Introduction
Cabeza de fijación o la cabeza de restricción es una técnica de inmovilizar la cabeza del animal uniendo un marco o placa en el cráneo para la sujeción rígida. La técnica se ha adoptado para la estimulación sensorial precisa, detección de comportamiento con o sin grabación neural en animales despiertos 1-3 y para el etiquetado juxtacellular durante el ciclo de sueño-vigilia 4. También se utiliza para in vivo de imágenes cerebrales 5,6. Ahora técnica de fijación de cabeza es una herramienta de uso común en la neurociencia y la investigación del comportamiento.
Básicamente, la fijación de la cabeza tradicional requiere unión quirúrgica de metales cabeza postes en la parte superior del cráneo 6-8. Los archivos adjuntos se sujetan a continuación a una plataforma estacionaria, lo que resulta en la inmovilización de la cabeza. La investigación neurofisiológica animales despiertos en neural tales como y / o grabación óptica, cerebro intervención circuitos, imágenes del cerebro se acompaña de cirugía de implantación con acrílicos dentales. Por lo tanto,parece una tarea sencilla para aplicar la fijación de la cabeza en esos laboratorios cuando es experimentalmente necesario. Los marcos deben ser diseñados para ser ligero y lo suficientemente pequeño como para no perturbar el comportamiento natural de los animales en sus jaulas. También proporciona rigidez mecánica cuando sujeta a la plataforma estacionaria. Tiene más biocompatibilidad dependiendo de los fines experimentales. Por lo tanto, es técnicamente difícil diseñar y fabricar este tipo de cabeza cargos en el equipo general de laboratorio.
En este estudio, un método de fijación de la cabeza novela se describe, proporcionando rigidez mecánica a través de sujeción cómoda y sin emplear dispositivos metálicos cabeceras de mensajes. Al utilizar el método de fijación de cabeza podría hacerse en condiciones de laboratorio en general, donde la cirugía de implantación se realiza generalmente en roedores para el estudio del cerebro. Las cabeceras de postes de metal son reemplazadas con cemento de resina acrílica moldeada parcialmente por una barra de fijación de la cabeza a medida y el proceso de moldeo se realiza durante IMPLANcirugía tación. La barra de fijación proporciona una alta compatibilidad espacial con otros implantes, tales como sondas de grabación neuronales, electrodos de estimulación. También simplifica los pasos de sujeción la cabeza del animal en la plataforma de fijación quitando el tornillo de sujeción. Se utilizó este método en el estudio del comportamiento anterior y llegamos a la conclusión de que este método es fácil de implementar y conveniente en la experimentación práctica 9.
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Protocol
Declaración de Ética:
Este experimento fue aprobado por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad Nacional de Kyungpook, y se realizó de acuerdo a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto Nacional de la Salud, 1996). Después de experimento, los animales fueron sacrificados bajo la eutanasia dióxido de carbono.
1. Diseño de la barra de la Cabeza-fijación para ratas
NOTA: Este paso es una guía general para un diseño de barra de fijación. Cualquier modificación de la dimensión y el material es posible en función de los animales o implantes. El diseño de una barra de cabeza de fijación utilizando software de CAD se recomienda pero no es necesario.
- Utilice software de CAD para diseñar una barra de fijación.
- Diseñar una barra de fijación de una forma rectangular (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1). Hacer una muesca rectangular (16 × 20 mm; puerto) en el medio de la barra de fijación. Añadir pistas o hendiduras which servir como un carril de guía en las fronteras del puerto (Figura 1-A, Figura 1B -arrows).
NOTA: Asegúrese de que el área del puerto cubre el rectángulo prevista de cráneo de rata sobre el cerebro para permitir accesos verticales usando un manipulador estereotáxica para la mayoría de las áreas del cerebro a través de una craneotomía. - Adjuntar placas (50 × 20 × 6 mm) con dos agujeros alargados de anclaje a ambos lados de la barra de fijación. Asegúrese de que estos agujeros pasan tornillos de 6 mm de diámetro (Figura 1-d). Hacer un agujero de 3 mm de diámetro en la parte delantera del puerto para un gancho de bloqueo (Figura 1-b).
- Hacer una caja que tiene un piso (135 × 305 mm) y paredes laterales (305 × 76 mm). Perforar dos agujeros de diámetro 6 mm como se muestra en la figura 1A (recuadro). Añadir muros de soporte de la barra de fijación (Figura 1-e).
- Diseñar una barra de fijación de una forma rectangular (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1). Hacer una muesca rectangular (16 × 20 mm; puerto) en el medio de la barra de fijación. Añadir pistas o hendiduras which servir como un carril de guía en las fronteras del puerto (Figura 1-A, Figura 1B -arrows).
- Fabricación del bar diseñado y caja y ensamblar cada una de ellas utilizando cianoacrilato comose muestra en la Figura 1A (recuadro). Montar la barra en la caja con los tornillos de 6 mm de diámetro. Aplicar pendiente ajustando la posición del tornillo de la barra para la fijación de cabeza ergonómico (Figura 1A-inserción).
NOTA: Para los ratones, la dimensión de la barra de fijación es 60 × 20 × 4 mm (que consta de dos capas de 2 mm de espesor) paneles de acrílico. El puerto es cuadrada de 8 mm de ancho (superior) y 9 x 10 mm (inferior), como se muestra en la Figura 1C. Placas de anclaje son del mismo tamaño de las ratas '. La placa de caja y las paredes laterales son 100 × 72 mm × 50 y 100 mm, respectivamente.
2. Cabeza Mounter construcción durante la cirugía de implantación
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al tratar con resina acrílica dental. El líquido puede causar irritación de la piel. Póngase una máscara y usar guantes. Trabajar en un lugar bien ventilado.
- Preparación antes de la cirugía
- Envuelva bien la frontera del puerto de la barra de fijación utilizando aparaffin película para evitar la adhesión de resina acrílica aplicada a la barra (véase la Figura 1B y la Figura 2A). Escudo de la frontera del puerto cubierta por la película de parafina con una fina capa de resina acrílica.
- Utilice instrumentos quirúrgicos esterilizados. Completamente desinfecte marco estereotáxico y sus alrededores usando 70% de alcohol etílico.
- Realizar cirugía de implantación estereotáxica
- Anestesiar a un animal por inyección intraperitoneal de una mezcla de cóctel (2 ml / kg) de ketamina 10 ml (50 mg / ml), clorhidrato de xilazina 1,5 ml (23,32 mg / ml), y la solución salina de 2,5 ml. Confirme que el animal totalmente anestesiado y no responde a la cola y de los pies pellizcos. Inyectar mezcla de cóctel de 1 ml / kg durante la cirugía cuando sea necesario.
- Fijar el animal al aparato estereotáxico. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad durante la cirugía. Afeitado y limpiar el cuero cabelludo con etanol al 70%. Déle la inyección subcutánea de lidocaína al 2% y la incisión del scalp lo largo de la línea media del cráneo. Completamente raspar periostio. Enjuague con solución salina varias veces.
- Hacer perforación rebabas hoyos cerca del borde del cráneo. Tornillos de implantes 4-5 vueltas (hasta 1 mm de profundidad) de la superficie del cráneo para evitar un incumplimiento de la duramadre. Asegúrese de que no hay fugas de LCR y sangre en la superficie del cráneo después de la implantación del tornillo. Enjuague con solución salina y se seca la superficie del cráneo usando aire soplo, especialmente alrededor de los tornillos.
- Superficie del cráneo Escudo con una capa delgada de "adhesivo dental (Super-Bond C & B)". No cubra por completo la superficie del cráneo, incluidos el bregma si la implantación de electrodos adicionales está programada. Utilice el bregma para el marcado de coordenadas craneotomía. Electrodos y / o Microdrive implantes y fijarlo en el cráneo mediante la aplicación de resina acrílica a su alrededor.
- Aplicar resina acrílica adicional en la parte superior del cemento dental. Utilice la cantidad apropiada de resina acrílica de dejar suficiente espacio relleno de espera entre la barra recubiertos de una resinaresina de montaje inicial d cuando fijando los tornillos y / o electrodos (Figura 2A).
- Coloque la barra de frente fijación 5 mm o más por encima de la superficie del cráneo y alinee su centro (Figura 2A -Izquierda).
- Aplique resina acrílica en el espacio entre la base del cráneo y resinas de montaje iniciales. (Figura 2A -Centro). Espere hasta que la resina se endurecen.
- Retire el oído-bar y tire de la montadora moldeado por el puerto de la barra de fijación. (Figura 2A -Derecho). Aplique cuidadosamente resina acrílica adicional alrededor de los raíles de borde de la montadora moldeado si es necesario.
- Enjuague la superficie de la herida del el cuero cabelludo con solución salina estéril. Inyectar un antibiótico (enrofloxacina, 5 mg / kg sc) y un (tartrato de butorfanol, de 2 mg / kg sc) analgésico inmediatamente después de la cirugía. Casa del animal de forma individual en una sola jaula.
3. habituar Animales de Head-fijación
Nota: Este paso deescribas horarios habituación basadas en evaluaciones empíricamente exitosos autores. Para una visión general de procedimiento de habituación para la cabeza de fijación, ver 11 la obra de 10 Schwartz o de Guo.
- Dar suficiente tiempo de recuperación (una semana o más) a los animales. El día 1, la manija animales con frecuencia en sesiones cortas divididas.
- Al día siguiente (Día 2), exponer el animal para el medio ambiente de fijación (recuadro). No inserte su montador cabeza en el puerto de la barra de fijación. Deja animales para acostumbrarse al medio ambiente. Segura agarrar el montador cabeza con la mano para 1 a 2 seg y liberarlo inmediatamente. Repita la fijación a corto plazo con la mano-agarrar varias veces.
- El día 3, habituar a los animales a la cabeza de fijación.
- Traiga los animales de las jaulas y asentarse en la caja de la dirección se dirige hacia el puerto de la barra de fijación. Coge el montador jefe y la inserta en el puerto de la barra de fijación.
- Enlazar el montador (animal decabeza) al gancho de bloqueo de la barra de fijación utilizando una goma elástica. Soporte para 5 min.
NOTA: No toque el tronco o la cola del animal después de la fijación, lo que lleva al animal a chirriar y luchar aumentar el estrés del animal. Cuando el animal continúa luchando más de 1 min, liberarlo y tratar más tarde. A partir de este paso, los animales muestran excreción de orina y heces siempre expuesto a la cabeza de fijación, pero esto poco a poco se reduce a medida que avanza de habituación. - Recuperar la banda elástica de bloqueo y expulsar el montador del puerto. Ponga los animales de vuelta a la jaula y proporcionar un pedazo de cereal o una semilla de girasol en la jaula como recompensa. La siguiente prueba empieza en 30 min. Repita 3.4.1 a 3.4.4 cinco o más dentro de un día.
- En el Día 4 a 7, exponer el animal a la cabeza de fijación como se describe en el Protocolo 3.4. Poco a poco aumentar la duración de la fijación de la cabeza (10 min, 20 min, 30 min, 50 min y como producto de habituación).
NOTA: Si los animales no hacent alimentar el premio de comida, puede ser un signo de un alto nivel de estrés. No aumente el tiempo de fijación. Si los animales muestran repiten luchando comportamiento, habituar a ellos por un período más largo. - Compruebe el peso corporal de animales diariamente. Considere la habituación sin éxito cuando el peso corporal disminuye. Continúe con las tareas de comportamiento con la fijación de cabeza después de la habituación éxito.
NOTA: El éxito de la habituación facilita la formación del comportamiento posterior (Figura 3E y F).
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Representative Results
Este método de fijación de cabeza es aplicable tanto a ratas y ratones. Totales ocho ratas recibieron implantación bilateral de electrodos de estimulación en el haz medial del cerebro anterior. Para cuatro de ellos, electrodos de alambre de tungsteno personalizados (Microdrive) fueron implantados, además, en el área de la extremidad anterior M1 (Figura 2C). Para los ratones (n = 2), cuatro electrodos de alambre de acero inoxidable se implantaron en áreas corticales frontales / occipitales. Durante la cirugía, montadores de cabeza fueron moldeados para la fijación de la cabeza tanto en ratas y ratones, como se describe en la sección Protocolo 2. Después de la recuperación de la cirugía, fueron expuestos a sesiones diarias de fijación de la cabeza, ya sea para la habituación o tarea conductual. Los montadores de cabeza moldeados se quedaron hasta el final del experimento (40,5 ± 1,73 (media ± DE) días para las ratas y 81 ± 5,66 (media ± DE) días para los ratones después de la cirugía). Las ratas fueron expuestas diariamente de 40 a 60 min de fijación de la cabeza durante la tarea de comportamiento; los ratones fueron expuestos diariamente de 20 a 40 min de estartarea conducta.
Anteriormente hemos utilizado esta técnica para entrenar a ratas empujar y tirar de una palanca bajo la fijación cabeza. La recompensa era la estimulación eléctrica directa del haz medial del cerebro anterior. A pesar de que provoca el comportamiento locomotor exagerada, fijación cabeza estaba firmemente mantuvo sin separación montador accidental.
Después de la habituación, atracar el montador cabeza en el puerto de la barra de fijación se completó en unos cuantos segundos mediante el bloqueo de la goma en el gancho. Cuando se introdujo por primera vez a la fijación de la cabeza, los animales presentes regalos comportamientos luchando como correr en su lugar, enderezar sus piernas (Figura 3 A y B). Sin embargo, tales comportamientos disminuyen con la habituación. Habituación éxito se puede confirmar que los animales no muestran un comportamiento más que lucha, mientras que la cabeza fija (Figura 3C y D).
> Figura 1. Diseño de la barra de frente fijación.
(A) nombres de los componentes de la barra de fijación de la cabeza. a) el puerto; b) gancho de bloqueo; c) cuerpo de la barra de fijación; d) orificios de anclaje; e) el apoyo a la pared; f) la placa de anclaje. Diseño de la caja de fijación se representa en la inserción. Dos agujeros de la pared lateral se utilizan para el posicionamiento ergonómicamente la barra de fijación. (B) Vista en perspectiva de la barra de fijación de cabeza diseñada para las ratas. Las flechas negras indican el límite de la cobertura de las películas de parafina. (C) El diseño del puerto para la fijación de cabeza en ratones. (Modificado de la Figura 1 de Roh et al. 9) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Construcción de moldeo montador durante la cirugía.
(A) El crítico Al etapas de moldeo del montador cabeza. (Izquierda) Tornillos (T formas en negro) deben ser implantados perpendicularmente a la superficie del cráneo (gris). Una fina capa de cemento de resina adhesivo dental (verde) cubre los tornillos y la superficie del cráneo. (Centro) Después de la implantación en función de los propósitos experimentales, resinas acrílicas adicionales (naranja) se llenan en la brecha entre la resina inicial revestido en el puerto y base resinas de la superficie del cráneo y se convierte en una parte del montador cabeza. (Derecha) Después de resinas acrílicas son añadidos conjunto duro, el montador de cabeza puede ser liberado por deslizamiento fuera del puerto. Líneas negras continuas indican películas de parafina. (Modificado de la Figura 1 de Roh et al. 9) (B) construida mounter cabeza en ratas está listo para la liberación (después del paso de A-Center). (CD) Moldeado resinas acrílicas que sirven como montador cabeza. Después de la cirugía, todavía bajo anestesia, los animales se liberan de la bar fijación. Las flechas negras indican carriles de guía que emparejan a la forma del puerto. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Rata y ratón Figura 3. Head-fijo.
(AB) Cuando los animales están expuestos inicialmente a la cabeza de fijación, emiten luchando comportamiento. (CD) Como habituación procede, los animales muestran un comportamiento menos lucha y por lo general se sientan en el suelo de la plataforma fija. (EF) El resultado de las actuaciones de tareas conductuales de éxito (E) y sin éxito (F) habituación del entorno fijación cabeza (modificado a partir de la figura 3 de Roh et al. 9). Número de premios abarca tanto tirón palanca gratuita (para fines de dar forma) y contingente. En ambas sesiones, insuficientemente rata habituado muestra los malos resultados sólo recompensado por la palanca accidental tira de la conducta no contingente.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
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