Introduction
Tête fixation ou de la tête de retenue est une technique d'immobiliser la tête de l'animal par la fixation d'une plaque ou cadre sur le crâne de serrage rigide. La technique a été adopté pour la stimulation sensorielle précise, détection comportementale avec ou sans l'enregistrement de neurones chez les animaux éveillés et 1-3 pour l'étiquetage juxtacellulaire pendant le cycle veille-sommeil 4. Il est également utilisé pour l'imagerie cérébrale in vivo 5,6. Maintenant technique tête de fixation est un outil couramment utilisé dans les neurosciences et la recherche comportementale.
Fondamentalement, la fixation de la tête traditionnelle nécessite la fixation chirurgicale de Metal Head-postes sur le dessus du crâne 6-8. Les pièces jointes sont ensuite serrées à une plate-forme fixe, entraînant l'immobilisation de la tête. La recherche neurophysiologique chez les animaux éveillés tels que neuronal et / ou enregistrement optique, le cerveau intervention de circuits, l'imagerie cérébrale est accompagné par la chirurgie d'implantation en utilisant acryliques dentaires. Donc,il semble une tâche simple à mettre en œuvre la fixation de la tête dans les laboratoires quand il est expérimentalement nécessaire. Les cadres doivent être conçus pour être légers et assez petit pour ne pas déranger le comportement naturel de l'animal dans leurs cages à domicile. Il fournit également la rigidité mécanique lors du serrage de la plate-forme stationnaire. Il a en outre biocompatibilité selon fins expérimentales. Par conséquent, il est techniquement difficile de concevoir et fabriquer ces tête-postes dans les équipements de laboratoire en général.
Dans cette étude, une méthode tête de fixation roman est décrit, offrant une rigidité mécanique par serrage pratique sans utiliser Metal Head-postes. En utilisant la méthode, la tête de fixation pourrait être fait dans les conditions générales de laboratoire, où la chirurgie d'implantation est généralement effectuée chez les rongeurs pour l'étude du cerveau. Les tête-poteaux métalliques sont remplacés par ciment acrylique moulé en résine partiellement par une barre tête fixation faite sur mesure et le processus de moulage est fait pendant IMPLANchirurgie de mise. La barre de fixation offre une grande compatibilité spatiale avec d'autres implants, comme les sondes d'enregistrement de neurones, des électrodes de stimulation. En outre, il simplifie les étapes consistant à serrer la tête de l'animal sur la plate-forme de fixation en enlevant vissage. Nous avons utilisé cette méthode dans l'étude comportementale précédente et nous avons conclu que cette méthode est facile à mettre en œuvre et pratique dans l'expérimentation pratique 9.
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Protocol
Déclaration d'éthique:
Cette expérience a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Kyungpook National University, et a été réalisé conformément aux guides pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institut national de la Santé, 1996). Après l'expérience, les animaux ont été sacrifiés sous dioxyde de carbone de l'euthanasie.
1. Conception du Barreau du chef-fixation pour rats
Remarque: Cette étape est un guide général pour une conception de barre de fixation. Toute modification de la dimension et de matériel est possible en fonction des animaux ou des implants. Concevoir un bar-tête de fixation à l'aide de logiciels de CAO est recommandé, mais pas nécessaire.
- Utilisez un logiciel de CAO pour concevoir une barre de fixation.
- Concevoir une barre de fixation de forme rectangulaire (123 x 35 x 6 mm) (figure 1A). Faire une entaille rectangulaire (16 x 20 mm; le port) dans le milieu de la barre de fixation. Ajouter des pentes ou des indentations which servir comme un rail de guidage sur les frontières du port (figure 1A-un, figure 1B -arrows).
REMARQUE: Assurez-vous que la zone du port couvre le rectangle approximative du crâne de rat sur le cerveau pour permettre des accès verticaux en utilisant un manipulateur stéréotaxique à la plupart des zones du cerveau à travers une craniotomie. - Attacher des plaques (50 x 20 x 6 mm) avec deux trous d'ancrage allongées des deux côtés de la barre de fixation. Assurez-vous que ces trous passent vis de 6 mm de diamètre (figure 1A-d). Faire un trou d'un diamètre de 3 mm en face du port pour un crochet de verrouillage (figure 1A-b).
- Faire une boîte ayant un plancher (135 × 305 mm) et des parois latérales (305 × 76 mm). Percer deux trous 6 mm de diamètre comme illustré sur la figure 1A (encadré). Ajouter murs de soutènement sur la barre de fixation (figure 1A-e).
- Concevoir une barre de fixation de forme rectangulaire (123 x 35 x 6 mm) (figure 1A). Faire une entaille rectangulaire (16 x 20 mm; le port) dans le milieu de la barre de fixation. Ajouter des pentes ou des indentations which servir comme un rail de guidage sur les frontières du port (figure 1A-un, figure 1B -arrows).
- Fabrication de la barre conçu et boîte et assembler chacun d'entre eux utilisant cyanoacrylateillustré à la figure 1A (en médaillon). Assemblez la barre sur la boîte à l'aide de vis de 6 mm de diamètre. Appliquer la pente en ajustant la position de la vis de la barre de fixation ergonomique de la tête (figure 1A-encadré).
NOTE: Pour les souris, la dimension de la barre de fixation est de 60 × 20 × 4 mm (constitué de deux couches de 2 mm panneaux acryliques épais). Le port est carré de 8 mm de largeur (supérieur) et 9 x 10 mm (en bas), comme illustré à la figure 1C. Plaques d'ancrage ont la même taille de rats. Les parois de la plaque de boîte et secondaires sont de 100 x 72 mm et 100 x 50 mm, respectivement.
2. Chef Mounter construction pendant une chirurgie d'implantation
ATTENTION: Soyez prudent lorsque vous traiter avec de la résine acrylique dentaire. Le liquide peut provoquer une irritation de la peau. Mettez un masque et des gants. Travailler dans un endroit bien ventilé.
- Préparation avant la chirurgie
- Envelopper la frontière du port de la barre de fixation à l'aide APle film araffin pour empêcher l'adhérence de la résine acrylique appliquée à la barre (voir Figure 1B et figure 2A). Manteau de la frontière du port recouverte par le film de paraffine avec une fine couche de résine acrylique.
- Utilisez instruments chirurgicaux stérilisés. Désinfectez soigneusement cadre stéréotaxique et ses environs avec de l'alcool éthylique à 70%.
- Effectuer la chirurgie d'implantation stéréotaxique
- Anesthésier un animal par injection intraperitoneale d'un mélange de cocktail (2 ml / kg) 10 ml de kétamine (50 mg / ml), le chlorhydrate de xylazine (1,5 ml 23,32 mg / ml) et 2,5 ml de solution saline. Assurez-vous que l'animal totalement anesthésié et ne répond pas à la queue et des orteils pincées. Injecter mélange cocktail de 1 ml / kg pendant la chirurgie si nécessaire.
- Fixer l'animal à l'appareil de stéréotaxie. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant la chirurgie. Rasage et nettoyer le cuir chevelu avec 70% d'éthanol. Donnez injection sous-cutanée de 2% de lidocaïne et inciser le scale long de la ligne médiane lp du crâne. Complètement gratter le périoste. Rincez avec une solution saline à plusieurs reprises.
- Assurez forage bavure trou près de la jante du crâne. Vis d'implant 4-5 tours (jusqu'à 1 mm de profondeur) de la surface du crâne pour éviter une rupture de la dure-mère. Assurez-vous pas de fuite de LCR et le sang sur la surface du crâne après avoir vis implantation. Rincez avec une solution saline et sécher la surface du crâne à l'aide d'air bouffée, en particulier autour des vis.
- Manteau surface du crâne avec une fine couche de "adhésif dentaire (Super-Bond C & B)". Ne pas couvrir entièrement la surface du crâne, y compris l'bregma électrode supplémentaire si l'implantation est prévue. Utilisez le bregma pour le marquage coordonnées craniotomie. Électrodes et / ou microdrive implant et le fixer sur le crâne par application de résine acrylique autour d'elle.
- Appliquer la résine acrylique supplémentaire sur le dessus du ciment dentaire. Utilisez la quantité appropriée de résine acrylique à laisser un espace de remplissage de départ suffisant entre bar revêtu d'une résined résine de montage initial lorsque les vis fixateur et / ou des électrodes (Figure 2A).
- Place Bar-tête de fixation de 5 mm ou plus au-dessus de la surface du crâne et d'aligner son centre (figure 2A -Gauche).
- Appliquer la résine acrylique dans l'écart entre la base du crâne et résines montage initial. (Figure 2A -Center). Attendez jusqu'à ce que la résine devenir dur.
- Retirer oreille-bar et tirez le monteur moulé sur le port de barre de fixation. (Figure 2A -Droit). Appliquer une résine acrylique avec précaution supplémentaire autour des rails de bord du dispositif de montage moulé si nécessaire.
- Rincer la surface de la plaie du cuir chevelu avec une solution saline stérile. Injecter un antibiotique (enrofloxacine, 5 mg / kg sc) et un (le tartrate de butorphanol, 2 mg / kg sc) immédiatement après la chirurgie analgésique. Maison de l'animal individuellement dans une seule cage.
3. habituer les animaux au chef-fixation
Remarque: Cette étape describes horaires d'habituation empiriquement fondées sur des évaluations réussies des auteurs. Pour un aperçu de la procédure d'accoutumance pour la tête-fixation, voir le travail de 11 de 10 Schwartz ou Guo.
- Donnez période de récupération suffisante (une semaine ou plus) pour les animaux. Le Jour 1, manipuler les animaux fréquemment sur de courtes sessions divisées.
- Le lendemain (Jour 2), d'exposer l'animal à l'environnement de fixation (boîte). Ne pas insérer leur monteur de la tête dans le port de la barre de fixation. Laissez les animaux pour vous habituer à l'environnement. Solidement saisir le monteur de la tête en utilisant la main pour de 1 à 2 secondes et le relâcher immédiatement. Répétez à court terme par la fixation de la main-appui à plusieurs reprises.
- Le Jour 3, habituer les animaux à la tête de fixation.
- Apportez les animaux des cages à domicile et de les régler dans la boîte de diriger la tête vers le port de la barre de fixation. Prenez le monteur de la tête et l'insérer dans le port de la barre de fixation.
- Liez le monteur (animal detête) au crochet de verrouillage de la barre de fixation à l'aide d'une bande de caoutchouc. Support pour 5 min.
REMARQUE: Ne touchez pas le tronc ou de la queue de l'animal après la fixation, ce qui conduit l'animal à grincer et de la lutte de plus en plus le stress de l'animal. Lorsque l'animal continue luttant plus de 1 min, libérer et essayer plus tard. De cette étape, les animaux montrent urine et les fèces excrétion chaque fois exposée à la tête de fixation, mais cela devient progressivement réduite habituation produit. - Récupérer la bande de caoutchouc de verrouillage et éjecter le monteur sur le port. Mettez les animaux dos à la cage de la maison et de fournir un morceau de céréales ou une graine de tournesol dans la cage de la maison comme une récompense. Le prochain procès commence dans 30 minutes. Répétez 3.4.1 à 3.4.4 cinq ou plus en une journée.
- Le Jour 4 à 7, exposer l'animal à la tête de fixation comme décrit dans le protocole 3.4. Augmenter progressivement la durée de la tête de fixation (10 min, 20 min, 30 min et 50 min en habituation produit).
NOTE: Si les animaux ne fontt charge la récompense alimentaire, il peut être un signe d'un niveau élevé de stress. Ne pas augmenter le temps de fixation. Si les animaux révèlent des manquements répétés aux prises comportement, habituer eux pour une période plus longue. - Vérifiez le poids du corps de l'animal par jour. Considérez accoutumance échoue lorsque le poids corporel diminue. Procéder à des tâches comportementales avec la tête de fixation après accoutumance succès.
REMARQUE: Succès accoutumance facilite la formation comportementale ultérieure (Figure 3E et F).
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Representative Results
Cette méthode tête de fixation est applicable à la fois aux rats et les souris. Nombre de huit rats ont reçu une implantation bilatérale des électrodes de stimulation dans le faisceau médial du télencéphale. Pour quatre d'entre eux, des électrodes de mesure de tungstène (fils de Microdrives) ont été implantées en outre dans la zone de la patte avant M1 (figure 2C). Pour les souris (n = 2), quatre électrodes en fil d'acier inoxydable ont été implantés dans les zones corticales frontales / occipitaux. Pendant la chirurgie, monteurs de tête ont été moulés pour la fixation de la tête dans les deux rats et les souris, comme décrit dans la section Protocole 2. Après récupération de la chirurgie, ils ont été exposés à des séances quotidiennes de la tête pour la fixation soit accoutumance ou une tâche comportementale. Les monteurs de tête moulés sont restés jusqu'à la fin de l'expérience (40,5 ± 1,73 (moyenne ± écart type) jours pour les rats et 81 ± 5,66 (moyenne ± écart type) jours pour les souris après la chirurgie). Les rats ont été exposés quotidiennement 40 à 60 min tête de fixation pendant la tâche de comportement; les souris ont été exposés quotidiennement 20 à 40 min de l'êtretâche portement.
Auparavant, nous avons utilisé cette technique pour former des rats pousser et tirer un levier sous la tête de fixation. La récompense a été la stimulation électrique directe du faisceau médial du télencéphale. Bien qu'il suscite comportement locomoteur exagérée, tête fixation a été maintenu fermement sans séparation de monteur accidentelle.
Après l'accoutumance, l'amarrage le monteur de la tête dans le port de la barre de fixation a été achevée en quelques secondes par verrouillage bande de caoutchouc à l'hameçon. Lorsque la première fois à la fixation de la tête, les animaux présente luttant comportements tels que courir sur place, à redresser leurs jambes (figure 3A et B). Cependant, de tels comportements diminués avec l'accoutumance. Accoutumance réussie peut être confirmé que les animaux ne présentent pas de comportement plus résister pendant que la tête fixé (figure 3C et D).
Figure 1. Conception de la barre de tête de fixation.
(A) des noms des composants de la barre tête de fixation. un port; b) crochet de verrouillage; c) corps de barre de fixation; d) des trous d'ancrage; e) la paroi de support; f) Une plaque d'ancrage. Conception de la zone de fixation est représentée dans l'encart. Deux trous de la paroi latérale sont utilisées pour le positionnement ergonomique de la barre de fixation. (B) Vue perspective conçu barre de fixation de la tête pour les rats. Les flèches noires indiquent la limite de films de revêtement de paraffine. (C) la conception de l'orifice de fixation de la tête chez les souris. (Modifié à partir de la figure 1 de Roh et al. 9) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Construction de monteur moulage pendant la chirurgie.
(A) Critique al steps moulage le monteur de la tête. (À gauche) Vis (formes T en noir) devraient être implantés perpendiculairement à la surface du crâne (gris). Une mince couche de ciment dentaire à base de résine adhésive (vert) recouvre les vis et la surface du crâne. (Au centre) après l'implantation en fonction des fins expérimentales, résines acryliques additionnels (orange) sont remplis de l'écart entre la résine initiale enduite sur les résines de port et la base de la surface du crâne et devient une partie de la monteuse de la tête. (À droite) Après résines acryliques sont ajoutés ensemble dur, le monteur de la tête peut être libéré par glisser hors du port. Lignes noires indiquent films paraffine. (Modifié à partir de la figure 1 de Roh et al. 9) (B) Construit tête monteur chez le rat est prêt à libérer (après l'étape de A-Center). (DR) moulé de résines acryliques servant de monteur de tête. Après la chirurgie, l'anesthésie encore sous, les animaux sont libérés de la barre de fixation. Les flèches noires indiquent rails de guidage correspondant à la forme du port. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Rat et la souris Figure 3. Tête-fixe.
(AB) Lorsque les animaux sont d'abord exposés à la tête de fixation, ils émettent un comportement mal. (CD) Comme habituation produit, les animaux montrent un comportement moins en difficulté et souvent asseoir sur le plancher de la plate-forme fixe. (EF) Résultat des performances de tâches comportementales de succès (E) et échec (F) habituation de l'environnement tête de fixation (modification de la figure 3 de Roh et al. 9). Numéro de récompense englobe à la fois levier libre (à des fins de mise en forme) et contingente traction. Dans les deux sessions, insuffisamment rat habitué montre mauvaise performance avec seulement récompensé par le levier tire accidentelle d'un comportement non contingent.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic resin | Lang Dental Manufacturing | Ortho-Jet | to make molded mounter |
| Paraffin film | Bemis | Parafilm | to prevent adhesion of acrylic resin to the bar |
| Dental adhesive | Sun Medical | Super-Bond C&B | to bond between acrylic resin and skull |
| Plexglass or other acrylic plate | to make fixation bar and box platform | ||
| Cyanoacrylate | to bond acrylic plates |
References
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