شريط الرأس التثبيت.
(A) أسماء المكونات من شريط الرأس التثبيت. أ) الميناء؛ ب) قفل هوك؛ ج) هيئة شريط التثبيت. د) ترسيخ الثقوب. ه) دعم الجدار؛ و) لوحة ترسيخ. ويصور تصميم مربع التثبيت في أقحم. وتستخدم اثنين من الثقوب في الجدار الجانبي لتحديد المواقع هندسيا شريط التثبيت. (B) عرض منظور تصميم شريط تثبيت الرأس بالنسبة للفئران. السهام السوداء تشير إلى الحدود تغطية الأفلام البارافين. (C) تصميم الميناء لتثبيت الرأس في الفئران. (معدلة من الشكل 1 من روه وآخرون. 9) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. بناء المركب صب أثناء الجراحة.
(A) الناقد آل الخطوات صب المركب الرأس. يجب زرع (يسار) مسامير (الأشكال T باللون الأسود) عمودي على الجمجمة (الرمادي) السطح. وهناك طبقة رقيقة من الأسمنت الأسنان الراتنج لاصقة (الأخضر) تغطي مسامير وعلى سطح الجمجمة. (مركز) بعد زرع اعتمادا على أغراض تجريبية، تمتلئ راتنجات الاكريليك إضافية (البرتقالي) في الفجوة بين الراتنج المغلفة الأولي على راتنجات ميناء وقاعدة على سطح الجمجمة ويصبح جزءا من المركب الرأس. (يمين) بعد راتنجات الاكريليك وأضاف هي مجموعة الصلب، ويمكن أن يتم الافراج عن المركب الرأس من الانزلاق خارج الميناء. خطوط سوداء صلبة تشير الأفلام البارافين. (معدلة من الشكل 1 من روه وآخرون. 9) (B) مصنوعة رئيس المركب على الفئران مستعدة للإفراج عن (بعد خطوة من A-مركز). (CD) مصبوب راتنجات الاكريليك بمثابة المركب الرأس. بعد الجراحة، لا يزال تحت التخدير، ويتم الإفراج الحيوانات من شريط التثبيت. السهام السوداء تشير القضبان دليل مطابقة لشكل من الميناء. ملاحظة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجرذان والفئران الرقم 3. رئيس الثابتة.
(AB) عندما تتعرض الحيوانات في البداية لرئاسة التثبيت، تنبعث تكافح السلوك. (CD) وعائدات التعود، تظهر الحيوانات سلوك أقل تكافح وعادة الجلوس على الأرض من منصة ثابتة. (EF) نتيجة للأداء المهمة السلوكية من نجاح (E) وغير ناجحة (F) التعود البيئة رئيس التثبيت (معدلة من الشكل 3 من روه وآخرون 9). عدد مكافأة يشمل كلا مجانية (لأغراض تشكيل) ويتوقف ذراع سحب. في كلتا الدورتين، ويظهر الفئران الذي تعود بالقدر الكافي إلى ضعف أداء مكافأة إلا عن طريق رافعة عرضي تسحب من السلوك غير يتوقف.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007 (2014).
