Introduction
Kafa tespit veya kafa kısıtlama sert sıkma için kafatası üzerinde bir çerçeve ya da plaka takarak hayvanın başını hareketsizleştirir bir tekniktir. Teknik, hassas duyusal stimülasyon, ya da uyanık hayvanlarda 1-3 nöral kayıt olmadan ve uyku-uyanıklık döngüsü 4 sırasında juxtacellular etiketleme için davranışsal algılama için kabul edilmiştir. Aynı zamanda, in vivo beyin görüntüleme 5,6 kullanılır. Şimdi kafa sabitleme tekniği nörobilim ve davranışsal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir araçtır.
Temelde, geleneksel kafa sabitleme kafatası 6-8 üstündeki metal baş mesajların cerrahi eki gerektirir. Ek parça daha sonra baş immobilizasyonu ile sonuçlanan sabit bir platforma kenetlenir. Böyle nöral ve / veya optik kayıt, beyin devreleri müdahale olarak uyanık hayvanlarda nörofizyolojik araştırma, beyin görüntüleme diş akrilik kullanarak implantasyon cerrahisi eşlik ediyor. Bu nedenle,o deneysel gerektiğinde bu laboratuvarlarda kafa tespiti uygulamak için basit bir görev gibi görünüyor. Çerçeve evlerinde kafeslerde hayvanın doğal davranışlarını rahatsız değil, hafif ve yeterince küçük olması dizayn edilmelidir. Sabit platforma kenetlenmiş zaman da mekanik sertlik sağlar. Ayrıca deneysel amaçlarla bağlı biyouyumluluk vardır. Bu nedenle, tasarım ve genel laboratuar ekipmanları gibi baş mesajları imal etmek teknik olarak zordur.
Bu çalışmada, yeni bir baş tespit yöntemi, metal kafa Mesajları kullanmadan uygun sıkıştırma yoluyla mekanik sertlik sağlarken, tarif edilmektedir. Yöntemi kullanarak, kafa sabitleme implantasyonu genellikle beyin çalışma için kemirgenlerde gerçekleştirilen genel laboratuar koşulları altında yapılabilir. Metal baş mesajlar implan sırasında yapılan bir ısmarlama kafa sabitleme çubuğu ve kalıplama işlemi kısmen kalıplı akrilik reçine çimento ile değiştirilirtation cerrahisi. Sabitleme çubuğu gibi nöral kayıt sondaları, stimülasyon elektrotları gibi diğer implantlar, yüksek uzaysal uyumluluk sağlar. Ayrıca vidalı bağlama kaldırarak sabitleme platformunda hayvanın kafasını sıkma adımlarını kolaylaştırır. Biz önceki davranışsal çalışmada bu yöntem kullanılır ve bu yöntem pratik deneyler 9 uygulamak kolay ve rahat olduğu sonucuna varıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı:
Bu deney Kyungpook Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylandı ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları (Ulusal Sağlık Enstitüsü, 1996) Kılavuzu göre yapıldı. Deneyden sonra, karbon dioksit ötenazi altında kurban edilmiştir.
Sıçanlar için başlıklar tespit Bar 1. Tasarım
NOT: Bu adım, bir tespit çubuğu tasarımı için genel bir kılavuzdur. Boyut ve malzeme ile ilgili herhangi bir değişiklik hayvanlar veya implantlar bağlı mümkündür. CAD yazılımı kullanarak bir kafa sabitleme çubuğunu Tasarımı önerilir, ancak gerekli değildir.
- Bir tespit çubuğu tasarlamak için CAD yazılımı kullanın.
- Bir dikdörtgen şeklinde (123 × 35 × 6 mm) (Şekil 1A) bir tespit çubuğu tasarlayın. Tespit çubuğunun ortasında, dikdörtgen bir çentik (port 16 × 20 mm) emin olun. Yamaçlarında ya da girintileri ekle yüklenebileceğinih (Şekil 1B -arrows Şekil 1A-) liman sınırları üzerinde kılavuz rayı olarak hizmet vermektedir.
NOT: limanın alan kraniotomi yoluyla beyin bölgelerinin çoğunda bir stereotaksik manipülatör kullanarak dikey erişimlerini sağlamak için beynin üzerine sıçan kafatası tahmini dikdörtgen kapsar emin olun. - Sabitleme çubuğunun her iki tarafta iki uzatılmış sabitleme delikleri (50 x 20 x 6 mm) plakaları takın. Bu delikler 6 mm çaplı (Şekil 1A-d) vidalarını geçmesi emin olun. Bir kilitleme kancası (Şekil 1A-B) bağlantı noktasının önünde çapı 3 mm bir delik açın.
- Bir kutu bir zemin (135 x 305 mm) ve yan duvarları (305 x 76 mm) sahip olun. Şekil 1A (ek) 'de gösterildiği gibi, iki 6 mm çaplı delik delin. Sabitleme bar (Şekil 1A-e) destek duvarları ekleyin.
- Bir dikdörtgen şeklinde (123 × 35 × 6 mm) (Şekil 1A) bir tespit çubuğu tasarlayın. Tespit çubuğunun ortasında, dikdörtgen bir çentik (port 16 × 20 mm) emin olun. Yamaçlarında ya da girintileri ekle yüklenebileceğinih (Şekil 1B -arrows Şekil 1A-) liman sınırları üzerinde kılavuz rayı olarak hizmet vermektedir.
- Tasarlanmış bir bar imalatı ve kutu gibi siyanoakrilat kullanılarak her biri bir arayaŞekil 1A (ek) gösterilmiştir. 6 mm çapında vidalar kullanılarak kutusunu çubuğu birleştirin. Ergonomik kafa sabitleme (Şekil 1A-ek) için çubuğun vidalı pozisyonunu ayarlayarak eğimi uygulayın.
NOT: Fare için, sabitleme çubuğunun boyutu (2 mm kalınlığında akrilik paneller iki katmandan oluşan), 60 x 20 x 4 mm 'dir. Port 8 mm genişliğinde (üst) ve Şekil 1C 'de gösterildiği gibi 9 x 10 mm (alt) kare olduğunu. Ankraj plakaları fareler 'aynı boyuttadır. Kutu plaka ve yan duvarlar sırasıyla 100 × 72 mm ve 100 × 50 mm, vardır.
İmplantasyon Cerrahisi sırasında 2. Başkanı Mounter İnşaat
DİKKAT: Diş akrilik reçine ile uğraşırken dikkatli olun. Sıvı cilt tahrişine neden olabilir. Bir maske koyun ve eldiven giyin. Iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
- Ameliyattan önce hazırlık
- Sıkıca tespit çubuğu kullanarak ap limanı sınır sarınbara uygulanan akrilik reçine yapışmasını önlemek için araffin film (Şekil 1B ve Şekil 2A 'ya bakınız). Kat akrilik reçine ince bir tabaka ile parafin film kaplı portun yatılı.
- Sterilize cerrahi aletler kullanın. İyice stereotaksik çerçeve dezenfekte ve onun% 70 etil alkol kullanarak çevredeki.
- Stereotaksik implantasyon ameliyatı
- Intraperitonal ketamin 10 ml kokteyl karışımının enjeksiyonu (2 ml / kg) (50 mg / ml), ksilazin hidroklorür 1.5 ml (23.32 mg / ml) ve tuzlu su 2.5 mi, bir hayvan anestezisi. Hayvan tamamen uyuşturulduktan ve kuyruk ve ayak tutam yanıt vermiyor emin olun. Gerektiğinde, ameliyat sırasında, 1 ml / kg bir kokteyl karışımı enjekte edilir.
- Stereotaksik aparat hayvan sabitleyin. Ameliyat sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik merhem sürün. Tıraş ve% 70 etanol ile kafa derisi temizleyin. % 2 lidokain subkutan enjeksiyon vermek ve SCA insizyonKafatasının orta hat boyunca lp. Tamamen periost kazıyın. Tuzlu birkaç kez durulayın.
- Kafatasının kenarına yakın Burr-hole sondaj yapın. İmplant vidaları kafatası yüzeyinden 4-5 tur (1 mm kadar derinlik) dura mater ihlal önlemek için. Vida implantasyon sonrası kafatası yüzeyinde CSF ve kan emin hiçbir sızıntı olun. Tuzlu su ile durulayın ve özellikle vida etrafında, hava puf kullanarak kafatası yüzeyi kurulayın.
- "Dental yapıştırıcı (Süper Bond C & B)" ince bir tabaka ile kaplayın kafatası yüzeyi. Tamamen ek elektrot implantasyonu planlanan eğer bregma dahil kafatasının yüzeyini örtmeyin. Kraniyotomi koordinatları işaretleme için bregma kullanın. İmplant elektrotlar ve / veya Microdrive ve çevresinde akrilik reçine uygulayarak kafatası sabitleyin.
- Diş çimentosu en ek akrilik reçine uygulanır. Bar kaplı reçine arasında yeterli dolgu-out boşluk bırakmak için akrilik reçine uygun miktarda kullanınd İlk montaj reçine vida ve / veya elektrotların (Şekil 2A) sabitleme zaman.
- Baş-sabitleme çubuğunu kafatası yüzeyi üzerinde 5 mm veya daha fazla koyun ve merkezi (Şekil 2A -Sol) hizalayın.
- Kafa tabanı ve ilk montaj reçineler arasındaki boşluğa akrilik reçine uygulayın. (Şekil 2A -Center). Sert olmak reçine kadar bekleyin.
- Kulak-bar çıkarın ve sabitleme çubuğu liman dışında kalıp Mounter çekin. (Şekil 2A -Sağ). Dikkatle kalıplanmış mounter gerektiğinde kenar rayları etrafında ek bir akrilik reçine uygulanır.
- Steril serum fizyolojik ile kafa derisi yara yüzeyini durulayın. Ameliyattan hemen sonra bir antibiyotik (enrofloksasin, 5 mg / kg sc) ve bir analjezik (butorfanol tartrat, 2 mg / kg sc) enjekte edilir. Tek bir kafeste tek hayvan barındıracak.
3. alıştırmak Hayvanlar Baş-tespit etmek
Not: Bu adım DEYazarların ampirik başarılı değerlendirmelere dayalı alışkanlık programları scribes. Baş-sabitleme için alışkanlık prosedürünün genel bir bakış için, Schwartz'ın 10 veya Guo'nun 11 iş görmek.
- Hayvanlara yeterli iyileşme süresini (bir hafta veya daha fazla) verin. Gün 1, sık sık bölünmüş kısa oturumlarında hayvanları taşıyınız.
- Ertesi gün (Gün 2) üzerinde sabitleme ortamı (kutu) hayvan maruz bırakmaktadır. Tespit çubuğunun portuna onların baş Mounter takmayın. Çevreye alışması için hayvanları bırakın. Güvenli 1 ila 2 saniye elinizi kullanarak kafa Mounter kapmak ve hemen bırakın. El-kapmak birkaç kez kısa süreli fiksasyon tekrarlayın.
- Gün 3, baş-tespitin hayvanları alıştırarak.
- Ev kafeslerden hayvanları getirin ve sabitleme çubuğu limanına doğru başlarını yönetmenlik kutuya yerleşmek. Baş Mounter tut ve tespit çubuğunun bağlantı noktasına takın.
- Hayvan en (Mounter Bindbir lastik bant kullanarak tespit çubuğunun kilitleme kancasına baş). 5 dakika bekleyin.
NOT: gıcırtı ve hayvanın strese artan mücadele hayvan açar tespit sonrasında hayvanın gövde veya kuyruk dokunmayın. Hayvan fazla 1 dk mücadele devam ederse, bırakın ve daha sonra tekrar deneyin. Tespit kafa maruz ancak bu yavaş yavaş alışkanlık ilerledikçe azaltılmış olur zaman bu adımı itibaren, hayvanlar idrar ve dışkı atılımı göstermektedir. - Kilitleme lastik bant alın ve liman dışında Mounter çıkarın. Eve kafesine hayvan koyun ve tahıl bir parça veya bir ödül olarak ev kafesin içine bir ayçiçeği tohumu sağlamaktadır. Bir sonraki duruşma 30 dakika başlar. Bir gün içinde 3.4.1 beş 3.4.4 ya da daha fazla tekrarlayın.
- 7 Gün 4, Protokolün 3.4 anlatıldığı gibi tespit kafa hayvan maruz. Yavaş yavaş (10 dk, 20 dk, 30 dk, ve alışkanlık ilerledikçe 50 dakika) baş sabitleme süresini artırır.
NOT: Hayvanlar yaparsanız hiçbirt stres düzeyi yüksek bir işareti olabilir, gıda ödül yem. Fiksasyon süresini artırmak etmeyin. Hayvanlar davranışı mücadele tekrarlanan göstermek ise, daha uzun bir süre onları alıştırmak. - Günlük hayvanın vücut ağırlığını kontrol edin. Vücut ağırlığı azalıyor başarısız alışkanlık düşünün. Başarılı alışkanlık sonra baş sabitleme ile davranışsal görevlere devam edin.
NOT: Başarılı alışkanlık sonraki davranış eğitimi (Şekil 3E ve F) kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu kafa sabitleme yöntemi, farelerde ve sıçanlarda da uygulanabilir. Toplam sekiz sıçan medyal ön beyin demetine uyarıcı elektrot bilateral implante aldı. Bunların dördünde için özelleştirilmiş tungsten tel elektrotlar (Microdrives) ek M1 ön ayakları alanına (Şekil 2C) implante edildi. Fareler (n = 2), dört adet paslanmaz çelik tel elektrot frontal / Oksipital kortikal alanlara implante edildi. Ameliyattan çıktıktan sonra Protokol bölümünde 2. tarif olarak Ameliyat sırasında, baş Montajcıları, sıçan ve farelerde hem de kafa fiksasyonu için kalıplı, onlar alışkanlık ya da davranışsal görev ya baş tespitin günlük oturumları maruz bırakıldı. Kalıplı kafa Montajcıları deney sonuna kadar kaldı (40.5 ± 1.73 (sıçanlar için sd) gün ortalama ± ve ± 5.66 81 (ameliyattan sonra fareler için sd) gün ortalama ±). Sıçanlar davranış görevi sırasında günde 40 baş sabitleme min 60 maruz bırakıldı; fareler olmak 40 dakika günlük 20 maruz bırakıldıhavior görev.
Daha önce biz sıçan itme yetiştirmek ve baş sabitleme altında kolu çekmek için bu tekniği kullanılır. Ödül medial ön beyin demeti doğrudan elektrik stimülasyonu oldu. O abartılı lokomotor davranışını ortaya çıkarır rağmen, kafa sabitleme sıkıca kazara mounter ayrılması olmadan devam edildi.
Alışma sonra tespit çubuğunun portuna baş Mounter docking kanca lastik bant kilitleyerek birkaç saniyede tamamlandı. İlk baş tespitin tanıtıldı zaman, hayvanlar gibi bacaklarını (Şekil 3A ve B) düzeltmek, yerinde çalışan olarak davranışlarını mücadele sunar. Ancak, bu tür davranışlar alışkanlık azaldı. Başarılı alışkanlık kafası (Şekil 3C ve D) sabit iken hayvanların artık mücadeleci davranışı gösterdiği teyit edilebilir.
> Kafa-sabitleme çubuğu Şekil 1. Tasarım.
(A) baş sabitleme çubuğu Bileşen adları. a) bağlantı noktası; b) kanca kilitleme; c) sabitleme çubuğu gövdesi; d) delikleri tespit; e) duvarı desteklemek; f) ankraj plakası. Tespit kutu tasarımı içerlek tasvir edilmiştir. Yan duvarın iki delik ergonomik sabitleme çubuğu konumlandırma için kullanılır. Fareler için tasarlanmış kafa sabitleme çubuğunun (B) Perspektif görünümü. Siyah oklar parafin filmleri kapsayan sınırını gösterir. (C) farelerde kafa sabitleme için liman tasarımı. (Roh ve ark., 9, Şekil 1 Modifiye) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ameliyat sırasında mounter kalıplama 2. yapı, Şekil.
(A) Eleştirmeni al kafa Mounter kalıplama adımlar. (Sol) Vidalar (siyah T şekiller) kafatası (gri) yüzeye dik implante edilmelidir. Diş yapıştırıcı reçine çimento (yeşil) ince bir tabaka vidalarını ve kafatası yüzeyini kaplar. Deneysel amaçlarla bağlı implantasyon sonrası (Merkez), ek akrilik reçineler (turuncu) kafatası yüzeyi liman ve baz reçine kaplı ilk reçine arasındaki boşlukta doldurulmuş ve baş mounter bir parçası haline vardır. Katma akrilik reçineler sert ayarlanır (Sağ) sonra baş mounter liman dışına kaydırarak serbest bırakılabilir. Katı siyah çizgiler parafin filmler gösteriyor. Sıçanlarda (B) inşa kafası mounter (Roh ve ark., 9, Şekil 1 'den modifiye edilmiştir) (A-Center aşamasından sonra) serbest bırakmak için hazır hale gelir. (CD) Kalıplı bir kafa mounter olarak hizmet akrilik reçineler. Ameliyat sonrasında, hala anestezi altında hayvanlara sabitleme çubuğu salınır. Siyah oklar limana şekline uyan kılavuz raylarını göstermektedir. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. sıçan ve fare Head-düzeltildi.
Hayvanlar, başlangıçta tespit baş maruz kaldığında (AB), onlar davranışlarını mücadele yayarlar. Alışkanlık ilerledikçe (CD), hayvanlar daha az mücadeleci davranış gösterir ve genellikle sabit bir platform zemininde otur. Başarılı (E) davranışsal görev performansları (EF) Sonuç ve kafa sabitleme ortamının başarısız (F) alışkanlık (Roh Şekil 3 ve ark., 9 dan Modifiye). Ödül numarası (amaçları şekillendirmek için) ücretsiz ve şarta kol çekme hem de kucaklar. Her iki oturumlarda, yetersiz alışkanlık sıçan sadece kazara kolu olmayan şarta davranış çeker ödüllendirilir ile kötü performans gösterir.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
- Mayrhofer, J. M., et al. Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats. J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).
- Ollerenshaw, D. R., et al. Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway. J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).
- Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats. J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).
- Lutcke, H., et al. Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice. Front Neural Circuits. 4, 9 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Kimura, R., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. A novel method of head fixation for the study of rodent facial function. Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).
- Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice. PLoS ONE. 9, (2014).
- Osborne, J. E., Dudman, J. T. RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PLoS One. 9, e89007 (2014).
