Acrylharz-Form Based Leiter Fixationstechnik in Nagetiere

Introduction

Kopffixierung oder Kopfrückhalte ist eine Technik zur Immobilisierung Kopf des Tieres durch das Anbringen eines Rahmens oder einer Platte auf dem Schädel für starre Klemm. Die Technik wurde für die präzise sensorische Stimulation, Verhaltenserkundung mit oder ohne neuronale Aufnahme in wachen Tieren ^{1-3 und} für juxtacellular Kennzeichnung während der ^{Schlaf-Wach-Zyklus} 4 übernommen. Es ist auch für in vivo bildgebenden ^5,6 eingesetzt. Jetzt Kopf Fixationstechnik ist ein häufig verwendetes Werkzeug in den Neurowissenschaften und Verhaltensforschung.

Grundsätzlich traditionellen Kopffixierung erfordert chirurgische Befestigung der Metall-Kopf-Beiträge auf der Oberseite des Schädels ^6-8. Die Anlagen werden dann auf einer stationären Plattform eingeklemmt, was zu einer Immobilisierung des Kopfes. Neurophysiologische Forschung im wachen Tieren wie neuronale und / oder optischen Aufzeichnungs, Gehirn-Schaltung Intervention wird Bildgebung des Gehirns durch die Implantationschirurgie Dentalacryl begleitet. Deshalb,es scheint eine einfache Aufgabe, um den Kopf Fixierung in diesen Laboratorien durchzuführen, wenn es notwendig ist, experimentell. Die Rahmen sollten so gestaltet sein, um leicht und klein genug sein, nicht auf natürliche Verhalten Tieres in ihre Käfige zu stören. Es bietet auch mechanische Festigkeit, wenn sie der stationären Plattform eingeklemmt ist. Es hat weitere Biokompatibilität je nach Versuchszwecken. Daher ist es technisch schwierig zu entwerfen und fabrizieren wie Kopf-Beiträge in allgemeinen Laborgeräten.

In dieser Studie wird ein neuartiges Kopffixierungsmethode beschrieben, die mechanische Festigkeit durch praktische Klemm ohne Verwendung von Metall-Kopf-Beiträge. Durch Verwendung des Verfahrens, konnte Kopffixierung unter allgemeinen Laborbedingungen, wo Implantationschirurgie ist in der Regel bei Nagetieren für Gehirn-Studie durchgeführt, durchgeführt werden. Die Metall-Kopf-Beiträge sind mit Acrylharz-Zement teilweise durch eine maßgeschneiderte Kopffixierung Bar und dem Formverfahren geformt ersetzt wird während Senioren getantation der Operation. Die Fixierung Bar bietet hohe räumliche Kompatibilität mit anderen Implantaten, wie neuronale Aufnahme Sonden, Stimulationselektroden. Auch es erleichtert die Schritte der Spannkopf des Tieres auf der Fixierung Plattform, indem Verschrauben. Wir verwendeten diese Methode in der vorherigen Verhaltensstudie und wir festgestellt, dass dieses Verfahren einfach zu implementieren ist und bequem in praktischen Versuchen ^9.

Protocol

Ethics Statement:
Dieser Versuch wurde von der National University Kyungpook Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und wurde nach den für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institute of Health, 1996) Führer durchgeführt. Nach dem Experiment wurden die Tiere unter Kohlendioxid Euthanasie getötet.

1. Design der Kopffixierung Bar für Ratten

Hinweis: Dieser Schritt ist eine allgemeine Richtlinie für eine Fixierung Bar-Design. Jede Änderung über die Dimension und Material ist möglich, je nach Tieren oder Implantate. Entwerfen einer Kopf-Fixierungs bar mit CAD-Software ist empfehlenswert, aber nicht notwendig.

1. CAD-Software verwenden, um eine Fixierung bar zu gestalten.
   1. Entwerfen Sie eine Fixation bar eine rechteckige Form (123 x 35 x 6 mm) (Abbildung 1A). Einen rechteckigen Ausschnitt (16 × 20 mm; port) in der Mitte der Befestigungsleiste. In Pisten oder Vertiefungen which als Führungsschiene auf den Rändern der Öffnung (1A-a, -Pfeile 1B) dienen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Bereich des Hafens erstreckt sich der geschätzte Rechteck des Schädels rat über das Gehirn, um vertikale Zugriffe ermöglichen mit einem stereotaktischen Manipulators zu den meisten Bereichen des Gehirns durch eine Kraniotomie.
   2. Befestigen Platten (50 x 20 x 6 mm) mit zwei langgestreckten Verankerungslöcher auf beiden Seiten der Befestigungsleiste. Stellen Sie sicher, dass diese Löcher passieren Schrauben mit 6 mm Durchmesser (1A-d). Machen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm vor dem Anschluss für einen Verriegelungshaken (1A-b).
   3. Stellen Sie eine Box mit einem Boden (135 × 305 mm) und die Seitenwände (305 × 76 mm). Bohren Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von 6 mm, wie in 1A (kleines Bild) angezeigt. In Stützmauern auf der Fixationsstange (1A-e).
2. Herstellung des gestaltete Bar und Kasten und montieren jede von ihnen mit Cyanacrylat alsin 1A (kleines Bild) angezeigt. Montieren Sie die Bar an der Box mit Schrauben mit 6 mm Durchmesser. Bewerben Steigung durch Anpassung der Schneckenposition des Stabes für ergonomisches Kopffixierung (1A-Einschub).
   HINWEIS: Bei Mäusen ist die Abmessung des Befestigungsleiste 60 x 20 x 4 mm (aus zwei Schichten besteht aus 2 mm starkem Acrylplatten). Der Port Quadrat der Breite von 8 mm (oben) und 9 x 10 mm (niedriger), wie in 1C gezeigt. Ankerplatten die gleiche Größe von Ratten. Die Box Platte und Seitenwände sind 100 x 72 mm und 100 x 50 mm.

2. Leiter Mounter Bau während der Implantation Chirurgie

ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Zahnacrylharz. Flüssigkeit kann Hautreizungen verursachen. Setzen Sie auf eine Maske und Handschuhe tragen. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich.

1. Vorbereitung vor der Operation
   1. Dich wickeln Sie den Rand des Hafens von der Fixierung bar mit aparaffin Folie, um die Haftung der aufgebrachten Acrylharz zum Stab zu verhindern (siehe 1B und 2A). Bestreichen Sie die Grenze des Hafens durch die Paraffinfilm mit einer dünnen Schicht aus Acrylharz bedeckt.
   2. Gebrauch sterilisiert chirurgische Instrumente. Gründlich zu desinfizieren stereotaktischen Rahmen und seine Umgebung mit 70% Ethylalkohol.
2. Führen stereotaktischen Implantationschirurgie
   1. Betäuben ein Tier durch intraperitoneale Injektion einer Cocktail-Mischung (2 ml / kg) von Ketamin 10 ml (50 mg / ml), 1,5 ml Xylazinhydrochlorid (23,32 mg / ml) und Kochsalzlösung 2,5 ml. Bestätigen Sie, dass das Tier vollständig betäubt und nicht zum Schwanz und Zehen Prisen zu reagieren. Injizieren Cocktail Mischung von 1 ml / kg während Operationen, wenn nötig.
   2. Befestigen Sie das Tier auf den stereotaktischen Apparat. Bewerben Augensalbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Operation zu verhindern. Rasur und reinigen Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol. Geben subkutane Injektion von 2% Lidocain und einzuschneiden SCAlp entlang der Mittellinie des Schädels. Komplett abkratzen Knochenhaut. Spülen mit Kochsalzlösung mehrmals.
   3. Machen Grat Lochbohren in der Nähe des Randes des Schädels. Implantatschrauben 4-5 Umdrehungen (bis zu 1 mm Tiefe) von der Schädeloberfläche, um einen Verstoß gegen die Dura mater zu verhindern. Achten Sie darauf, keine Leckage des CSF und Blut auf der Schädeloberfläche nach dem Schraubenimplantation. Spülen mit Kochsalzlösung und trocknen Sie die Schädeloberfläche mit Lufthauch, vor allem rund um die Schrauben.
   4. Coat Schädeloberfläche mit einer dünnen Schicht von "Dentalkleber (Super-Bond C & B)". Nicht vollständig bedecken die Oberfläche des Schädels einschließlich Bregma wenn zusätzliche Elektrodenimplantation soll. Verwenden Sie das Bregma zum Markieren Kraniotomie Koordinaten. Implant-Elektroden und / oder Microdrive und befestigen Sie es auf dem Schädel, indem Acrylharz um ihn herum.
   5. Gelten zusätzliche Acrylharz auf der Oberseite der Zahnzement. Verwenden Sie geeignete Menge an Acrylharz, um eine ausreichende Füllung-out Raum zwischen stabbeschichtet Harz ein zu verlassend Erstmontage Harz, wenn Fixieren Sie die Schrauben und / oder Elektroden (Abbildung 2A).
3. Legen Sie den Kopf-Fixierung bar 5 mm oder mehr über der Schädeloberfläche und richten ihr Zentrum (2A -Links).
4. Bewerben Acrylharz in den Spalt zwischen der Basis des Schädels und erste Befestigungs Harze. (2A -Center). Warten Sie, bis das Harz hart werden.
5. Entfernen Ohrleiste und ziehen Sie die Formmontagegerät aus der Fixierung bar Anschluss. (2A -Rechts). Zusätzliche Acrylharz sorgfältig gelten rund um die Kantenschienen des Formmontagegerät, wenn nötig.
6. Spülen der Wunde Oberfläche der Kopfhaut mit einer sterilen Kochsalzlösung. Injizieren eines Antibiotikums (Enrofloxacin, 5 mg / kg sc) und ein Schmerzmittel (Butorphanoltartrat, 2 mg / kg sc) unmittelbar nach der Operation. Haus des Tier einzeln in einem Käfig.

3. gewöhnen Tiere an Kopf-Fixierung

Hinweis: Dieser Schritt deritzt Gewöhnungszeitpläne auf der Grundlage empirisch erfolgreiche Einschätzungen Autoren. Für einen Überblick über die Gewöhnung Verfahren zur Kopffixierung, siehe Schwartz ^{10 oder} Guo ¹¹ Arbeit.

1. Geben ausreichende Erholungsphase (eine Woche oder mehr) zu den Tieren. Am Tag 1, Griff Tieren häufig unterteilt kurzen Sitzungen.
2. Am nächsten Tag (Tag 2), setzen das Tier zur Fixierung Umwelt (Kasten). Nicht den Kopf mounter in den Hafen der Fixationsstange einführen. Tiere verlassen, sich an die Umgebung zu bekommen. Sicher greifen die Kopfmontagegerät mit Hand für 1 bis 2 Sekunden und lassen Sie sie sofort. Wiederholen kurzfristige Fixierung von Hand-grab mehrmals.
3. Am Tag 3, zu gewöhnen Tiere Kopf-Fixierung.
   1. Bringen Sie Tiere aus den Käfigen und setzen Sie sie in der Box Regie Köpfe in Richtung des Hafens von der Fixierung bar. Besorgen Sie sich die Kopfmontagegerät und stecken Sie sie in den Hafen der Fixierung bar.
   2. Binden Sie die Montagevorrichtung (TiersKopf) mit dem Verriegelungshaken des Befestigungsleiste mit einem Gummiband. Stehen Sie für 5 min.
      HINWEIS: Berühren Sie nicht den Kofferraum oder Schwanz des Tieres nach der Fixierung, die das Tier führt zu quietschen und Kampf steigenden Tieres Stress. Wenn das Tier weiterhin kämpfen mehr als 1 min, loslassen und versuchen Sie es später. Von diesem Schritt Tieren zeigen, Urin und Kot ausgeschieden, wenn die Fixierung Kopf ausgesetzt, aber diese nach und nach wird so die Gewöhnung Erlös reduziert.
   3. Rufen Sie die Verriegelung Gummiband und Auswerfen der Montagevorrichtung aus dem Hafen. Setzen Sie die Tiere zurück zum Käfig und ein Stück von Getreide oder einen Sonnenblumensamen in den Heimkäfig als Belohnung. Die nächste Verhandlung beginnt in 30 min. Wiederholen 3.4.1 bis 3.4.4 fünf oder mehr innerhalb eines Tages.
4. An Tag 4 bis 7, freizulegen, das Tier, um die Fixierung Kopf in Protokoll 3.4 beschrieben. Schrittweise Erhöhung der Dauer der Kopffixierung (10 min, 20 min, 30 min und 50 min nach Gewöhnung Erlös).
   HINWEIS: Wenn Tiere tun nichtt füttern die Futterbelohnung, kann es ein Zeichen für ein hohes Maß an Stress. Die Fixierung der Zeit erhöhen Sie nicht. Wenn Tiere zeigen wiederholt kämpfen Verhalten, zu gewöhnen sie für einen längeren Zeitraum.
5. Überprüfen Sie das Körpergewicht Tieres täglich. Betrachten erfolglosen Gewöhnung, wenn das Körpergewicht abnimmt. Fahren Sie mit Verhaltensaufgaben mit Kopffixierung nach erfolgreicher Gewöhnung.
   ANMERKUNG: Erfolgreiche Gewöhnung erleichtert spätere Verhaltenstraining (3E und F).

Representative Results

Diese Kopffixierung Verfahren ist auf beiden Ratten und Mäusen. Insgesamt acht Ratten erhielten eine bilaterale Implantation von stimulierenden Elektroden in das mediale Vorderhirnbündel. Für vier von ihnen wurden maßgeschneiderte Wolframdraht-Elektroden (Microdrives) zusätzlich in die M1 forelimb Bereich (2C) implantiert. Für Mäuse (n = 2), vier Edelstahl-Drahtelektroden wurden in frontal / okzipitalen kortikalen Arealen implantiert. Während der Operation wurden Kopf Montagevorrichtungen für Kopf-Fixierung in beiden Ratten und Mäusen geformt, wie beschreiben in Protokoll Abschnitt 2. Nach der Erholung von der Operation, sie im täglichen Sitzungen der Kopffixierung entweder Gewöhnung oder Verhaltensaufgabe ausgesetzt waren. Die Formkopf Montagevorrichtungen blieb bis zum Ende des Experiments (40,5 ± 1,73 (Mittelwert ± Standardabweichung) Tagen für Ratten und 81 ± 5,66 (Mittelwert ± Standardabweichung) Tagen für Mäuse nach der Operation). Die Ratten wurden täglich 40 bis 60 min Kopf-Fixierung während des Verhaltens Aufgabe ausgesetzt ist; Die Mäuse wurden täglich von 20 bis 40 min ausgesetzt werdenverhalten Aufgabe.

Früher verwendete man diese Technik, um Ratten stoß trainieren, und ziehen Sie einen Hebel unter Kopf-Fixierung. Der Lohn war direkte elektrische Stimulation des medialen Vorderhirnbündel. Obwohl es entlockt triebenen Bewegungsverhalten wurde Kopf-Fixierung fest, ohne zufällige mounter Trennung aufrechterhalten wird.

Nach Gewöhnung Andocken des Kopfmontagevorrichtung in die Öffnung des Befestigungsleiste wurde in ein paar Sekunden durch Sperren Gummiband am Haken abgeschlossen. Beim ersten bis zur Kopffixierung eingeführt, präsentiert Tieren kämpfen Verhaltensweisen wie auf der Stelle treten, strecken ihre Beine (3A und B). Solche Verhaltensweisen mit Gewöhnung verringert. Erfolgreiche Gewöhnung bestätigt, dass die Tiere zeigen Nicht mehr kämpfen Verhalten während der Kopf fixiert (3C und D) werden.

Abbildung 1. Design des Kopfbefestigungsleiste.
(A) Komponentennamen der Kopffixierung bar. a) Anschluss; b) Verriegelungshaken; c) Fixierung bar Körpers; d) Verankerungslöcher; e) Stützwand; f) Verankerungsplatte. Konstruktion des Fixierungsfeld in dem Einsatz dargestellt. Zwei Löcher der Seitenwand verwendet werden, um ergonomisch Positionieren des Fixierungs bar. (B) Perspektivische Ansicht ausgelegt Kopffixierung bar für Ratten. Schwarze Pfeile zeigen die Begrenzung abdeckt Paraffinfilmen. (C) Das Design der Anschluss für Kopffixierung bei Mäusen. (Modifiziert aus der Abbildung 1 Roh et al. ⁹⁾ Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Konstruktion mounter Form während der Operation.
(A) Critic al Schritte Formen des Kopfmontagegerät. (Links) Schrauben (T Formen in schwarz) sollte senkrecht zum Schädel (grau) Oberfläche implantiert werden. Eine dünne Schicht von Zahnbefestigungszement (grün) umfasst Schrauben und die Schädeloberfläche. (Center) Nach der Implantation, je nach Versuchszwecke werden zusätzliche Acrylharze (orange) in der Lücke zwischen Ausgangsharz auf den Hafen und Basisharze der Schädeloberfläche beschichtet gefüllt und wird zu einem Teil des Kopfmontagegerät. (Rechts) nach hinzugefügt Acrylharze sind schwer set kann der Kopf-Montagevorrichtung, indem Sie aus dem Hafen freigegeben werden. Solid black Linien zeigen Paraffin Filme. (Modifiziert aus der Abbildung 1 Roh et al. ⁹⁾ (B) Konstruiert Kopf-Montagevorrichtung bei Ratten ist bereit für die Freigabe (nach dem Schritt der A-Center). (CD) Molded Acrylharze als Kopfmontagegerät dient. Nach der Operation immer noch unter Narkose, Tiere aus der Fixierung bar freigegeben. Schwarze Pfeile zeigen Führungsschienen passend zu der Form der Öffnung. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Leiter-Fest Ratte und Maus.
(AB) Werden die Tiere zunächst Befestigungs Kopf ausgesetzt ist, emittieren sie kämpfen Verhalten. (CD) Als Gewöhnung Erlöse, Tiere zeigen geringer kämpfVerhalten und in der Regel setzen sich auf dem Boden des stationären Plattform. (EF) Ergebnis der Verhaltensaufgabe Aufführungen von erfolgreichen (E) und erfolglose (F) Gewöhnung Kopffixierung Umwelt (modifiziert aus 3 von Roh et al. ^9). Reward Zahl umfasst sowohl frei (zur Formgebung) und Eventualverbindlichkeiten Hebel ziehen. In beiden Sitzungen, zeigt unzureichend gewöhnt Ratte schlechte Leistung nur durch zufällige Hebel belohnt zieht aus Nicht-bedingte Verhalten.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53064/53064fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic resin	Lang Dental Manufacturing	Ortho-Jet	to make molded mounter
Paraffin film	Bemis	Parafilm	to prevent adhesion of acrylic resin to the bar
Dental adhesive	Sun Medical	Super-Bond C&B	to bond between acrylic resin and skull
Plexglass or other acrylic plate			to make fixation bar and box platform
Cyanoacrylate			to bond acrylic plates