Introduction
Cabeça de fixação ou de contenção da cabeça é uma técnica de imobilização da cabeça do animal, anexando uma armação ou placa sobre o crânio de fixação rígida. A técnica foi adotada para estimulação sensorial preciso, detecção comportamental com ou sem gravação neural em animais acordados 1-3 e para a rotulagem juxtacellular durante o ciclo sono-vigília 4. É também utilizado para imagiologia in vivo cérebro 5,6. Agora técnica de fixação da cabeça é uma ferramenta comumente usada em neurociência e pesquisa comportamental.
Basicamente, fixação de cabeça tradicional exige fixação cirúrgica de Metal Head-posts no topo do crânio 6-8. As peças de fixação são, em seguida, fixar-se uma plataforma fixa, o que resulta na imobilização da cabeça. Investigação neurofisiológica em animais acordados como neural e / ou gravação óptica, a intervenção circuitos cerebrais, imagens do cérebro é acompanhada por cirurgia de implantação usando acrílicos odontológicos. Portanto,parece uma tarefa simples para implementar a fixação de cabeça naqueles laboratórios quando é necessário experimentalmente. Os quadros devem ser projetado para ser leve e pequeno o suficiente para não perturbar o comportamento natural do animal nas suas gaiolas. Ele também fornece rigidez mecânica quando amarrado à plataforma estacionária. Tem ainda mais a biocompatibilidade dependendo fins experimentais. Portanto, é tecnicamente difícil de projetar e fabricar tais cabeça-lugares em equipamentos de laboratório geral.
Neste estudo, um método de fixação de cabeça novela é descrita, proporcionando rigidez mecânica por meio de aperto conveniente, sem recurso a grampos metálicos cabeça-mensagens. Ao utilizar o método, de fixação de cabeça pode ser feita sob condições laboratoriais gerais, em que a cirurgia de implantação é geralmente realizada em roedores para estudo do cérebro. O metal cabeça-as mensagens são substituídos com cimento acrílico moldado parcialmente resina por uma barra de fixação de cabeça feito por encomenda e o processo de moldagem é feito durante IMPLANcirurgia tação. A barra de fixação possui alta compatibilidade espacial com outros implantes, como sondas de gravação neurais, eletrodos de estimulação. Também simplifica passos de fixação da cabeça do animal na plataforma de fixação por parafuso removendo-fixação. Nós usamos esse método no estudo comportamental anterior e concluímos que este método é fácil de implementar e conveniente em experimentação prática 9.
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Protocol
Declaração de Ética:
Este experimento foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Kyungpook National University, e foi realizada de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto Nacional de Saúde, 1996). Depois de experimento, os animais foram sacrificados sob dióxido de carbono eutanásia.
1. Projeto do Bar Cabeça-fixação para ratos
NOTA: Este passo é uma diretriz geral para um design de barra de fixação. Qualquer modificação sobre a dimensão e material é possível, dependendo animais ou implantes. Projetando um bar cabeça-fixação usando o software CAD é recomendado mas não necessário.
- Use um software de CAD para projetar uma barra de fixação.
- Projetar um bar fixação de uma forma retangular (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1A). Faça um entalhe rectangular (16 × 20 mm; porta) no meio da barra de fixação. Adicionar encostas ou recuos which servir como um trilho de guia sobre as fronteiras da porta (Figura 1A-A, Figura 1B -arrows).
NOTA: Certifique-se de que a área do porto cobre o retângulo prevista de crânio do rato sobre o cérebro para permitir acessos verticais utilizando um manipulador estereotáxica para a maioria das áreas do cérebro por meio de uma craniotomia. - Montar as placas (50 x 20 x 6 mm) com dois furos de fixação alongadas em ambos os lados da barra de fixação. Certifique-se de que esses buracos passar parafusos de 6 mm de diâmetro (Figura 1A-d). Fazer um buraco de 3 mm de diâmetro na frente da porta de um gancho de bloqueio (Figura 1A-b).
- Faça uma caixa com um andar (135 × 305 mm) e paredes laterais (305 × 76 mm). Perfurar dois buracos de 6 mm de diâmetro, como mostrado na Figura 1A (inset). Adicionar paredes de suporte sobre a barra de fixação (Figura 1A-E).
- Projetar um bar fixação de uma forma retangular (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1A). Faça um entalhe rectangular (16 × 20 mm; porta) no meio da barra de fixação. Adicionar encostas ou recuos which servir como um trilho de guia sobre as fronteiras da porta (Figura 1A-A, Figura 1B -arrows).
- Fabricação a barra concebida e caixa e montar cada um deles usando como cianoacrilatomostrado na Figura 1A (inset). Monte a barra na caixa com parafusos de 6 mm de diâmetro. Aplicar inclinação, ajustando a posição do parafuso da barra de fixação de cabeça ergonômica (Figura 1A-inserção).
NOTA: Para os ratos, a dimensão da barra de fixação é de 60 × 20 × 4 mm (que consiste em duas camadas de 2 mm de espessura) painéis de acrílico. A porta é quadrada de 8 mm de largura (superior) e 9 x 10 mm (inferior) tal como mostrado na Figura 1C. Placas de ancoragem são do mesmo tamanho de ratos ". As paredes placa caixa e laterais são 100 × 72 milímetros e 100 × 50 mm, respectivamente.
2. Cabeça Mounter Construção durante cirurgia de implantação
CUIDADO: Seja cauteloso ao lidar com resina acrílica dental. O líquido pode causar irritação na pele. Colocar uma máscara e usar luvas. Trabalhar em uma área bem ventilada.
- Preparação antes da cirurgia
- Enrole firmemente a fronteira do porto da barra de fixação com aparaffin película para impedir a adesão de resina acrílica aplicada à barra (ver Figura 1B e Figura 2A). Revestir a fronteira da porta coberta pela película de parafina com uma fina camada de resina acrílica.
- Use instrumentos cirúrgicos esterilizados. Completamente desinfectar quadro estereotáxico e seu entorno partir de álcool etílico a 70%.
- Realizar a cirurgia de implantação estereotáxica
- Anestesiar um animal por injecção intraperitoneal de uma mistura de cocktail (2 ml / kg) de cetamina 10 ml (50 mg / ml), cloridrato de xilazina 1,5 ml (23,32 mg / ml), e 2,5 ml de solução salina. Confirme se o animal totalmente anestesiados e não responde a cauda e pitadas de dedo do pé. Injectar mistura cocktail de 1 ml / kg durante a cirurgia, quando necessário.
- Corrigir o animal para o aparelho estereotáxico. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura durante a cirurgia. Raspar e limpar o couro cabeludo com etanol 70%. Dê a injecção subcutânea de lidocaína a 2% e incisão no scalp ao longo da linha média do crânio. Completamente raspar periósteo. Enxaguar várias vezes com solução salina.
- Faça perfuração burr-hole perto da borda do crânio. Parafusos de implante 4-5 voltas (até 1 mm) de profundidade da superfície do crânio para evitar uma violação da dura-máter. Certifique-se de nenhum vazamento de líquor e sangue na superfície do crânio após a implantação parafuso. Enxágüe com solução salina e secar a superfície do crânio usando ar-puff, especialmente em torno dos parafusos.
- Revestimento de superfície do crânio com uma fina camada de "cola dentária (Super-Bond C & B)". Não cobrir inteiramente a superfície do crânio, incluindo o bregma se implante de eletrodos adicional está programado. Use a bregma para a marcação de coordenadas craniotomia. Eletrodos e / ou microdrive implantes e corrigi-lo no crânio através da aplicação de resina acrílica em torno dele.
- Aplicar resina acrílica adicional no topo do cimento dental. Use quantidade adequada de resina acrílica de deixar espaço fill-out suficiente entre revestido por uma barra de resinaresina montagem inicial d quando fixando os parafusos e / ou eléctrodos (Figura 2A).
- Coloque bar cabeça-fixação 5 mm ou mais acima da superfície do crânio e alinhe seu centro (Figura 2A -Left).
- Aplicar resina acrílica na folga entre a base do crânio e resinas iniciais de montagem. (Figura 2A -Center). Aguarde até que a resina se tornar difícil.
- Remover ear-bar e puxe o montador moldado para fora da porta de bar fixação. (Figura 2A -Direita). Cuidadosamente aplicar resina acrílica adicional em torno dos trilhos da borda do montador moldado, se necessário.
- Enxaguar a superfície da ferida do couro cabeludo com solução salina estéril. Injectar um antibiótico (enrofloxacina, 5 mg / kg sc) e um (tartarato de butorfanol, 2 mg / kg sc) analgésico imediatamente após a cirurgia. Abrigar o animal individualmente em uma única gaiola.
3. Animais habituar-a-Frente-a fixação
Nota: Esta etapa deescribas horários de habituação com base em avaliações empiricamente bem-sucedidas dos autores. Para uma visão geral do processo de habituação para a cabeça-fixação, ver o trabalho de 11 de 10 Schwartz ou Guo.
- Dê período de recuperação suficiente (uma semana ou mais) para os animais. No dia 1, o manuseio de animais com freqüência em curtas sessões divididas.
- No dia seguinte (Dia 2), exponha o animal ao ambiente de fixação (caixa). Não insira o seu montador cabeça na porta do bar fixação. Deixe os animais para se acostumar com o ambiente. Firmemente agarrar o montador cabeça usando a mão para 1 a 2 segundos e solte-o imediatamente. Repita fixação curto prazo com a mão-de agarrar várias vezes.
- No Dia 3, os animais se habituam a cabeça-fixação.
- Trazer animais das gaiolas e liquidá-los na caixa de direção se dirige para o porto da barra de fixação. Pegue o montador cabeça e insira-o na porta do bar fixação.
- Vincular o montador (animal decabeça) para o gancho de travamento da barra de fixação com uma faixa de borracha. Suporte para 5 min.
NOTA: Não toque no tronco ou na cauda do animal após a fixação, o que leva o animal a ranger e luta aumentando o estresse do animal. Quando o animal continua lutando mais de 1 min, liberá-lo e tente mais tarde. A partir desta etapa, os animais mostram excreção de urina e fezes sempre que expostos a cabeça de fixação, mas isso gradualmente fica reduzida como habituação rendimentos. - Recuperar o elástico de bloqueio e ejetar o dispositivo de montagem para fora da porta. Coloque os animais de volta para a jaula de casa e prestar um pedaço de cereal ou uma semente de girassol na gaiola como uma recompensa. O próximo julgamento começa em 30 min. Repita 3.4.1 a 3.4.4 cinco ou mais dentro de um dia.
- No dia 4 a 7, expor o animal a cabeça de fixação tal como descrito no protocolo 3.4. Aumentar gradualmente a duração de fixação de cabeça (10 min, 20 min, 30 min e 50 min a habituação rendimentos).
NOTA: Se os animais não fazemt alimentar a recompensa do alimento, ele pode ser um sinal de um nível elevado de stress. Não aumente o tempo de fixação. Se os animais mostram repetido lutando comportamento, habituá-los por um período mais longo. - Verifique o peso corporal do animal por dia. Considere habituação sem êxito quando o peso corporal está diminuindo. Continuar em tarefas comportamentais com fixação de cabeça depois de habituação bem sucedido.
NOTA: Sucesso habituação facilita o treinamento comportamental subsequente (Figura 3E e F).
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Representative Results
Este método de fixação de cabeça é aplicável aos ratos e camundongos. Total de oito ratos receberam implante bilateral de eletrodos de estimulação no feixe do cérebro anterior medial. Para quatro deles, personalizados eletrodos de fio de tungstênio (Microdrives) foram adicionalmente implantado em área forelimb o M1 (Figura 2C). Para ratinhos (n = 2), quatro eléctrodos de arame de aço inoxidável foram implantadas em áreas corticais frontais / occipitais. Durante a cirurgia, montadores de cabeça foi moldada para fixação de cabeça em ambos os ratos e camundongos, como descrever em Protocolo seção 2. Após a recuperação da cirurgia, eles foram expostos a sessões diárias de fixação de cabeça para qualquer habituação ou tarefa comportamental. Os montadores de cabeça moldadas ficou até o final do experimento (40,5 ± 1,73 (média ± DP) dias para os ratos e 81 ± 5,66 (média ± DP) dias para ratos após a cirurgia). Os ratos foram expostos diariamente 40 a 60 min de fixação de cabeça durante a tarefa de comportamento; camundongos foram expostos diariamente 20 a 40 min de serhavior tarefa.
Anteriormente, usou esta técnica para treinar ratos empurrar e puxar uma alavanca sob fixação de cabeça. A recompensa foi a estimulação elétrica direta do feixe do cérebro anterior medial. Embora provoca comportamento locomotor exagerada, fixação de cabeça foi firmemente mantida sem separação acidental montador.
Depois de habituação, encaixe o montador cabeça na porta do bar fixação foi concluído em poucos segundos, bloqueando a faixa de borracha do gancho. Quando introduzido pela primeira vez para a fixação de cabeça, animais apresenta lutando comportamentos tais como correr no mesmo lugar, endireitar as pernas (Figura 3A e B). No entanto, tais comportamentos diminuída com a habituação. Habituação sucesso pode ser confirmado que os animais não apresentam comportamento mais lutando enquanto cabeça fixa (Figura 3C e D).
> Figura 1. Projeto da barra de cabeça-fixação.
(A) Os nomes dos componentes da barra de fixação de cabeça. a) do porto; b) gancho de travamento; c) fixação corpo bar; d) furos de ancoragem; e) apoiar parede; f) placa de ancoragem. Estrutura da caixa da fixação está representada na inserção. Dois orifícios de parede lateral são utilizados para posicionar a barra de fixação ergonomicamente. (B) Opinião de perspectiva do bar projetado fixação de cabeça para os ratos. Setas pretas indicam o limite de cobertura películas de parafina. (C) A concepção da porta para a fixação de cabeça em ratos. (Modificado de Figura 1 de Roh et al. 9) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Construção de moldagem montador durante a cirurgia.
(A) Critic al etapas moldar o montador cabeça. (À esquerda) Parafusos (formas T em preto) deve ser implantado perpendicular ao crânio superfície (cinza). Uma camada fina de cimento de resina adesiva dentária (verde) cobre parafusos e a superfície do crânio. (Centro) Após a implantação dependendo fins experimentais, resinas acrílicas complementares (laranja) são preenchidos a lacuna entre a resina inicial revestidos de resinas portos e bases de superfície do crânio e se torna uma parte do montador cabeça. (Direito) Depois de resinas acrílicas adicionados são set duro, o montador cabeça pode ser liberada por deslizar para fora da porta. Linhas pretas sólidas indicam filmes de parafina. (Modificado a partir da Figura 1 de Roh et ai. 9) (B) construída montador cabeça em ratos está pronto para a libertação (após a etapa de A-Center). (CD) moldado resinas acrílicas que servem como um montador cabeça. Após a cirurgia, ainda sob anestesia, os animais são liberados a partir da barra de fixação. Setas pretas indicam carris de guia correspondentes à forma da porta. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ratos e camundongos Figura 3. Head-fixo.
(AB) Quando os animais são inicialmente expostos a cabeça de fixação, eles emitem lutando comportamento. (CD) Como habituação prossegue, animais mostram comportamento menos lutando e geralmente se sentar no chão da plataforma estacionária. (EF) Resultado do desempenho das tarefas comportamentais de sucesso (E) e sucesso (F) habituação do ambiente fixação de cabeça (Modificado de Figura 3 de Roh et al. 9). Recompensa número abrange tanto livre (para fins de modelagem) e contingente de puxar a alavanca. Em ambas as sessões, insuficientemente rato habituados mostra um desempenho ruim com apenas recompensado pela alavanca puxa acidental de comportamento não-contingente.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
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